Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

SA-β-galactosidase-baseret Screenings analyse til identifikation af Senotherapeutiske lægemidler

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/58133
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Molecular Medicine and the Center on Aging, The Scripps Research Institute, 2Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota, 3Institute on the Biology of Aging and Metabolism, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

Cellulær senescens er den vigtigste faktor i udviklingen af kroniske aldersrelaterede patologier. Identifikation af Therapeutics at målrette senescent celler viser løfte om at forlænge sund aldring. Her præsenterer vi en ny analyse til at screene for identifikation af senotherapeutika baseret på måling af senescens associeret β-galactosidase aktivitet i enkeltceller.

Abstract

Celle senescens er en af kendetegnene ved aldring, der er kendt for at have en negativ indflydelse på en sund levetid. Stoffer i stand til at dræbe senescent celler specifikt i cellekultur, kaldet senolytika, kan reducere den senescent celle byrde in vivo og forlænge healthspan. Flere klasser af senolytika er blevet identificeret til dato, herunder HSP90-hæmmere, BCL-2-familie-hæmmere, piperlongumin, et FOXO4 hæmmende peptid og kombinationen af Dasatinib/quercetin. Påvisning af SA-β-gal ved øget lysosomale pH er en af de bedst karakteriserede markører til påvisning af senescent celler. Levende celle målinger af senescens-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjælp af det fluorescerende substrat C12FDG i kombination med bestemmelsen af det samlede celle nummer ved hjælp af et DNA-interkalerende Hoechst-farvestof åbner mulighed for at skærm for senotherapeutiske lægemidler, der enten reducerer den samlede SA-β-gal-aktivitet ved at dræbe senescerende celler (senolytika) eller ved at undertrykke SA-β-gal og andre fænotyper af senescent celler (senomorffer). Brug af et højt indhold fluorescerende billede erhvervelse og analyseplatform giver mulighed for en hurtig, høj gennemstrømning screening af narkotika biblioteker for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.

Introduction

Cellulære gulne året blev beskrevet for første gang af Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste, at normale celler havde en begrænset evne til at formere sig i kultur1. Senescent celler undlader at formere sig på trods af tilstedeværelsen af næringsstoffer, vækstfaktorer og manglende kontakt hæmning, men forbliver metabolisk aktive2. Dette fænomen er kendt som replikerende senescens og blev primært tilskrives telomere, forkortelse, i det mindste i humane celler3. Yderligere undersøgelser har vist, at celler også kan induceres til at gennemgå senescens som reaktion på andre stimuli, såsom onkogen stress (oncogene induceret senescens, OIS), DNA-skade, cytotoksiske lægemidler eller bestråling (stress induceret senescens, SIS)4 , 5 , 6. som reaktion på DNA-skader, herunder telomere, erosion, celler enten senesce, starte ukontrolleret cellevækst, eller gennemgå apoptose, hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfælde, celle senescens synes at være gavnlig, da det virker i en tumor suppressiv måde2. I modsætning hertil øges senescens med aldring på grund af ophobning af cellulære skader, herunder DNA-skader. Da senescent celler kan udskiller cytokiner, metalloproteinaser og vækstfaktorer, betegnet som den senescens-associerede sekretoriske fænotype (SASP), bidrager denne aldersafhængige stigning i cellulær senescens og SASP til nedsat vævs homøostase og efterfølgende ældning. Også denne aldersbetingede stigning i senescens byrden er kendt for at inducere metaboliske sygdomme, stress følsomhed, Progeria syndromer, og forringet helbredelse7,8 og er til dels ansvarlig for de talrige aldersrelaterede sygdomme, såsom åreforkalkning, slidgigt, muskel degeneration, mavesår dannelse, og Alzheimers sygdom9,10,11,12,13. Eliminering af senescent celler kan medvirke til at forebygge eller forsinke vævs dysfunktion og forlænge sociale14. Dette er blevet vist i transgene musemodeller14,15,16 samt ved hjælp af senolytiske lægemidler og narkotika kombinationer, der blev opdaget gennem både Drug screening indsats og bioinformatik analyse af veje induceret specifikt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identificere mere optimale senotherapeutiske lægemidler, i stand til mere effektivt at reducere den senescent celle byrde, er et vigtigt næste skridt i udviklingen af terapeutiske tilgange til sund aldring.

Senescent celler viser karakteristiske fænotypiske og molekylære egenskaber, både i kultur og in vivo. Disse senescens markører kan være enten årsag eller resultat af senescens induktion eller et biprodukt af molekylære ændringer i disse celler. Men, ingen enkelt markør er fundet specifikt i senescent celler. I øjeblikket er gulne året-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) detektion en af de bedst karakteriserede og etablerede enkelt cellebaserede metoder til måling af senescens in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomale hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling af dets aktivitet ved pH 6 er muligt, fordi senescent celler viser øget lysosomale aktivitet23,24. For levende celler opnås øget lysosomale pH ved lysosomale alkalinisering med vakuolær H+-ATPase-hæmmeren bafilomycin a1 eller den endosomale forsurings hæmmer chloroquin25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) anvendes som substrat i levende celler, da det bevarer det spaltet produkt i cellerne på grund af dets 12 Carbon lipofile-delen25. Vigtigere er det, at SA-β-gal-aktiviteten ikke er direkte forbundet med nogen vej, der er identificeret i senescent celler, og at den ikke er nødvendig for at fremkalde en Med denne analyse kan senescent celler identificeres selv i de heterogene cellepopulationer og aldrende væv, såsom hudbiopsier fra ældre individer. Det er også blevet brugt til at vise en sammenhæng mellem celle senescens og aldring23 , da det er en pålidelig markør for senescent celle detektion i flere organismer og betingelser27,28,29, 30. Her beskrives en høj gennemløbs-SA-β-gal-Screenings analyse baseret på det fluorescerende substrat C12FDG ved hjælp af primære mus embryonale fibroblaster (mefs) med robust oxidativ stress induceret celle stabilitet og dens fordele og ulemper drøftes. Selv om denne analyse kan udføres med forskellige celletyper, brugen af Ercc1-mangelfuld, DNA reparation svækket mefs giver mulighed for hurtigere induktion af senescens under forhold af oxidativ stress. I mus medfører reduceret ekspression af DNA-reparationen endonuklease ERCC1-XPF nedsat DNA-reparation, accelereret akkumulering af endogene DNA-skader, forhøjede ROS, mitokondriel dysfunktion, øget senescent celle byrde, tab af stamcelle funktion og for tidlig aldring, svarende til naturlig aldring31,32. På samme måde undergår Ercc1-mangelfulde mef'er en hurtigere senescens i kultur17. Et vigtigt element i den senescent MEF assay er, at hver brønd har en blanding af senescent og ikke-senescent celler, giver mulighed for en klar demonstration af senescent celle-specifikke effekter. Men selv om vi mener, at brugen af oxidativt stress i primære celler til at fremkalde senescens er mere fysiologisk, kan denne analyse også bruges med cellelinjer, hvor senescens induceres med DNA-skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr brug blev godkendt af Scripps Florida institutionel Animal Care og brug udvalg.

1. generering af senescent murine embryonale fibroblast (MEF) – 12-15 dage

  1. Isoler vildtype og Ercc1-/- mefs fra gravide hunmus ved embryo dag 13 (E13) som beskrevet tidligere33.
    Bemærk: alle følgende trin udføres i en vævskultur hætte under aseptiske forhold og ved hjælp af sterile instrumenter.
  2. Embryoets hoved over øjnene.
  3. Fjern det røde væv (hjerte og lever), og brug dem til genotypebestemmelse, hvis det er nødvendigt.
  4. Forbered 500 mL af en 1:1 blanding af Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) og skinke F10 med 10% føtal kvægserum, 1x ikke-essentielle aminosyrer, penicillin og streptomycin som vækstmedium og opvarmer det op til 37 °C i ca. 15 minutter før hver brug. Opbevar vækstmediet ved 4 °C.
  5. Resten af embryonet inkubates med 0,25% trypsin/EDTA i 10 min.
  6. Mince embryonet i 1 mm stykker og pipettere vævet op og ned flere gange.
  7. Tilsæt 10 mL vækstmedium og plade vævene i et embryon pr. cellekultur plade af 10 cm diameter (passage 0).
  8. Dyrker celler ved 37 °C, 3% O2,5% Co2.
    Bemærk: kun MEF-celler binder sig til ikke-coatede vævskultur plader under disse forhold.
  9. Skift medium hver dag i passage 0 for at fjerne ikke-tilknyttede væv og celle fragmenter.
    Bemærk: afhængigt af embryoens størrelse og isolations kvaliteten, når cellen normalt efter 2 til 3 dage.
  10. Trypsinisering
    1. Fjern forsigtigt vækstmediet og vask cellerne med 10 mL 1x PBS to gange.
    2. Der tilsættes 2 mL af en 0,025% trypsin/EDTA-opløsning til cellerne i pladerne med 10 cm diameter og inkubates ved 37 °C i 2-3 min.
    3. Sørg for, at cellerne er løsrevet fra overfladen ved at inspicere cellerne under mikroskopet.
    4. Opsig trypsin-fordøjelsen ved at tilføje den samme mængde vækstmedium.
    5. Cellerne overføres til en konisk slange og centrifuge celler ved 200 x g i 3 min., og supernatanten kasseres.
    6. Resuspendere cellerne omhyggeligt i frisk vækstmedium, tælle celler og frø dem i nye plader ved den projekterede celletæthed.
  11. For ikke-senescent sub dyrkning split flydende celler 1:4 og strække sig til en anden passage ved 3% O2, 37 °c at give flere celler (passage 1).
    Bemærk: på dette tidspunkt kan cellerne enten vedligeholdes i kulturen eller opbevares til senere brug i flydende nitrogen, i cryovials, der indeholder ca. 1.000.000 celler hver. Dette trin giver også mulighed for at generere en blandet batch af celler fra forskellige dyr for at reducere variabilitet, der kommer fra enkelt dyrs analyse.
  12. For at fremkalde celle senescens, frø split flydende celler fra passage 1 i et forhold på 1:4 og inkubere dem ved 20% O2, 37 °c, 5% Co2 for 3 dage; disse dyrkningsbetingelser er atmosfæriske for ilt.
    Bemærk: dyrkning af celler og blastocyster under omgivende iltkoncentrationer kan øge markører for cellulær senescens, specielt når reparation af DNA-skader er svækket34,35,36.
  13. Gentag denne procedure for yderligere 2 passager.
  14. For at overvåge cellulær senescens skal du måle den gradvise stigning i celle diameteren og celle volumenet under hvert trypsinization trin ved hjælp af et avanceret Coulter-celle tæller system.
  15. Vurder reduktionen i celle spredning ved bestemmelse af fordoblingen af populationen (PD) ved hjælp af ligningen
    PDT = (t2-t1)/3,32 x (log n2 – log n1)
    Bemærk: Populationsfordoblings tiden blev kun brugt til ikke-senescent celler.
  16. Brug Early passage Wild-type eller Ercc1-/- MEF celler, der blev holdt ved 3% O2, 37 °c, 5% Co2 som ikke-senescent kontrol celler.

2. senescent associeret β-gal Screenings analyse – 2-3 dage

  1. Forbered 10 mM stamopløsninger i DMSO af alle lægemidler, der skal testes, og opbevar aliquoter ved-80 °C. Må ikke fryse-tø stamopløsninger, da dette kan nedsætte aktiviteten af narkotika.
    Bemærk: her blev HSP90-hæmmeren 17DMAG brugt som et senolytisk stof, der specifikt kunne dræbe senescent celler17.
  2. På dagen for forsøget tø alikvot, fortynde stofferne i frisk kulturmedium og tilsæt til cellerne indeholdende konditioneret medium på et 1:1 ratio for at give den endelige koncentration i vækstmedium.
  3. Brug 96-godt præ-fortyndings plader til serielle fortyndinger og lægemiddelkombinationer.
    Bemærk: for MEF-celler blev det empirisk fastslået, at DMSO-koncentrationer ikke bør overstige 2%, og kontrol celler, der behandles med de højeste DMSO-koncentrationer, bør inkluderes i hver løbetur.
  4. Frø 5 x 103 senescent celler eller 3 x 103 ikke-senescent celler pr brønd i 96 brønd plader mindst 6 h før behandling i 100 μl af vækstmedium og inkubatat ved 20% O2, 37 °c, 5% Co2.
    Bemærk: cellerne bør være omkring 80% konflydende før behandling.
  5. Brug sort væg/klar bund vævskultur, behandlet 96 brønd plader for at minimere fluorescerende signal kryds og baggrund.
    Bemærk: klare plader er dog også blevet afprøvet med succes.
  6. Tilsæt stof fortyndinger til MEF-celler og Inkuber i 24 timer til 48 h under 20% O2, 37 °c, 5% Co2 betingelser.
  7. Hold ikke-senescent celler under 3% O2, 37 °c, 5% Co2 betingelser.
  8. For lysosomale alkalinisering, Forbered en 10 mm bafilomycin a1 opløsning, alikvot og holde frosset ved-20 °c.
  9. For fluorescens analyse af SA-β-gal-aktivitet, Forbered en 2 mM C12FDG stamopløsning, opbevares ved-20 °c og beskyttes mod lys.
  10. For arbejdsopløsningen, Forbered 100 μM C12FDG i vækstmedium på dagen for eksperimentet.
    Bemærk: alle (inkubations) trin, der involverer C12FDG, skal udføres i mørke.
  11. Fjern lægemiddelopløsningen og vask cellerne 1 gang med 100 μL 1x PBS.
  12. Inducerer lysosomale alkalinisering ved at forbehandle celler med 90 μL af en 100 nM bafilomycin a1 opløsning fremstillet i frisk cellekulturmedium i 1 time ved 20% O2, 37 °c, 5% Co2.
  13. Tilsæt 10 μL 100 μM C12FDG-arbejdsopløsning til dyrkningsmediet (slutkoncentration 10 μM).
  14. Inkuber cellerne i 2 timer.
  15. Der tilsættes 2 μL 100 μg/mL Hoechst 33342 farvestof (slutkoncentration 2 μg/mL) til kulturen og Inkuber i 20 min.
  16. Fjern mediet, og tilsæt 100 μL frisk vækstmedium.

3. kvantitativ høj indhold fluorescerende billede analyse

  1. Brug en høj indhold fluorescerende billede erhvervelse og analyseplatform til at erhverve fluorescerende billeder af cellerne i de to kanaler, der er passende til opsamling af Hoechst og C12FDG fluorescens (f. eks DAPI og FITC kanal presets, henholdsvis).
    Bemærk: anskaffelses protokoller kræver definition af flere variabler, der er specifikke for analysen. Formålet med en overtagelses protokol er at indfange et tilstrækkeligt antal fluorescerende billeder i fokus af tilstrækkeligt mange celler til downstream-kvantitativ analyse.
  2. Udarbejd en passende analyse protokol ved at vælge hver kanal og ved at justere et eller flere selektive kriterier definere, hvad der kvalificerer som en funktion af interesse i hver kanal.
    1. For kernen, brug så segmentering præ-sæt (f. eks nuklear segmentering, vesikle segmentering, cytoplasma segmentering), der vil gøre det muligt at identificere cellulære organeller på grundlag af flere kriterier, herunder morfologi, størrelse, og signal Intensitet. Juster disse kriterier til at omfatte kerner, mens de udelukker nukleare fragmenter og snavs, som kan have et signal, men som for eksempel er for store eller for små til at være kerner.
    2. Kontroller signalet i den FITC-kanal, der er fluorescens fra kløvet C12FDG og repræsenterer mængden af senescence-associeret β-galactosidaseaktivitet i cellerne.
      Bemærk: Senescent celler har en højere senescens-associeret β-galactosidaseaktivitet end ikke-senescent celler; C12FDG-fluorescens vil imidlertid være ikke-diskret og kontinuerlig, hvilket nødvendiggør fastsættelsen af en tærskel mellem det, der betragtes som en c12FDG-positiv, og en c12FDG-negativ celle.
    3. Ved hjælp af kommercielt tilgængelig analytisk software genereres en optælling af forekomster, hvor et defineret område omkring kernen (en anstødeligt celle) har overlappet mindst én gang med en over tærskel C12FDG.
      Bemærk: den analytiske software genererer automatisk en optælling ved hjælp af Target Linking. Dette er analysens praktiske definition af en senescent, C12FDG-positiv celle.
  3. Analysér alle prøver i tre eksemplarer med 3-5 felter pr. brønd og middelværdier, og standardafvigelser beregnes i overensstemmelse hermed.
  4. Beregn procentdelen af senescent celler ved hjælp af følgende formel:
    Senescent celler (%) = Equation 1 x 100

4. analyse valideringsparametre

  1. For alle prøver blev der beregnet en intra-og Inter-assay-variationskoefficient (% CVs) ved anvendelse af følgende formel:
    Intra-assay CV (n = 10 gentagelser målt i ét eksperiment) = Equation 2 x 100 (%)
    Inter-assay CV (n = 5 uafhængige eksperimenter) = Equation 2 x 100 (%)
  2. Til screening, bestemme Z ' værdi, en statistisk parameter til at evaluere kvaliteten af en analyse, fra celler behandlet med 200 nM Rapamycin for 24 h ved 20% O2, 37 °c, 5% Co2 (en positiv kontrol for senotherapeutic narkotika) og ubehandlet senescent celler (negativ kontrol).
    Bemærk: Z '-værdien blev beregnet i henhold til Zhang et al.37. Z ' værdier mellem 0,5 og 1 indikerer, at en analyse kan anvendes til lægemiddel screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SA-β-gal aktivitet kan påvises i celler, der er induceret til at senesce af forskellige måder fra replikerende udmattelse, genotoksisk og oxidativ stress, til oncogen aktivering23,25,38. I den nuværende model ved hjælp af Ercc1-mangelfuld mus embryonale fibroblast celler, normoxic vækstbetingelser (20% O2) var tilstrækkelige til at inducere celle senescens efter dyrkning af dem for et par passager. Vilde type Mef'er undergår også en senescens, men kræver yderligere passager ved 20% O2. Figur 1 viser arbejdsgangen for Screenings analysen, begyndende med isolering af primære MEF-celler fra Ercc1-mangelfulde muse embryoner, til induktion af celle sanering ved oxidativt stress og endelig til analysen af mikroskopiske data fremstillet med et fluorescerende mikroskop med høj indhold. Figur 2 viser repræsentative billeder af MEF-cellekulturer, der indeholder ikke-senescent (unge) celler (figur 2, venstre), ca. 50% senescent celler i passage 5 (figur 2, Center) og senescent celler behandlet med et senolytisk lægemiddel ( Figur 2, højre). Figur 3a viser repræsentative billeder til automatisk, software genererede kvantitative analyser af senescent celler. Figur 3b viser eliminationen af baggrunds-β-galactosidaseaktivitet ved bafilomycin-A. Figur 4 viser mulige udfald af senescent cellekulturer behandlet med lægemidler, herunder senescent celle drab (senolytisk) og senescens modulerende (senomorfe) lægemidler som beskrevet i Fuhrmann-Stroissnigget al. 17.

Figure 1
Figur 1. Skematisk oversigt over screening analyse og tidslinje. MEF celler er isoleret fra gravide mus og sat på cellekultur behandlede plastikplader for et par dage til at udvide. Tidlige passage celler kan fryses i flydende nitrogen og kan anvendes til screening på et senere tidspunkt. Celle senescens induceres af oxidativ stress ved passage ved 20% O2 og celler er udsat for narkotika, når de har nået en robust senescent tilstand. Data analyse, herunder den samlede mængde og de resterende senescent celler, udføres. Tidslinjen i dage angiver varigheden af et eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Repræsentative billeder af ikke-senescent, senescerende og senescent celler behandlet med 100 nM af senolytisk stof 17DMAG. Blå fluorescens indikerer DNA-farvning med Hoechst 33324 mens grøn fluorescens indikerer SA-β-gal farvning med C12FDG. Bright grøn farvning repræsenterer SA-β-gal positive senescent celler, hvorimod Dim farvning repræsenterer SA-β-gal lave eller negative, ikke-senescent celler. Bemærk venligst, at senescent celler normalt har større Cellestørrelse og er fladtrykt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Repræsentative billeder af en senescent MEF cellekultur analyseret med kommerciel software. (A) SA-β-gal positive celler (SA-β-gal+) celler er skitseret i grønne (grønne pile), SA-β-gal negative (SA-β-gal-) er skitseret i rødt (røde pile). Venstre og højre paneler viser henholdsvis Nuclear (Hoechst) og C12FDG (FITC) signal. Kun områder, der plette positivt for Hoechst (indeholder en kerner) betragtes som celler. B) en sammenligning af Bafilomycin-en behandlet og ubehandlet celle. Resterende®-galactosidaseaktivitet i alle celler reduceres ved lysosomale forsuring Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Mulige udfald af narkotikabehandlingen. Lægemidler kan have forskellige virkninger på senescent og ikke-senescent celler, herunder dræbe senescent celler (senolytika) eller undertrykke SA-β-gal senescent fænotype (senomorffer). Tilsammen betegnes disse to klasser som senotherapeutika. Dette tal er blevet modificeret fra Fuhrmann-Stroissnigget al. 17. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SA-β-gal er en veldefineret biomarkør for cellulær senescens, som oprindeligt blev opdaget af Dimri et al. (1995) viser, at senescent humane fibroblaster har øget aktivitet af SA-β-gal, når de er analyseret ved pH 623 sammenlignet med prolifererende celler. I mellemtiden er der foretaget in vitro-og in vivo-assay for SA-β-gal for forskellige celletyper og væv25,39,40. Den fluorescens baserede enkelt celle metode til måling af SA-β-gal i levende celler beskrevet i denne protokol er et glimrende primært screeningsværktøj til lægemidler, der påvirker celle senescens17. Men selvom SA-β-gal betragtes som en af de mest bekvemme markører for senescent celle detektering, yderligere markører for cellulær senescens som påvisning af celle cyklus regulatorer P16Ink4A og P2141, gulne året forbundet sekretoriske fænotype (SASP) proteiner som Il-6, tnfα, HMGB1and NF-κb42, DNA skade reparation markører som υh2ax og telomere, associeret DNA-skade Foci (Tafs)43,44, gulne året associeret heterochromatin Foci ( SAHF) 45eller grundlæggende morfologiske markører som Cellestørrelse og granularitet skal være på plads som bekræftende assays at sikre senotherapeutic potentiale af narkotika40. Da overgangen fra en normal celle til en senescent celle er en langsom proces, er det kritiske trin i denne metode at finde den tærskel, der skelner mellem C12FDG positive (senescent) og negative (normale) celler. Dette skal fastlægges empirisk for hver celletype, og C12FDG-positive og negative kontroller skal inkluderes i hvert eksperiment.

Ud over oxidativ-stressede Ercc1-/- mefs kan denne metode ændres for andre vedlige celletyper. Oxidativ-stressede Ercc1-mangelfulde mesenchymal stamceller (MSCS) og etoposide-behandlede humane IMR90 celler var allerede med succes testet i analysen og kan bruges til at screene for narkotika17. Men, gange for at fremkalde senescens samt narkotikabehandling gange og koncentrationer kan variere.

Den væsentligste begrænsning af denne teknik er, at SA-β-gal-aktiviteten har vist sig at stige under visse senescerende uafhængige forhold såsom celle kontakt hæmning eller høj cellulær sammenløbet46,47. Områder, der indeholder "celle dynger" og cellekulturer med over flydende-celler, kan let bestemmes og bør udelukkes fra analyserne. Derudover, baggrunds farvning fra grøn Auto fluorescerende lipofuscin vesikler øget i senescent celler kan forekomme. I senescent MEF celler kulturer de er ubetydelige på grund af lysstyrken af C12FDG men bør undersøges for hver celletype46. Hoechsts farvning af DNA fører normalt ikke til baggrunds farvning. Nogle phenol ring indeholdende narkotika, dog, kan være fluorescerende i UV-lys. Forøgelse af udelukkelsen størrelse af UV-positive fluorescens signal op til størrelsen af faktiske cellekerner kan bidrage til at forhindre uønsket påvisning af disse stoffer.

Det mest betydningsfulde træk ved den beskrevne analyse er det faktum, at senescent såvel som ikke-senescent celler findes i samme miljø, giver mulighed for vurdering af narkotika virkninger på senescent og ikke-senescent celler samtidigt. Påvisning af det samlede celle nummer ved at tælle cellekerner giver en første indikation om celledræbende potentiale af et lægemiddel. Et fald i celle antallet og celle senescens normalt antyder senolytiske lægemidler, hvorimod et konstant celle nummer med et reduceret antal senescent celler normalt indikerer senomorphic narkotika. På grund af den korte narkotika inkubationstid, kan virkninger som samtidig spredning af ikke-senescent celler og celledød af senescent celler, der fører til konstant celle nummer (f. eks. senolytisk effekt med senomorphic resultat) ikke udelukkes, men betragtes som meget Usandsynligt.

Fremtidige anvendelser af denne teknik omfatter muligheden for at integrere yderligere levende celle markører (f. eks apoptose markør som Bilaginv og 7AAD40) eller markører for forskellige intracellulære rum som mitokondrier eller lysosomer i analyse system. Samtidig monitorering af SA-β-gal og andre cellulære markører under lægemiddelbehandling kan bidrage til at belyse underliggende cellulære mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH Grants AG043376 (projekt 2 og Core A, PDR; Projekt 1 og Core B, LJN) og AG056278 (projekt 3 og Core A, PDR; og projekt 2, LJN) og et tilskud fra Glenn Foundation (LJN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM  Corning 10-013-CV medium
Ham's F10 Gibco 12390-035 medium
fetal bovine serum Tissue Culture Biologics 101 serum
1x non-essential amino acids Corning 25-025-Cl amino-acids
bafilomycin A1  Sigma B1793 lysosomal inhibitor
C12FDG Setareh Biotech 7188 b-Gal substrate
Hoechst 33342  Life Technologies H1399 DNA intercalation agent
17DMAG Selleck Chemical LLC 50843 HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System GE Healthcare High Content Imaging System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  4. Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
  5. Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
  6. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  7. Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
  8. Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
  9. Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
  10. Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
  11. Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
  12. Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
  13. Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
  14. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  15. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
  16. Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
  17. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  18. Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), Albany NY. 955-963 (2017).
  19. Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
  20. Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
  21. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  22. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
  25. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  26. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
  27. Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
  28. Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
  29. Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
  30. Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
  31. Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
  32. Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
  33. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  34. Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
  35. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  36. Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
  37. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  38. Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
  39. Yang, N. -C., Hu, M. -L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
  40. Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
  41. Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
  42. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
  43. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
  44. Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
  45. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  46. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
  47. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo? Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).

Tags

Biologi aldring celle senescens celledød Senescence associeret β-galactosidase høj gennemløbs screening Senolytika Senomorffer Senotherapeutika
SA-β-galactosidase-baseret Screenings analyse til identifikation af Senotherapeutiske lægemidler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fuhrmann-Stroissnigg, H., Santiago,… More

Fuhrmann-Stroissnigg, H., Santiago, F. E., Grassi, D., Ling, Y., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. SA-β-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs. J. Vis. Exp. (148), e58133, doi:10.3791/58133 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter