Summary
Cellular senescence er nøkkelen faktor i utviklingen av kroniske alder-relaterte patologi. Identifisering av legemiddel selskap som mål senescent celler viser løftet for å forlenge sunn aldring. Her presenterer vi en roman analysen til skjermen for identifisering av senotherapeutics basert på måling av senescence knyttet β-Galaktosidase aktivitet i enkeltceller.
Abstract
Cell senescence er et av kjennetegnene på aldring kjent for å negativt påvirke en sunn levetid. Narkotika i stand til å drepe senescent celler spesielt i cellekultur, betegnet senolytics, kan redusere senescent celle byrden i vivo og forlenge healthspan. Flere klasser av senolytics har blitt identifisert hittil inkludert HSP90 hemmere, BCL-2 familie hemmere, piperlongumin, en FOXO4 hemmende peptid og kombinasjonen av dasatinib/quercetin. Påvisning av SA-β-gal ved økt lysosomal pH er en av de beste karakterisert markører for påvisning av senescent celler. Live celle målinger av senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjelp av fluorescerende substrat C12FDG i kombinasjon med fastsettelse av det totale celle tallet ved hjelp av en DNA interkalering Hoechst Dye åpner muligheten til å skjermen for senotherapeutic medikamenter som enten redusere total SA-β-gal aktivitet ved å drepe av senescent celler (senolytics) eller ved å undertrykke SA-β-gal og andre fenotyper av senescent celler (senomorphics). Bruk av et høyt innhold fluorescerende bildeoppkjøp og analyseplattform gjør det mulig for rask, høy gjennomstrømming screening av stoffet bibliotekene for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.
Introduction
Cellular senescence ble beskrevet for første gang av Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste at normale celler hadde en begrenset evne til å spre i kultur1. Senescent celler ikke sprer seg til tross for tilstedeværelsen av næringsstoffer, vekstfaktorer og mangel på kontakt hemming, men forblir metabolically aktiv2. Dette fenomenet er kjent som replicative senescence og ble hovedsakelig tilskrevet telomere forkortelse, i hvert fall i humane celler3. Videre studier har vist at celler kan også bli overtalt til å gjennomgå senescence som svar på andre stimuli, slik som kreftfremkallende stress (diagnostisk indusert senescence, OIS), DNA skade, cytotoksisk narkotika, eller bestråling (stress indusert senescence, SIS)4 , 5 andre priser , 6. som svar på DNA-skade, inkludert telomere erosjon, celler enten senesce, starte ukontrollert cellevekst, eller gjennomgå apoptose Hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfellet, celle senescence synes å være gunstig som det fungerer i en svulst undertrykkende måte2. I kontrast er senescence økt med aldring på grunn av akkumulering av cellulære skader inkludert DNA skade. Siden senescent celler kan skille cytokiner, metalloproteinases og vekstfaktorer, kalt senescence-assosiert sekretoriske fenotype (SASP), denne Aldersavhengige økningen i mobilnettet senescence og SASP bidrar til redusert vev homeostase og senere aldring. Også denne Aldersavhengige økningen i senescence byrde er kjent for å indusere metabolske sykdommer, stress følsomhet, progeria syndromer og svekket helbredelse7,8 og er, delvis, ansvarlig for de mange alder-relaterte sykdommer, slik som aterosklerose, artrose, muskel degenerasjon, sårdannelse, og Alzheimers sykdom9,10,11,12,13. Eliminere senescent celler kan bidra til å forebygge eller forsinke vevs dysfunksjon og forlenge healthspan14. Dette har blitt vist i transgene Mouse-modellene14,15,16 , så vel som ved å bruke senolytic legemidler og legemiddel kombinasjoner som ble oppdaget gjennom både narkotika screening og Bioinformatic analyse av trasé indusert spesielt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identifisere mer optimal senotherapeutic narkotika, i stand til å mer effektivt redusere senescent celle byrde, er et viktig neste skritt i utviklingen av terapeutiske tilnærminger for sunn aldring.
Senescent celler viser karakteristiske fenotypiske og molekylære trekk, både i kultur og in vivo. Disse senescence markører kan være enten årsaken eller resultatet av senescence induksjon eller et biprodukt av molekylære endringer i disse cellene. Men ingen enkelt markør er funnet spesielt i senescent celler. Foreløpig er senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) deteksjon en av de beste-karakterisert og etablerte single-celle baserte metoder for å måle senescence in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomal Hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling av sin aktivitet ved pH 6 er mulig fordi senescent celler viser økt lysosomal aktivitet23,24. For levende celler, økt lysosomal pH oppnås ved lysosomal alkalinization med vacuolar H+-ATPase inhibitor Bafilomycin a1 eller endosomal forsuring inhibitor Chloroquine25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid (C12FDG) brukes som substrat i levende celler som den beholder kløyvde produkt i cellene på grunn av sin 12 karbon lipofile moiety25. Viktigere, SA-β-gal aktivitet i seg selv er ikke direkte forbundet med noen sti identifisert i senescent celler og er ikke nødvendig å indusere senescence. Med denne analysen, kan senescent celler identifiseres selv i heterogene celle populasjoner og aldring vev, slik som huden biopsier fra eldre individer. Det har også blitt brukt til å vise en sammenheng mellom celle senescence og aldring23 som det er en pålitelig markør for senescent celle deteksjon i flere organismer og betingelser27,28,29, 30i det. Her, en høy gjennomstrømning SA-β-gal screening analysen basert på fluorescerende substrat C12FDG hjelp primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) med robust oksidativt stress indusert celle senescence er beskrevet og dens fordeler og ulemper diskuteres. Selv om denne analysen kan utføres med ulike celletyper, bruk av Ercc1-mangelfull, DNA reparasjon svekket MEFs muliggjør raskere induksjon av senescence under forhold med oksidativt stress. I mus, redusert uttrykk for DNA-reparasjon endonuclease ERCC1-XPF forårsaker nedsatt DNA-reparasjon, akselerert opphopning av endogene DNA skade, forhøyet ROS, mitokondrie dysfunksjon, økt senescent celle byrde, tap av stilk cellen funksjon og prematur aldring, i likhet med naturlig aldring31,32. Tilsvarende Ercc1-mangelfull MEFs gjennomgår senescence raskere i kultur17. En viktig funksjon i senescent MEF analysen er at hver brønn har en blanding av senescent og ikke-senescent celler, slik at for den klare demonstrasjon av senescent celle-spesifikke effekter. Men selv om vi tror at bruk av oksidativt stress i primær celler for å indusere senescence er mer fysiologiske, denne analysen også kan brukes med cellelinjer der senescence er indusert med DNA skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal bruk ble godkjent av Scripps Florida institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. generering av senescent murine embryonale Fibroblast (MEF) – 12-15 dager
- Isolere vill type og Ercc1-/- MEFs fra gravide kvinnelige mus på embryonale dag 13 (E13) som beskrevet tidligere33.
Merk: alle følgende trinn utføres i en vevs kultur hette under aseptisk forhold og ved bruk av sterile instrumenter. - Resect embryo hodet over øynene.
- Fjern det røde vevet (hjerte og lever) og bruk dem for genotyperingteknologi om nødvendig.
- Forbered 500 mL av en 1:1 blanding av Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) og ham ' s F10 med 10% fosterets storfe serum, 1x unødvendige aminosyrer, penicillin og Streptomycin som vekst medium og varm den opp til 37 ° c for rundt 15 min før hver bruk. Lagre vekstmedium ved 4 ° c.
- Ruge resten av fosteret med 0,25% Trypsin/EDTA for 10 min.
- Hakke embryo i 1 mm stykker og pipette vevet opp og ned flere ganger.
- Tilsett 10 mL vekstmedium og plate vev av ett embryo per 10 cm diameter cellekultur plate (passasje 0).
- Dyrke celler ved 37 ° c, 3% O2,5% co2.
Merk: bare MEF-celler festes til ikke-belagte vevs kultur plater under disse forholdene. - Bytt medium hver dag i passasje 0 for å fjerne ikke-festet vev og celle fragmenter.
Merk: avhengig av størrelsen på fosteret og kvaliteten på isolasjonen, cellen vanligvis nå confluency etter 2 til 3 dager. - Trypsinization
- Fjern forsiktig vekst mediet og vask cellene med 10 mL 1x PBS to ganger.
- Tilsett 2 mL av en 0,025% Trypsin/EDTA løsning til celler i 10 cm diameter plater og ruge ved 37 ° c for 2-3 min.
- Sørg for at cellene er løsrevet fra overflaten ved å inspisere cellene under mikroskopet.
- Avslutte Trypsin fordøyelsen ved å legge samme mengde vekstmedium.
- Overfør cellene til et konisk rør og sentrifuge celler ved 200 x g i 3 min og kast supernatanten.
- Resuspend celler nøye i frisk vekstmedium, telle celler og frø dem i nye plater på anslått celle tetthet.
- For ikke-senescent sub dyrking delt confluent celler 1:4 og forlenge for en annen passasje på 3% O2, 37 ° c til yield flere celler (passasje 1).
Merk: på dette punktet cellene kan enten opprettholdes i kultur eller lagres for senere bruk i flytende nitrogen, i cryovials inneholder ca 1 000 000 celler hver. Dette trinnet gir også muligheten til å generere en blandet gruppe av celler fra forskjellige dyr for å redusere variasjon som kommer fra ett dyr analyse. - For å indusere celle senescence, frø splitte confluent celler fra passasje 1 i forholdet 1:4 og ruge dem ved 20% O2, 37 ° c, 5% co2 for 3 dager; disse kultur forholdene er atmosfæriske for oksygen.
Merk: dyrking av celler og blastocysts under ambient oksygen konsentrasjoner kan heve markører for mobilnettet senescence spesielt når DNA skade reparasjon er svekket34,35,36. - Gjenta denne fremgangsmåten for to flere avsnitt.
- Å dataskjerm Cellular senescence, mål det gradvis forhøye inne cellen diameter og cellen kvantum i løpet av hver trypsinization steg benytter en avansert Coulter cellen telleren system.
- Vurdere reduksjonen i celle spredning ved fastsettelse av befolknings dobling (PD) ved hjelp av ligningen
PDT = (t2-t1)/3,32 x (Logg n2 – Logg n1)
Merk: befolkning dobling tid ble bare brukt for ikke-senescent celler. - Bruk tidlig passasje vill-type eller Ercc1-/- MEF celler som ble holdt på 3% O2, 37 ° c, 5% co2 som ikke-senescent kontroll celler.
2. senescent tilknyttet β-gal screening analysen-2-3 dager
- Forbered 10 mM lager løsninger i DMSO av alle legemidler som skal testes og oppbevares alikvoter ved-80 ° c. Ikke Frys-tine lager løsninger som dette kan redusere aktiviteten av narkotika.
Merk: her, den HSP90 inhibitor 17DMAG ble brukt som en senolytic narkotika i stand til spesielt å drepe senescent celler17. - På dagen for eksperimentet tine alikvot, fortynne narkotika i fersk kultur medium og legge til cellene som inneholder betinget medium på et 1:1 forhold til å gi den endelige konsentrasjonen i vekstmedium.
- Bruk 96-plater for serie fortynninger og legemiddel kombinasjoner.
Merk: for MEF celler, ble det empirisk fastslått at DMSO-konsentrasjoner ikke bør overstige 2% og kontroll celler behandlet med høyeste DMSO-konsentrasjoner som brukes bør inkluderes i hver kjøring. - Seed 5 x 103 senescent celler eller 3 x 103 ikke-senescent celler per brønn i 96 brønn plater minst 6 h før behandling i 100 μL av vekstmedium og ruge ved 20% O2, 37 ° c, 5% co2.
Merk: celler bør være ca 80% confluent før behandling. - Bruk svart vegg/klart bunn vev kultur, behandlet 96 brønn plater for å minimere fluorescerende signal crosstalk og bakgrunn.
Merk: imidlertid har klare plater også blitt testet med suksess. - Legg stoffet fortynninger til MEF celler og ruge for 24 h til 48 t under 20% O2, 37 ° c, 5% co2 betingelser.
- Hold ikke-senescent celler under 3% O2, 37 ° c, 5% co2 betingelser.
- For lysosomal alkalinization, Forbered en 10 mM bafilomycin a1-løsning, alikvot og hold frosset ved-20 ° c.
- For fluorescens analyse av SA-β-gal aktivitet, utarbeide en 2 mM C12FDG lagerløsning, lagre ved-20 ° c, og beskytte mot lys.
- For arbeids løsningen, klargjør 100 μM C12FDG i vekstmedium på dagen for eksperimentet.
Merk: alle (inkubasjons) trinn som involverer C12FDG bør utføres i mørket. - Fjern medikament løsningen og vask cellene 1 gang med 100 μL av 1x PBS.
- Indusere lysosomal alkalinization av pretreating celler med 90 μL av en 100 nM bafilomycin a1 løsning fremstilt i fersk cellekultur medium for 1 time ved 20% O2, 37 ° c, 5% co2.
- Tilsett 10 μL av 100 μM C12FDG arbeids løsning på kultur mediet (siste konsentrasjon 10 μM).
- Ruge celler for 2 t.
- Tilsett 2 μL av en 100 μg/mL Hoechst 33342 fargestoff (siste konsentrasjon 2 μg/mL) til kultur-og ruge i 20 min.
- Fjern Media og tilsett 100 μL av frisk vekstmedium.
3. kvantitativ høyt innhold fluorescerende bildeanalyse
- Bruk et høyt innhold fluorescerende bildeoppkjøp og analyseplattform for å erverve fluorescerende bilder av cellene i de to kanalene som passer for fangst av Hoechst og C12FDG fluorescens (f. eks DAPI og FITC kanal forhåndsinnstillinger, henholdsvis).
Merk: anskaffelses protokoller krever definisjonen av flere variabler som er spesifikke for analysen. Formålet med en anskaffelses protokoll er å fange et tilstrekkelig antall i fokus fluorescerende bilder av tilstrekkelig antall celler for nedstrøms kvantitativ analyse. - Utvikle en hensiktsmessig analyse protokoll ved å velge hver kanal og definere, ved å justere ett eller flere selektive kriterier, hva som kvalifiserer som en funksjon av interesse for hver kanal.
- For kjernen, bruk så segmentering pre-sett (f. eks kjernefysiske segmentering, vesicle segmentering, cytoplasma segmentering) som vil tillate identifisering av mobilnettet organeller på grunnlag av flere kriterier, inkludert morfologi, størrelse og signal Intensitet. Juster disse kriteriene for å inkludere kjerner mens du ekskluderer kjernefysiske fragmenter og rusk som kan ha et signal, men som for eksempel er for store eller for små til å være kjerner.
- Kontroller signalet i FITC-kanalen som er fluorescens fra kløyvde C12FDG og representerer mengden senescence-assosiert β-galaktosidase aktivitet i cellene.
Merk: senescent celler har en høyere senescence-assosiert β-galaktosidase aktivitet enn ikke-senescent celler; men C12FDG fluorescens vil være ikke-diskret og kontinuerlig, nødvendiggjør etablering av en terskel mellom det som regnes som en c12FDG-positive og en C12FDG-negativ celle. - Ved hjelp av kommersielt tilgjengelig analytisk programvare, generere en telling av tilfeller der et definert område rundt kjernen (en Presumptive celle) har overlappet minst en gang med en over-terskel C12FDG.
Merk: den analytiske programvaren genererer automatisk en telling ved hjelp av mål kobling. Dette er analysen praktiske definisjonen av en senescent, C12FDG-positive celle.
- Analysere alle prøvene i tre eksemplarer med 3-5 felt per brønn og middelverdi og standardavvik som beregnes tilsvarende.
- Beregn prosentandelen av senescent celler ved hjelp av følgende formel:
Senescent celler (%) =
x 100
x 1004. parametere for analyse validering
- For alle prøvene intra-og inter-analysen koeffisient av variasjoner (% CVs) ble beregnet ved hjelp av følgende formel:
Intern analyse CV (n = 10 repetisjoner målt i ett eksperiment) =
x 100 (%)
Mellom analyse CV (n = 5 uavhengige eksperimenter) = x 100 (%) - For screening formål, bestemme Z ' verdi, en statistisk parameter for å evaluere kvaliteten på en analyse, fra celler behandlet med 200 nM Rapamycin for 24 h ved 20% O2, 37 ° c, 5% co2 (en positiv kontroll for senotherapeutic narkotika) og ubehandlet senescent celler (negativ kontroll).
Merk: Z-verdien ble beregnet i henhold til Zhang et al.37. Z ' verdier mellom 0,5 og 1 tyder på at en analyse kan brukes til narkotika screening.
x 100 (%)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SA-β-gal aktivitet kan oppdages i celler som er indusert for å senesce av ulike måter fra replicative utmattelse, gentoksisk og oksidativt stress, til diagnostisk aktivisering23,38. I dagens modell med Ercc1-mangelfull mus embryonale Fibroblast celler, normoxic vekstforhold (20% O2) var tilstrekkelig til å indusere celle senescence etter dyrking av dem for et par passasjer. Wild type MEFs også gjennomgå senescence men krever ytterligere passasjer på 20% O2. Figur 1 viser arbeidsflyten av screening analysen starter med isolering av primære MEF celler fra Ercc1-mangelfull mus embryo, til induksjon av celle senescence av oksidativt stress, og til slutt til analyse av mikroskopiske data med et høyt innhold fluorescerende mikroskop. Figur 2 viser representative bilder av MEF cellekulturer som inneholder ikke-senescent (unge) celler (figur 2, venstre), ca 50% senescent celler i passasje 5 (figur 2, midten), og senescent celler behandlet med et senolytic medikament ( Figur 2, høyre). Figur 3a viser representative bilder for automatisk, programvare generert kvantitative analyser av senescent celler. Figur 3b demonstrerer eliminering av β-galaktosidase aktivitet ved Bafilomycin-A. Figur 4 viser mulige utfall av senescent cellekulturer behandlet med rusmidler, inkludert senescent celle drap (senolytic) og senescence modulerende (senomorphic) legemidler som beskrevet i Fuhrmann-Stroissnigget al. 17av dem.
Figur 1. Skjematisk oversikt over screening analysen og tidslinjen. MEF celler er isolert fra gravide mus og sette på cellekultur behandlet plast plater for et par dager å utvide. Tidlig passasje celler kan fryses i flytende nitrogen og kan brukes til screening på et senere tidspunkt. Cell senescence er indusert av oksidativt stress ved passasje på 20% O2 og celler er eksponert for narkotika når de har nådd en robust senescent tilstand. Data analyse inkludert totalbeløp og gjenværende senescent celler er utført. Tidslinjen, i dager, angir varigheten til ett eksperiment. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative bilder av ikke-senescent, senescent og senescent celler behandlet med 100 nM av senolytic stoffet 17DMAG. Blå fluorescens indikerer DNA farging med Hoechst 33324 mens grønne fluorescens indikerer SA-β-gal farging med C12FDG. Bright grønne flekker representerer SA-β-gal positive senescent celler mens Dim farging representerer SA-β-gal lav eller negativ, ikke-senescent celler. Vær oppmerksom på at senescent celler vanligvis har større Cellestørrelse og blir slått sammen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative bilder av en senescent MEF cellekultur analysert med kommersiell programvare. (A) sa-β-gal positive celler (sa-β-gal+) celler er skissert i grønt (grønne piler), sa-β-gal negative (sa-β-gal-) er skissert i rødt (røde piler). Venstre og høyre paneler viser kjernefysiske (Hoechst) og C12FDG (FITC) signal, henholdsvis. Bare områder som flekken positivt for Hoechst (inneholder en kjerne) regnes som celler. (B) en sammenligning av Bafilomycin-a behandlet og ubehandlet celler. Gjenværende® galaktosidase aktivitet i alle celler er redusert med lysosomal forsuring Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Ordning av mulige utfall av behandling. Narkotika kan ha ulik effekt på senescent og ikke-senescent celler inkludert drepe senescent celler (senolytics) eller undertrykke SA-β-gal senescent fenotype (senomorphics). Sammen disse to klassene kalles senotherapeutics. Dette tallet har blitt modifisert fra Fuhrmann-Stroissnigget al. 17. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SA-β-gal er en veldefinert biomarkør for mobilnettet senescence opprinnelig oppdaget av Dimri et al. (1995) viser at senescent menneskelige fibroblaster har økt aktivitet av SA-β-gal når analyseres ved pH 623 sammenlignet med voksende celler. I mellomtiden, in vitro og in vivo-analysen for sa-β-gal har blitt etablert for ulike celletyper og vev25,39,40. Den fluorescens basert enkelt celle metode for å måle SA-β-gal i levende celler beskrevet i denne protokollen er en utmerket primær screening verktøy for legemidler som påvirker celle senescence17. Men selv om SA-β-gal er regnet som en av de mest praktiske markører for senescent celle deteksjon, ekstra markører for mobilnettet senescence som påvisning av celle syklus regulatorer P16Ink4A og P2141, senescence forbundet sekretoriske fenotype (SASP) proteiner som Il-6, TNFα, HMGB1and NF-KB42, DNA skade reparasjon markører som ΥH2Ax og telomere assosiert DNA skade fokus (TAFs)43,44, senescence assosiert heterochromatin fokus ( SAHF) 45eller grunnleggende morfologiske markører som Cellestørrelse og detaljnivå må være på plass som bekreftende analyser for å sikre senotherapeutic potensialet av narkotika40. Siden overgangen fra en vanlig celle til en senescent celle er en langsom prosess, er det kritiske trinnet i denne metoden å finne terskelen som skiller mellom C12FDG positive (senescent) og negative (normale) celler. Dette må bestemmes empirisk for hver celle type og C12FDG positive og negative kontroller må inkluderes i hvert eksperiment.
I tillegg til oksidativt-stresset Ercc1-/- MEFs, denne metoden kan endres for andre tilhenger celletyper. Oksidativt-stresset Ercc1-mangelfull Mesenchymal stamceller (MSCs) og ETOPOSID menneskelige IMR90 celler var allerede vellykket testet i analysen og kan brukes til skjermen for narkotika17. Tider for å indusere senescence samt behandlingstid og konsentrasjoner kan imidlertid variere.
Den store begrensningen av denne teknikken er at sa-β-gal aktivitet har vist å øke under visse senescent-uavhengige forhold slik celle kontakt hemming eller høy Cellular samløpet46,47. Områder som inneholder "celle hauger" og cellekulturer med over confluent celler kan lett fastslås og bør utelukkes fra analysene. I tillegg bakgrunn farging fra grønne Auto fluorescerende lipofuscin blemmer økt i senescent celler kan forekomme. I senescent MEF celler kulturer de er ubetydelige på grunn av lysstyrken på C12FDG men bør undersøkes for hver celle type46. Hoechst farging av DNA fører vanligvis ikke til bakgrunns farging. Noen fenol-ring som inneholder medikamenter, kan imidlertid være fluorescerende i UV-lys. Økning av utelukkelse størrelsen på UV-positive fluorescens signal opp til størrelsen på faktiske cellekjerner kan bidra til å hindre uønsket påvisning av disse stoffene.
Den viktigste funksjonen i den beskrevne analysen er det faktum at senescent så vel som ikke-senescent celler finnes i samme miljø, noe som åpner for vurdering av narkotika effekter på senescent og ikke-senescent celler samtidig. Påvisning av det totale celle tallet ved å telle cellekjerner gir en første indikasjon om celle drapet potensialet i et medikament. En nedgang i celle tall og celle senescence vanligvis hint til senolytic narkotika mens en konstant celle tall med et redusert antall senescent celler indikerer vanligvis senomorphic legemidler. På grunn av det korte stoffet inkubasjonstid, effekter som samtidig spredning av ikke-senescent celler og celle død senescent celler som fører til konstant celle tall (f. eks, senolytic effekt med senomorphic resultat) kan ikke utelukkes, men anses svært Usannsynlig.
Fremtidige anvendelser av denne teknikken inkluderer muligheten til å integrere ytterligere Live celle markører (f. eks, apoptose markør som AnnexinV og 7AAD40) eller markører for forskjellige intracellulære rom som mitokondrier eller lysosomer inn i analysesystem. Samtidig overvåking av SA-β-gal og andre cellulære markører under behandling av legemidler kan bidra til å belyse underliggende cellulære mekanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants AG043376 (prosjekt 2 og Core A, PDR; Prosjekt 1 og Core B, LJN) og AG056278 (prosjekt 3 og Core A, PDR, og prosjekt 2, LJN) og et stipend fra Glenn Foundation (LJN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), Albany NY. 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -C., Hu, M. -L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo? Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
