Summary
La sénescence cellulaire est le facteur clé dans le développement de pathologies chroniques liées à l'âge. L'identification des thérapies qui ciblent les cellules sénescentes s'avère prometteuse pour prolonger le vieillissement sain. Ici, nous présentons un essai nouveau pour l'identification des sénotherapeutics basés sur la mesure de l'activité associée de sénescence de 'Galactosidase dans les cellules simples.
Abstract
La sénescence cellulaire est l'une des caractéristiques du vieillissement connu pour influencer négativement une durée de vie saine. Les médicaments capables de tuer les cellules sénescentes spécifiquement dans la culture cellulaire, appelées sénolytiques, peuvent réduire le fardeau cellulaire sénescent in vivo et prolonger la durée de vie. Plusieurs classes de sénolytiques ont été identifiées à ce jour, y compris les inhibiteurs du HSP90, les inhibiteurs de la famille Bcl-2, la piperlongumine, un peptide inhibiteur FOXO4 et la combinaison de Dasatinib/Quercetin. La détection de SA-A-Gal à un pH lysosomal accru est l'un des marqueurs les mieux caractérisés pour la détection des cellules sénescentes. Mesures cellulaires vivantes de l'activité de la sénescence associée à la sénescence (SA-MD-Gal) à l'aide du substrat fluorescent C12FDG en combinaison avec la détermination du nombre total de cellules à l'aide d'un colorant Hoechst intercalant l'ADN ouvre la possibilité de dépistage des médicaments sénothérapeutiques qui réduisent l'activité globale de SA-A-Gal en tuant les cellules sénescentes (sénolytiques) ou en supprimant le SA-Gal et d'autres phénotypes des cellules sénescentes (sénomorphiques). L'utilisation d'une plate-forme d'acquisition et d'analyse d'images fluorescentes à haute teneur permet le dépistage rapide et à haut débit des bibliothèques de médicaments pour les effets sur sA-MD-Gal, la morphologie cellulaire et le numéro de cellulaire.
Introduction
La sénescence cellulaire a été décrite pour la première fois par Leonard Hayflick et Paul Moorhead, qui ont montré que les cellules normales avaient une capacité limitée à proliférer dans la culture1. Les cellules sénescentes ne prolifèrent pas malgré la présence de nutriments, les facteurs de croissance et le manque d'inhibition du contact, mais restent métaboliquement actives2. Ce phénomène est connu sous le nom de sénescence réplicative et a été principalement attribué au raccourcissement des télomères, au moins dans les cellules humaines3. D'autres études ont montré que les cellules peuvent également être induites à subir la sénescence en réponse à d'autres stimuli, tels que le stress oncogène (sénescence induite par l'oncogène, OIS), les dommages à l'ADN, les médicaments cytotoxiques, ou l'irradiation (sénescence induite par le stress, SIS)4 , 5 Annonces , 6. En réponse aux dommages à l'ADN, y compris l'érosion des télomères, les cellules séneesce, commencent la croissance cellulaire incontrôlée, ou subissent l'apoptose si les dommages ne peuvent pas être réparés. Dans ce cas, la sénescence cellulaire semble être bénéfique car elle agit d'une manière suppressive de tumeur2. En revanche, la sénescence est augmentée avec le vieillissement dû à l'accumulation des dommages cellulaires comprenant des dommages d'ADN. Puisque les cellules sénescentes peuvent sécrétiser des cytokines, des metalloproteinases et des facteurs de croissance, appelés phénotype sécréteur sénieux séniescence-associés (SASP), cette augmentation âge-dépendante de la sénescence cellulaire et sASP contribue à l'homéostasie diminuée de tissu et par la suite le vieillissement. En outre, cette augmentation dépendante de l'âge de la charge de sénescence est connue pour induire des maladies métaboliques, la sensibilité au stress, les syndromes de progeria, et la guérison altérée7,8 et est, en partie, responsable des nombreux âges liés maladies, telles que l'athérosclérose, l'arthrose, la dégénérescence musculaire, la formation d'ulcères, et la maladie d'Alzheimer9,10,11,12,13. L'élimination des cellules sénescentes peut aider à prévenir ou retarder le dysfonctionnement des tissus et à prolonger l'étendue de la santé14. Cela a été démontré dans les modèles de souris transgéniques14,15,16 ainsi qu'en utilisant des médicaments sénolytiques et des combinaisons de médicaments qui ont été découverts à la fois par les efforts de dépistage des médicaments et l'analyse bioinformatique de voies induites spécifiquement dans les cellules sénescentes17,18,19,20,21,22. L'identification de médicaments sénothérapeutiques plus optimaux, capables de réduire plus efficacement le fardeau cellulaire sénescent, est une prochaine étape importante dans le développement d'approches thérapeutiques pour le vieillissement en santé.
Les cellules sénescentes présentent des caractéristiques phénotypiques et moléculaires, tant en culture qu'in vivo. Ces marqueurs de sénescence pourraient être la cause ou le résultat de l'induction de sénescence ou un sous-produit des changements moléculaires dans ces cellules. Cependant, aucun marqueur unique n'est trouvé spécifiquement dans les cellules sénescentes. À l'heure actuelle, la détection de la sénescence associée à la sénescence est l'une des méthodes à base de cellules individuelles les mieux caractérisées et établies pour mesurer la sénescence in vitro et in vivo. SA-Gal est une hydrolase lysosomale avec une activité enzymatique optimale au pH 4. La mesure de son activité au pH 6 est possible parce que les cellules sénescentes montrent une activité lysosomale accrue23,24. Pour les cellules vivantes, l'augmentation du pH lysosomal est obtenue par alcalinisation lysosomale avec l'inhibiteur vacuolar H -ATPase Bafilomycin A1 ou l'inhibiteur de l'acidification endosomal chloroquine25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-MD-D-galactopyranoside (C12FDG) est utilisé comme substrat dans les cellules vivantes car il conserve le produit clivé dans les cellules en raison de sa moiétologie lipophile de 12 carbone25. Fait important, l'activité de SA--Gal elle-même n'est pas directement liée à une voie identifiée dans les cellules sénescentes et n'est pas nécessaire pour induire la sénescence. Avec cet analyse, les cellules sénescentes peuvent être identifiées même dans les populations hétérogènes de cellules et les tissus vieillissants, tels que des biopsies de peau des individus plus âgés. Il a également été utilisé pour montrer une corrélation entre la sénescence cellulaire et le vieillissement23 car il est un marqueur fiable pour la détection des cellules sénescentes dans plusieurs organismes et les conditions27,28,29, 30. Ici, un test de dépistage à haut débit SA-M-Gal basé sur le substrat fluorescent C12FDG à l'aide de fibroblastes embryonnaires de souris primaires (MEFs) avec une sénescence cellulaire induite par le stress solidement oxydatif est décrit et ses avantages et inconvénients sont discutés. Bien que cet analyse puisse être effectué avec différents types de cellules, l'utilisation d'Ercc1-déficient, MEFs altérés de réparation d'ADN permet l'induction plus rapide de la sénescence dans des conditions de stress oxydatif. Chez la souris, l'expression réduite de l'endodocléère d'ENdonuclease d'ADN ERCC1-XPF cause la réparation altérée d'ADN, l'accumulation accélérée des dommages endogènes d'ADN, le ROS élevé, le dysfonctionnement mitochondrique, le fardeau sénescent accru de cellules, la perte de fonction de cellules souches et vieillissement prématuré, semblable au vieillissement naturel31,32. De même, Ercc1-déficients MEFs subissent une sénescence plus rapide dans la culture17. Une caractéristique importante de l'exemple sénescent MEF est que chaque puits a un mélange de cellules sénescentes et non-sénescentes, permettant la démonstration claire des effets sénescents de cellules spécifiques. Cependant, bien que nous croyons que l'utilisation du stress oxydatif dans les cellules primaires pour induire la sénescence est plus physiologique, cet essai peut également être employé avec des lignes cellulaires où la sénescence est induite avec des agents dommageables d'ADN comme l'étoposide ou l'irradiation.
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Protocol
L'utilisation des animaux a été approuvée par le Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Génération de fibroblaste sénescent embryonnaire murine (MEF) - 12-15 jours
- Isoler le type sauvage et Ercc1-/- MEFs des souris femelles enceintes au jour embryonnaire 13 (E13) comme décrit précédemment33.
REMARQUE : Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte de culture tissulaire dans des conditions aseptiques et à l'aide d'instruments stériles. - Reséquez la tête de l'embryon au-dessus des yeux.
- Enlever le tissu rouge (coeur et foie) et les utiliser pour le génotypage si nécessaire.
- Préparer 500 ml d'un mélange de 1:1 de dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) et de Ham's F10 avec 10% de sérum bovin fœtal, 1x acides aminés non essentiels, pénicilline et streptomycine comme milieu de croissance et réchauffez-le jusqu'à 37 oC pendant environ 15 minutes avant chaque utilisation. Stocker le milieu de croissance à 4 oC.
- Incuber le reste de l'embryon avec 0,25% de trypsine/EDTA pendant 10 min.
- Émincer l'embryon en morceaux de 1 mm et pipette le tissu de haut en bas à plusieurs reprises.
- Ajouter 10 ml de tissus moyens de croissance et de plaque d'un embryon par plaque de culture cellulaire de 10 cm de diamètre (passage 0).
- Cultiver les cellules à 37 oC, 3 % O2, 5 % CO2.
REMARQUE : Seules les cellules MEF se fixent aux plaques de culture tissulaire non enduites dans ces conditions. - Changer de milieu tous les jours dans le passage 0 pour enlever les tissus non attachés et les fragments de cellules.
REMARQUE : Selon la taille de l'embryon et la qualité de l'isolement, la cellule atteint habituellement la confluence après 2 à 3 jours. - Trypsinisation
- Enlever soigneusement le milieu de croissance et laver les cellules avec 10 ml de 1x PBS deux fois.
- Ajouter 2 ml d'une solution trypsine/EDTA de 0,025 % aux cellules dans des plaques de 10 cm de diamètre et incuber à 37 oC pendant 2 à 3 min.
- Assurez-vous que les cellules sont détachées de la surface en inspectant les cellules sous le microscope.
- Terminer la digestion de la trypsine en ajoutant la même quantité de milieu de croissance.
- Transférer les cellules dans un tube conique et des cellules centrifugeuses à 200 x g pendant 3 min et jeter le supernatant.
- Resuspendre soigneusement les cellules dans le milieu de croissance frais, compter les cellules et les semer dans de nouvelles plaques à la densité cellulaire projetée.
- Pour les sous-cultures non sénescentes, les cellules confluents fendues 1:4 et s'étendent pour un autre passage à 3 % O2, 37 oC pour produire plus de cellules (passage 1).
REMARQUE : À ce stade, les cellules peuvent être maintenues en culture ou stockées pour une utilisation ultérieure dans l'azote liquide, dans des cryovials contenant environ 1 million de cellules chacune. Cette étape offre également la possibilité de générer un lot mixte de cellules à partir de différents animaux pour réduire la variabilité provenant de l'analyse animale unique. - Pour induire la sénescence cellulaire, les cellules confluentes de graines fendues du passage 1 à un rapport de 1:4 et les incitent à 20 % O2, 37 oC, 5 % CO2 pendant 3 jours; ces conditions de culture sont atmosphériques pour l'oxygène.
REMARQUE : La culture des cellules et des blastocystes sous des concentrations ambiantes d'oxygène peut élever des marqueurs de sénescence cellulaire spécifiquement quand la réparation de dommages d'ADN est altérée34,35,36. - Répétez cette procédure pour 2 passages de plus.
- Pour surveiller la sénescence cellulaire, mesurez l'augmentation graduelle du diamètre cellulaire et du volume cellulaire pendant chaque étape de trypsinisation à l'aide d'un système avancé de compteur de cellules Coulter.
- Évaluer la réduction de la prolifération cellulaire en déterminé le doublement de la population (PD) à l'aide de l'équation
PDT (t2-t1)/3.32 x (log n2 - log n1)
REMARQUE : Le temps de doublement de la population n'a été utilisé que pour les cellules non sénescentes. - Utilisez un passage précoce de type sauvage ou Ercc1-/- cellules MEF qui ont été maintenues à 3% O2, 37 oC, 5% CO2 comme cellules témoins non-sénescentes.
2. Test de dépistage associé au Senescent - 2-3 jours
- Préparer des solutions de stock de 10 mM dans DMSO de tous les médicaments à tester et stocker les aliquots à -80 oC. Ne pas geler-dégeler les solutions de stock car cela peut diminuer l'activité des médicaments.
REMARQUE: Ici, l'inhibiteur HSP90 17DMAG a été utilisé comme un médicament sénolytique capable de tuer spécifiquement les cellules sénescentes17. - Le jour de l'expérience dégeler l'aliquot, diluer les médicaments dans le milieu de culture frais et ajouter aux cellules contenant le milieu conditionné à un rapport de 1:1 pour produire la concentration finale dans le milieu de croissance.
- Utilisez des plaques de prédilution de 96 puits pour les dilutions en série et les combinaisons de médicaments.
REMARQUE : Pour les cellules MEF, il a été empiriquement déterminé que les concentrations de DMSO ne devraient pas dépasser 2% et les cellules témoins traitées avec les concentrations les plus élevées de DMSO utilisées devraient être incluses dans chaque course. - Graines 5 x 103 cellules sénescentes ou 3 x 103 cellules non sénescentes par puits dans 96 plaques de puits d'au moins 6 h avant le traitement dans 100 l de milieu de croissance et incuber à 20% O2, 37 oC, 5% CO2.
REMARQUE : Les cellules doivent être environ 80 % de confluents avant le traitement. - Utilisez la culture de tissu de mur noir/fond clair, traité 96 plaques de puits pour réduire au minimum le crosstalk et le fond fluorescents de signal.
REMARQUE : Cependant, des plaques claires ont également été testées avec succès. - Ajouter les dilutions de médicaments aux cellules MEF et couver pendant 24 h à 48 h sous 20% O2, 37 oC, 5% CO2 conditions.
- Maintenir les cellules non sénescentes sous 3 % O2, 37 oC, 5 % co2.
- Pour l'alcalinisation lysosomique, préparer une solution de 10 mM de bafilomycine A1, aliquot et garder congelé à -20 oC.
- Pour l'analyse de la fluorescence de l'activité SA-MD-Gal, préparez une solution de stock FDG de 2 mM C12,entreposez-le à -20 oC et protégez-vous de la lumière.
- Pour la solution de travail, préparez 100 M C12FDG en milieu de croissance le jour de l'expérience.
REMARQUE : Toutes les étapes (d'incubation) impliquant C12FDG doivent être exécutées dans l'obscurité. - Retirez la solution médicamenteuses et lavez les cellules 1 fois avec 100 l de 1x PBS.
- Induire l'alcalinisation lysosomale en prétraitant les cellules avec 90 oL d'une solution de 100 nM de bafilomycine A1 préparée dans un milieu de culture cellulaire frais pendant 1 heure à 20 % O2, 37 oC, 5 % CO2.
- Ajouter 10 l de 100 M C12FDG solution de travail au milieu de culture (concentration finale 10 M).
- Incuber les cellules pendant 2 h.
- Ajouter 2 oL d'un colorant Hoechst 33342 de 100 g/mL (concentration finale de 2 g/mL) à la culture et incuber pendant 20 min.
- Retirez les supports et ajoutez 100 l de milieu de croissance frais.
3. Analyse quantitative d'image fluorescente à haute teneur
- Utilisez une plate-forme d'acquisition et d'analyse d'images fluorescentes à haute teneur pour acquérir des images fluorescentes des cellules dans les deux canaux appropriés pour la capture de la fluorescence Hoechst et C12FDG (p. ex., préréglages du canal DAPI et FITC, respectivement).
REMARQUE : Les protocoles d'acquisition exigent la définition de plusieurs variables spécifiques à l'assidu. Le but d'un protocole d'acquisition est de capturer un nombre suffisant d'images fluorescentes en cours d'élaboration d'un nombre suffisant de cellules pour l'analyse quantitative en aval. - Élaborer un protocole d'analyse approprié en sélectionnant chaque canal et en définissant, en ajustant un ou plusieurs critères sélectifs, ce qui constitue une caractéristique d'intérêt pour chaque canal.
- Pour le noyau, utiliser ainsi des pré-ensembles de segmentation (p. ex. segmentation nucléaire, segmentation des vésicules, segmentation du cytoplasme) qui permettront d'identifier les organites cellulaires sur la base de multiples critères, y compris la morphologie, la taille et le signal. intensité. Ajuster ces critères pour inclure les noyaux tout en excluant les fragments nucléaires et les débris qui peuvent avoir un signal, mais qui sont, par exemple, trop grands ou trop petits pour être des noyaux.
- Vérifiez le signal dans le canal FITC qui est la fluorescence du C12FDG clivé et représente la quantité d'activité sénescence-associée-galactosidase dans les cellules.
REMARQUE : Les cellules sénescentes ont une activité plus élevée de sénescence-associée à la galactosidase que les cellules non-sénescentes ; cependant, la fluorescence C12FDG sera non discrète et continue, nécessitant l'établissement d'un seuil entre ce qui est considéré comme un C12FDG-positif et une cellule C12FDG-négatif. - À l'aide d'un logiciel d'analyse disponible dans le commerce, générez un nombre de cas où une région définie entourant le noyau (une cellule présumée) s'est chevauchée au moins une fois avec un FDG C12au-dessus du seuil.
REMARQUE : Le logiciel d'analyse génère automatiquement un comptage à l'aide de liens cibles. C'est la définition pratique de l'assidu d'une cellule sénescente, C12FDG-positive.
- Analyser tous les échantillons en tripleavec 3-5 champs par puits et les valeurs moyennes et les écarts types étant calculés en conséquence.
- Calculez le pourcentage de cellules sénescentes à l'aide de la formule suivante :
Cellules sénescentes
(%) x 100
(%) x 1004. Paramètres de validation d'assise
- Pour tous les échantillons, le coefficient intra- et inter-analyse des variations (%CV) a été calculé à l'aide de la formule suivante :
CV intra-assay (n 10 répétitions mesurées
dans une expérience) x 100 (%)
CV d'inter-évaluation (n 5 expériences indépendantes) x 100 (%) - Aux fins du dépistage, déterminer la valeur du Z, un paramètre statistique pour évaluer la qualité d'un essai, à partir de cellules traitées avec 200 nM de rapamycine pendant 24 h à 20 % O2, 37 oC, 5 % CO2 (un contrôle positif pour les médicaments sénothérapeutiques) et non traitée cellules sénescentes (contrôle négatif).
REMARQUE : La valeur de Z a été calculée selon Zhang et coll.37. Les valeurs de Z entre 0,5 et 1 indiquent qu'un test peut être utilisé pour le dépistage des drogues.
dans une expérience) x 100 (%)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'activité de SA--Gal peut être détectée dans les cellules qui sont induites à séneesce par diverses manières de l'épuisement réplicif, le stress génotoxique et oxydatif, à l'activation d'oncogène23,25,38. Dans le modèle actuel utilisant les cellules embryonnaires de fibroblaste d'Ercc1-déficientes de souris, les conditions normoxic de croissance (20% O2) étaient suffisantes pour induire la sénescence cellulaire après les cultiver pendant quelques passages. Les MEF de type sauvage subissent également une sénescence mais nécessitent des passages supplémentaires à 20% O2. La figure 1 montre le flux de travail de l'analyse de dépistage, en commençant par l'isolement des cellules MEF primaires des embryons de souris Ercc1-déficients, à l'induction de la sénescence cellulaire par stress oxydatif, et enfin à l'analyse des données microscopiques obtenu avec un microscope fluorescent à haute teneur. La figure 2 montre des images représentatives de cultures cellulaires MEF contenant des cellules (jeunes) non sénescentes (figure2, à gauche), environ 50 % de cellules sénescentes dans le passage 5 (figure2, au centre), et des cellules sénescentes traitées avec un médicament sénolytique ( Figure 2, à droite). La figure 3A montre des images représentatives pour des analyses quantitatives automatiques et logicielles de cellules sénescentes. La figure 3B démontre l'élimination de l'activité de fond-galactosidase par la bafilomycine-A. La figure 4 montre les résultats possibles des cultures cellulaires sénescentes traitées avec des drogues, y compris l'abattage des cellules sénescentes (sénolytique) et la sénescence modulant (sénomorphique) les médicaments tels que décrits dans Fuhrmann-Stroissnigget al. 17.
Figure 1. Aperçu schématique de l'examen de dépistage et de la chronologie. Les cellules MEF sont isolées chez les souris enceintes et mises sur des plaques de plastique traitées par la culture cellulaire pendant quelques jours pour se développer. Les cellules de passage précoce peuvent être congelées dans de l'azote liquide et peuvent être utilisées pour le dépistage à un moment ultérieur. La sénescence cellulaire est induite par le stress oxydatif par passage à 20% O2 et les cellules sont exposées à des médicaments une fois qu'ils ont atteint un état sénescent robuste. L'analyse des données, y compris le total total et les cellules sénescentes restantes, est effectuée. La chronologie, en jours, indique la durée d'une expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Images représentatives de cellules non sénescentes, sénescentes et sénescentes traitées avec 100 nM du médicament sénolytique 17DMAG. La fluorescence bleue indique la coloration de l'ADN avec Hoechst 33324 tandis que la fluorescence verte indique la coloration DeA-A-Gal avec C12FDG. La coloration vert vif représente les cellules sénescentes positives SA-A-Gal tandis que la coloration faible ou négative de SA-A-Gal représente les cellules faibles ou négatives de SA-Gal, non sénescentes. Veuillez noter que les cellules sénescentes ont généralement une plus grande taille cellulaire et sont aplaties. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Images représentatives d'une culture cellulaire MEF sénescente analysée avec un logiciel commercial. (A) Les cellules positives De SA-A-Gal (SA--Gal) sont décrites en vert (flèches vertes), en négatif SA-A-Gal (SA--Gal-) sont décrites en rouge (flèches rouges). Les panneaux gauche et droit montrent le signal nucléaire (Hoechst) et C12FDG (FITC), respectivement. Seules les zones qui tacinlent positivement pour Hoechst (contiennent un noyau) sont considérées comme des cellules. (B) Une comparaison des cellules traitées et non traitées de Bafilomycin-A. L'activité résiduelle ®-galactosidase présente dans toutes les cellules est réduite par l'acidification lysosomal S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Schéma des résultats possibles du traitement médicamenteux. Les médicaments peuvent avoir des effets différents sur les cellules sénescentes et non sénescentes, y compris tuer les cellules sénescentes (sénolytiques) ou supprimer le phénotype sénémique SA--Gal-Gal (sénomorphiques). Ensemble, ces deux classes sont appelées sénothérapies. Ce chiffre a été modifié à partir de Fuhrmann-Stroissnigget al. 17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
SA-MD-Gal est un biomarqueur bien défini pour la sénescence cellulaire découvert à l'origine par Dimri et al. (1995) montrant que les fibroblastes humains sénescents ont augmenté l'activité de SA-A-Gal lorsqu'ils sont évalués au pH 623 par rapport aux cellules proliférantes. Pendant ce temps, l'analyse in vitro et in vivo pour SA--Gal ont été établis pour différents types de cellules et de tissus25,39,40. La méthode à cellule unique basée sur la fluorescence pour mesurer le SA-MD-Gal dans les cellules vivantes décrite dans ce protocole est un excellent outil de dépistage primaire des médicaments influençant la sénescence cellulaire17. Cependant, bien que SA-MD-Gal soit considéré comme l'un des marqueurs les plus pratiques pour la détection des cellules sénescentes, des marqueurs supplémentaires pour la sénescence cellulaire comme la détection des régulateurs de cycle cellulaire p16Ink4A et p2141, la sénescence associée protéines phénotype sécrétrices (SASP) comme IL-6, TNF, HMGB1 et NF-B42, marqueurs de réparation de dommages à l'ADN comme les foci associés aux dommages à l'ADN (TAF)43,44, la sénescence associée à l'hétérocropathie foci ( SAHF) 45ou marqueurs morphologiques de base comme la taille des cellules et la granularité doivent être en place comme essais de confirmation pour assurer le potentiel sénothérapeutique des médicaments40. Puisque la transition d'une cellule normale dans une cellule sénescente est un processus lent, l'étape critique dans cette méthode est de trouver le seuil qui distingue entre C12FDG positif (sénescent) et négatif (normal) cellules. Cela doit être déterminé empiriquement pour chaque type de cellule et c12FDG contrôles positifs et négatifs doivent être inclus dans chaque expérience.
En plus des Ercc1oxydatifs-stressés-/- MEFs, cette méthode peut être modifiée pour d'autres types de cellules adhérentes. Les cellules souches ercc1-déficientes oxidatives ercc1-déficientes (MSCs) et les cellules IMR90 humaines traitées par etoposide ont déjà été testées avec succès dans l'essai et peuvent être employées pour dépister des drogues17. Cependant, les temps pour induire la sénescence ainsi que les temps et les concentrations de traitement de drogue peuvent varier.
La principale limitation de cette technique est que l'activité de SA--Gal s'est avérée augmenter sous certaines conditions sénescent-indépendantes telles que l'inhibition de contact cellulaire ou la confluence cellulaire élevée46,47. Les zones contenant des « tas cellulaires » et des cultures cellulaires contenant des cellules plus confluentes peuvent facilement être déterminées et devraient être exclues des analyses. En outre, la coloration de fond des vésicules fluorescentes fluorescentes vertes de lipofuscin augmentée dans les cellules sénescentes peut se produire. Dans les cultures sénescentes de cellules de MEF elles sont négligeables en raison de la luminosité de C12FDG mais devraient être examinées pour chaque type de cellule46. La coloration hoechst de l'ADN habituellement ne mène pas à la coloration de fond. Certains anneaux de phénol contenant des médicaments, cependant, pourrait être fluorescent dans la lumière UV. L'augmentation de la taille d'exclusion du signal de fluorescence positif UV jusqu'à la taille des noyaux cellulaires réels pourrait aider à prévenir la détection non désirée de ces médicaments.
La caractéristique la plus importante de l'effort décrit est le fait que les cellules sénescentes aussi bien que non-sénescentes sont trouvées dans le même environnement, permettant l'évaluation des effets de drogue sur les cellules sénescentes et non-sénescentes simultanément. La détection du nombre total de cellules en comptant les noyaux cellulaires donne une première indication sur le potentiel de mise à mort cellulaire d'une drogue. Une diminution du nombre de cellules et de la sénescence cellulaire laisse généralement entrevoir des médicaments sénolytiques, alors qu'un nombre constant de cellules avec un nombre réduit de cellules sénescentes indique habituellement des médicaments sénomorphes. En raison du temps d'incubation des médicaments court, des effets comme la prolifération simultanée des cellules non sénescentes et la mort cellulaire des cellules sénescentes conduisant à un nombre de cellules constants (p. ex., effet sénolytique avec résultat sénomorphique) ne peuvent être exclus, mais sont considérés comme peu probable.
Les applications futures de cette technique comprennent la possibilité d'intégrer d'autres marqueurs de cellules vivantes (p. ex., marqueur d'apoptose comme AnnexinV et 7AAD40) ou des marqueurs pour différents compartiments intracellulaires comme les mitochondries ou les lysosomes dans le système d'assay. La surveillance concomitante de SA-MD-Gal et d'autres marqueurs cellulaires pendant le traitement médicamenteux peut aider à élucider le mécanisme cellulaire sous-jacent.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par LES subventions des NIH AG043376 (Projet 2 et Core A, PDR; Projet 1 et Core B, LJN) et AG056278 (Projet 3 et Core A, PDR; et Projet 2, LJN) et une subvention de la Glenn Foundation (LJN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
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