Summary
여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.
Abstract
Cardiomyocytes 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC-CMs)에서 생성 된 심혈 관 연구에 새로운 도구입니다. 셀의 균질 성 인구 되 고, 보다는 오히려 현재 분화 프로토콜에 의해 생성 된 iPSC CMs 대표 심 실 세포의 혼합-, 심 방-, 및 phenotypic 분석을 복잡 하 게 꾸벅꾸벅 졸 기 같은 고기. 여기, 특히 심 실 같은 iPSC-CMs에서에서 광학 기록 활동 전위 하는 방법을 제시 합니다. 이는 유전자 인코딩 전압 표시기가 심 실 특정 발기인 요소의 제어 구조와 lentiviral 변환에 의해 달성 된다. IPSC-CMs는이 구문으로 불리고 때 하위 특정 광 막 잠재적인 녹음 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 사용 전압 센서 심 실 같은 셀에 독점적으로 표현 된다.
Introduction
유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)에서 파생 된 Cardiomyocytes (CMs)는 불리 한 심장 약물 효과1,2 에 대 한 분자 메커니즘의 심장 질환, 비 발한 요법을 조사 하 고 화면을 해 부하는 신흥 도구 3. 바로 처음부터, channelopathies 같은 arrhythmogenic 질병이 연구4의 중요 한 초점 되었습니다. 따라서, 부정맥 또는 활동 전위 (AP) 형태학 변화 같은 CMs의 전기 고기를 조사 하는 방법이이 기술의 마음에 있습니다.
IPSC CMs의 응용 프로그램에서 중요 한 고려 사항이입니다 셀의 균질 성 인구 현재 심장 차별화 프로토콜 발생 하지 않습니다. 대신, 그들은 오히려 셀 닮은 공동 노드, 심 방, 심 실 CMs 성숙5,6,,78의 서로 다른 수준에서의 혼합물. 이 관련 소스 수 실험 가변성의 AP 기간 (APD) 같은 매개 변수를 조사 하는 경우에 특히는 본질적으로 다릅니다 CM 하위 (예를 들어, APD는 짧은 심 실 CMs에 보다 심 방). 이 문제를 해결 하기 위해 기존의 접근 방법과 패치 클램프 메서드를 사용 하 여 단일 iPSC-CMs를 조사 하 고 각 셀에 꾸벅꾸벅 졸 기를 분류 하는-, 심 방-, 또는 심 실 같은, 그것의 AP 형태9에 따라. 모든 후속 분석 관심의 CM 하위 나타내는 셀에 다음 제한 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 결점은 그것의 한정 된 처리량과 확장성의 부족. 또한, 패치 클램프 전기 생리학의 침략 적인 본질 순차적으로 확장 된 기간 동안 동일한 셀의 이미지를 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 방법10 광학 iPSC CMs의 특정 하위에 Ap의 이미지를 개발에 실험 정보를 제공 합니다. 이 하위가 문제를 극복 하 고 극적으로 iPSC-CMs 유전 이체를 운반 하거나 약물에 노출 된 에이전트의 급속 한 형질을 허용 하는 기존의 방법에 비해 처리량을 증가 시킵니다.
하위 형식 관련 광학 이미징 접근 방법의 개요
도발은와 세포 막의 repolarization 형광 속성 변경, 유전자 인코딩 전압 표시기 (GEVI), CMs의 막 잠재력의 변화를 광학 이미지에 사용 됩니다. 여기에 적용 하는 GEVI은 전압 감지 형광 단백질 VSFP CR11, 전압 감지 막 횡단 도메인 융합 그린 (클로버)와 레드 (mRuby2) 형광 성 단백질 (그림 1A)의 쌍을 이루어져 있는. 두 fluorophores의 근접 때문에 녹색 형광 단백질의 여기 여기 에너지는 빨간색 형광 단백질을 통해 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)에 전송 되 고의 결과. 따라서, 녹색 형광 단백질의 여기 모두 녹색과 적색 형광 단백질 (그림 1A, 상단 패널)에서 방출에 발생합니다. 셀 depolarizes, 전압 센서의 구조 재편 무서 워 효율성 두 가지 형광 단백질의 재교육으로 변환 하는 발생 합니다. 따라서, 여기 에너지의 더 많은 전송 됩니다 녹색에서 빨간색 형광 단백질 (그림 1A, 하단 패널). 그 결과, depolarized 셀에 녹색 형광 방출 주차, 이며 휴식 막 잠재적인 (그림 1B)에 셀에 빨간색 형광 방출은 보다 밝은.
그림 1: VSFP cr.와 막의 광학 영상 VSFP CR 표시 전압에 민감한 형광 단백질의 행동을 묘사 하는 (A) A 회로도 세포 막의 도발은 시 전압 감지 막 횡단 도메인 구조 재편 (GFP) 녹색과 빨간색 (RFP) 형광 단백질, intramolecular 포스터의 효율성 증가의 재교육으로 변환 공명 에너지 전달 (무서 워) 휴식 막 잠재력 (위 패널)에서 셀에 및 depolarized 셀 (하단 패널)에 GFP의 구동 시 VSFP의 (B) 방출 스펙트럼 묘사 된다. 도발은 시 스펙트럼 변화 명확성을 위해 과장 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
막 잠재력의 변동 미러링 무서 워 효율에서 변화는 빨간색과 녹색 형광 방출 분리 하 고 그들의 2 개의 인접 한 지역에 프로젝트는 이미지 스플리터 장착 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데 sCMOS 카메라 (그림 2)의 칩 했다. 이 설정으로 2 개의 다른 파장 악대에서 형광 방출 기록 될 수 동시에, 빨강-녹색 형광 막 잠재적인 시간 경과 시리즈의 모든 이미지에 맞게 비율의 계산을 허용 하.
그림 2: 이미징 시스템의 구성. 이미징 시스템의 주요 구성 요소는 높은 시간 해상도에서 막 잠재적인 변화를 미러링 전압에 민감한 형광 단백질의 스펙트럼 변화를 묘사 하는 이미지를 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
VSFP-CR CMs의 식 lentiviral 변환 함으로써 이루어집니다. 관심의 CM 하위 식을 직접 lentivirus는 특히 심 실 같은 iPSC-CMs10전사를 드라이브 하는 발기인 요소 ( MLC2v enhancer)를 포함 합니다. 심 방 같은, 꾸벅꾸벅 졸 기 같은와 같은 심 실 세포의 혼합물을 나타내는 iPSC-CMs는이 lentivirus 함께 불리고, VSFP CR 심 실 같은 셀에만 표시 됩니다. 광학 활동 전위 이미징이 형광 센서에 따라, 이후 기록 된 활동 전위는 독점적으로 관심 (그림 3)의 CM 하위 유형을 나타냅니다.
그림 3: 하위 형식 관련 막 잠재적인 이미징 발기인 구동 VSFP 식. (한)이이 회로도 cardiomyocyte 하위 형식 관련 광학 활동 전위 기록 달성 하는 방법을 보여 줍니다. (b) iPSC-CMs 심 실 전용 MLC2v-증강의 통제는 VSFP에 감염 표시 됩니다. 전압 센서의 식 GFP 채널 (왼쪽된 패널)에서 심 실 같은 CMs에만 관찰 된다. 오버레이 이미지 (오른쪽 패널) 및 위상 대비 (중간 패널)도 제공 됩니다. 흰색 점선 셀 경계를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
1. 이미징 iPSC 파생 Cardiomyocytes의 준비
참고: iPSC 문화와 심장 차별화 방법12,,1314 전에 게시 된 고 여기 자세하게에서 논의 하지 않습니다. 수동 서, 자석 세포 별거, 또는 젖 산 선택 iPSC-CMs의 정화 것이 좋습니다, 분화 프로토콜 사용에 따라. 다음 프로토콜에 대 한 지역, 생성 된 구타에서 microdissected explants 단층 차별화 프로토콜13를 사용 하 여, 심장 감 별 법의 15 날에 촬영 되었고 설명한 fibronectin 코팅 판에 30 날까지 교양 10전에.
- 받아 셀 인큐베이터에서 배양 배지 및 수동으로 microcentrifuge 튜브 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 심장 explants를 수집 합니다. 침전, 후 세포 배양 표면에 뜨는 발음 하 고 부드럽게 행 크와 2 x의 균형 explants 소금 세척 솔루션 (HBSS).
- IPSC CMs 콜라 유형 II를 추가 하 여 해리 (HBSS에 430 U/mL)와 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 품 어.
- 나머지 큰 세포의 침전 묶습니다 후 상쾌한 천연된 단일 iPSC-CMs가 포함 된 수집 하 고 높은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 농도 (DMEM-F12, 20 %FBS, 2 mM 포함 된 신선한 CM 유지 보수 매체 추가 L-glutamine, 1: 100 MEM 비필수 아미노산, 스-100 U/mL 페니실린, 그리고 0.1 m m β-mercaptoethanol).
- 큰 세포 덩어리 남아 있으면 분리를 반복 합니다. 수집 iPSC CMs 원심 분리에 의해 단일 하 고 낮은 FBS 농도 포함 하는 CM 중간에 resuspend (2 %FBS).
- 다시 fibronectin (2 µ g/c m2)로 코팅 되는 3.5 c m 유리 하단 셀 문화 microdish 단일 셀의 후속 이미징 수 있도록 밀도 단일 iPSC CMs 씨앗. 높은 처리량 실험에 참여 하기 전에 시드 밀도 최적화 합니다. 일반적으로, 3.5 c m 접시 당 5-10 심장 explants는 충분 한; 그러나,이 무 겁 게 explant 크기와 순도에 따라 달라 집니다.
- 2%를 포함 하는 CM 유지 보수 매체에 그들의 분리 후 단일 iPSC CMs 문화 FBS 적어도 48 h에 대 한 충분 한 복구를 보장 하기 위해.
참고: 다음 단계에 iPSC CMs 인코딩 GEVI VSFP-CR MLC2v 증강10 의 통제 실의 특정 GEVI 식 달성 하기 lentivirus와 불리고 있다. 또는, 꾸벅꾸벅 졸 기 또는 심 방-같은 셀에 특히 GEVI을 표현 하기 위해 수 있도록 lentiviral 구문 또는 편 표현 PGK 발기인 은닉 난다 구문 사용된10될 수 있습니다. Lentiviral 플라스 미드 요청 시 사용할 수 있습니다.
주의: lentiviral 입자를 사용할 경우 작업 환경에는 잠재적으로 전염성이 에이전트 작업에 대 한 안전 지침을 준수 하 고 필요한 안전 조치를 취할 적절 한 biosafety 수준 확인 하십시오. - 감염 매체 lentivirus10을 혼합 하 여 준비-포함 하는15, CMs 유지 보수 매체와 전에 설명한 대로 HEK293 세포에서 생산 되어 표면에 뜨는, 세포 배양 (단계 1.3 참조) 1:1 비율에서.
- 감염 효율을 향상 시키기 위해 8 µ g/mL의 최종 농도에 hexadimethrine 브 로마 이드를 추가 합니다.
참고: 높은 감염에의 한 효율성의 ultracentrifugation 통해 lentivirus iPSC CMs 이전 농도의 일반적으로 필요 하지 않습니다. - 단일 iPSC CMs에서 CM 유지 보수 매체를 발음 하 고 감염 매체 1.7, 1.8 단계 동안 준비 합니다. 37 ° c.에 12 h에 대 한 감염 매체에 감염 된 단일 iPSC-CMs 문화 다음, 매체를 발음 하 고 CM 유지 보수 매체 다시 바꿉니다.
참고: 형광 신호는 GEVI에서 감염 후 48 h에 나타납니다. 막 잠재적인 녹음의 이미징이 좋습니다, 초기에 감염 후 72 h 적절 한 신호 강도 보장 하기 위해. 단일 감염된 iPSC CMs 적어도 3 주 동안 경작 하 고 순차적으로 몇 군데 수 있습니다. 광범위 한 photobleaching 이미징 세션 동안 발생 하는 경우 시간이 지남에 따라 형광 신호를 복구 합니다. - 이미징, 전에 Tyrode의 솔루션 캘리포니아2 + 보충 하 여 세포 배양 매체 교환 (135 m m NaCl, 5.4 m KCl m, 1 mM MgCl2, 10 m m 포도 당, 1.8 m m CaCl2및 10 mM HEPES; pH 7.35).
2. 광 막 잠재적인 녹음
- 장소 이미지 분배기, 적절 한 필터 집합 및 카메라 (예를 들어, sCMOS 카메라) 높은 고속 이미징 능력을 갖춘 거꾸로 epifluorescence 현미경의 스테이지 iPSC CMs 포함 된 이미징 챔버 감도입니다.
참고: 예를 들어 480/40 nm 대역 통과 여기 필터 사용 현미경, dichroic 거울 500 nm 롱 패스와 결합 하 고 568 nm 긴 패스 dichroic 거울 520/28 결합 및 이미지 스플리터에 630/75 nm 대역 통과 배출 필터. 단일 셀 이미징에 대 한 높은 확대, 높은 수 가늠 구멍 기름 침수 목표 최상의 신호 대 잡음 비율을 제공합니다. - 전기 성 하는 것이 필요한 경우 영상 실에서 서 성 전극을 설치 하 고 자극 발생기에 연결.
참고: 우리는 3.5 c m 유리 하단 셀 문화 요리에 포함 된 두 개의 백 금 전극을 장착 하 서 성 삽입을 사용 합니다. 전극 사이 위치한 세포 몇 군데 있었다. 전형적인 서 성 매개 변수 5 ms의 직사각형 펄스 지속 시간, 진폭 10 V/cm 전극 거리의 있는.입니다. - 필요에 따라 온수 현미경 단계를 사용 하 여 장기 이미징 경우 이미징, 또는 심지어 현미경 인큐베이션 챔버 설정 동안 iPSC-CMs의 안정적인 온도 보장 하기 위해.
- 초점 셀을 가져오고 보기 필드의 중앙에는 GEVI을 표현 하는 셀을 배치.
참고: 이것은 가장 편리 하 게 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 형광 성 단백질 (RFP) 필터는 GEVI를 표현 하는 셀을 식별 하기 위해 설정 하는 빨간색을 사용 하 여 현미경의 접 안 렌즈를 사용 하 여 이루어집니다. - 내보낸된 빛 이미지 스플리터 라우팅됩니다 광학 경로 설정 합니다. 현미경에서 이미지 분배기에 필터와 결합 한 필터 큐브 전환 ( 재료의 표참조).
- 카메라를 제어 하는 소프트웨어에 고속 이미징 (예를 들어, 프레임 당 10 ms 노출 시간으로 초당 100 프레임)가 가능한 수집 설정을 설정 합니다.
참고: 일반적으로,이 카메라 픽셀의 binning 포함 (예를 들어, 8 x 8 픽셀 카메라 칩의 시간 경과 영화에서 한 픽셀을 생성 하 범주화 됩니다). - 제조업체의 지시에 따라 이미지 스플리터를 설정 합니다. 두 이미지를 대표 하는 두 개의 서로 다른 방출 파장 밴드 해야 서로 인접 한 한을 차지 하는 것은 각 이미지의 절반.
참고:이 단계는 수만 1 x 이미징 각 세션의 시작 부분에서 수행. - 확인 하 고, 필요한 경우, 카메라에 의해 생산 하는 이미지의 초점을 조정.
- 조명 빛의 밝기를 조정 하는 픽셀의 어떤 채도 피할 수 있다; 이 가장 쉽게 포화 픽셀 독특한 색상으로 표시 됩니다 색상 팔레트를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
참고: 영상 전에 이러한 모든 준비 하는 동안 제한 빛 (즉, 않습니다 떠나지는 빛에 연장 기간)에 필요한 금액을 여기에는 샘플의 노출은 GEVI의 photobleaching을 피하기 위해. - 시계열의 인수를 설정 (예를 들어, 50의 시리즈 동안 초당 100 프레임에서 5000 이미지 s). 측정에 영향을 미치는 길 잃은 빛을 피하기 위해 (를 포함 하 여 컴퓨터 모니터) 방에 빛을 희미 한. 이미징 소프트웨어에 의해 구동 가벼운 셔터를 제어할 수 없으면 그냥 인수를 시작 하기 전에 그것을 엽니다.
- 이미지 시리즈의 수집을 시작 합니다. 전기 성 원하는 경우 이미징 소프트웨어에 의해 자동으로 시작 하지 않는 한 적절 한 시간 지점에 서 성 시퀀스를 시작 합니다. 약리 에이전트의 응용 프로그램을 원하는 경우이 작업을 수행 하거나 수동으로 (예를 들어, 버퍼, 900 µ L을 포함 하 고 부드럽게 피펫으로 혼합 녹음 실로 10 배 최종 농도에 에이전트의 pipetting 100 µ L에 의해) 또는 사용 하 여 한 일정 흐름 관류 시스템입니다.
- 인수 완료 되 면, 필요한 경우 여기 광 셔터를 닫습니다. 하드 드라이브를 녹음을 저장 합니다.
- 그대로 녹음 설정 (즉, 노출 시간, 프레임 속도, 및 빛의 강도)를 떠나, 수행 (2.11 단계)로 배경 형광의 녹음 되지 셀을 포함 하는 coverslip의 지역 또는 어떤 다른 coverslip 더 셀 시드 되었습니다.
참고: 연속 측정을 수집 설정을 변경 하지 않고 수행, 하나의 배경 형광 녹음 모든이 측정에 필요한입니다. - 원하는 경우 동일한 coverslip에 있는 다른 iPSC CMs에 추가 실험 (2.4-2.13 단계)를 수행 합니다. 약물이 적용 된 경우에 coverslip에 모든 CMs 영향 될 다는 것을 유의 하십시오.
3입니다. 분석
> 참고: 이미징 소프트웨어에 따라 이용 한다 (일반적으로 독점 소프트웨어 패키지는 카메라 또는 전체 형광 이미징 시스템의 제조업체에서 제공), 그것 수 있습니다 또는 부분적으로 인수 이미지의 분석을 수행 이 소프트웨어 패키지에서 완전히. 그러나, 여기의 이미지 분석을 수행할 수 있는 워크플로가 오픈 소스 소프트웨어 (즉, 이미지 분석 플랫폼 ImageJ)16,17, 피지 등 R 패키지 배포를 사용 하 여 편리 하 게 설치할 수 있는 통계 컴퓨팅18 설명 합니다. 간단히, 관심 (ROIs) 대표 하는 셀 또는 배경 영역 그려집니다 ImageJ, 그리고 시간이 지남에 이러한 ROIs에 평균 형광, 다음, 더 분석할 R에 또는, 양자 택일로, 스프레드시트 소프트웨어와 파일을 내보내집니다.
- 이미징 소프트웨어에 저장 하거나 ImageJ로 읽을 수 있는 형식 (예를 들어, TIF) 획득된 한 이미지 시계열 (셀을 포함 하는 기록 및 해당 배경 녹음)를 내보낼. ImageJ 이미징 시스템 제조 업체의 다른 브랜드에서 독점적인 파일 포맷을 읽을 수 사용 루틴을 제공 하는 BioFormats 플러그인 (https://imagej.net/Bio-Formats), 또는 사용.
참고: 다음 단계 영상으로 녹음을 통해 동일 하다는 것을 가정 합니다. 만약이 경우가 아니라면, 이미징 소프트웨어에서 타이밍 정보를 내보내고 추가 분석에 포함 필요할 수 있습니다. - ImageJ는 셀을 포함 하는 TIF 스택을 엽니다.
- 자유형 선택 도구를 사용 하 여 빨강 채널에 형광 cardiomyocyte 통해 ROI를 그릴. 계약 하는 동안 투자 수익에서 셀 이동 하지 않는 투자 수익 큰 충분히 인지 확인 합니다.
- 투자 수익 관리자 플러그인 오픈 ('분석 | 도구 | 투자 수익 관리자 ') ROI1로이 투자 수익을 추가 하려면 '추가 [t]' 버튼을 누릅니다.
- 녹색 채널에 동일한 셀을 통해 투자 수익을 끌어서 ROI2로이 투자 수익을 추가.
- 에서 ' 분석 | 설정 측정의 메뉴, '회색 값을 의미'제외한 모든 옵션의 선택을 취소 합니다.
참고: 이것은 단지 1 x ImageJ 세션에서 할 수 있다. - 투자 수익 매니저에는 를 눌러 ' 더 | 다중 측정 ' 버튼. '모든 분할 영역 측정' 과 '슬라이스 당 행' 옵션을 선택 하 고 '확인'을 누릅니다. 창이 열립니다 (분할 영역 번호와 빨간색에서 및 녹색 채널에 셀을 각각 나타내는 두 ROIs에 평균 형광) 세 개의 행으로 스프레드시트를 포함 하.
- 를 사용 하 여 ' 파일 | 다른 이름으로 저장 ' 는 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 파일에 스프레드시트를 저장 하려면.
- 투자 수익 관리자 창을 닫지 않고 이미지 스택 창 및 스프레드시트 창을 닫습니다. 배경 측정을 포함 하는 TIF 스택을 엽니다.
- 투자 수익 매니저에는 를 눌러 ' 더 | 다중 측정' 버튼. '모든 분할 영역 측정' 과 '슬라이스 당 행' 옵션을 선택 하 고 '확인'을 누릅니다.
- 를 사용 하 여 ' 파일 | 다른 이름으로 저장 ' 다른 CSV 파일에 배경 데이터와 스프레드시트를 저장 하려면.
참고: 다음 계산 스프레드시트 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다. 우리는 R 소프트웨어18을 사용합니다. 파일 "cell.csv" 및 "background.csv"에서 셀 및 배경 데이터 계산, 고 막 잠재적인 신호 시간 과정을 읽는 간단한 예제 스크립트 추가 코드 파일 1로 제공 됩니다. - 배경 녹음에서 빨간색에서 및 녹색 채널에 평균 강도 계산 합니다. 각각이 배경 배경 수정 RFP를 계산 하는 빨간색과 녹색 채널에 셀을 나타내는 신호에서 신호와 GFP 신호를 뺍니다.
- 막 잠재력에 대 한 대리 모, RFP/GFP 비율을 계산 합니다.
참고:이 비율은 치수입니다. 또는, 그것은 초기 값 (즉, ΔR/R0) 정규화 될 수 있습니다. 중요 한 것은,이 비율의 절대 값 보다는 시간적 변화에 유용한 정보가 포함 되어 있습니다. GFP와 RFP의 고르지 못한 photobleaching, 때문에이 비율에서 초기 드리프트 발생할 수 있습니다. 필요한 경우 베이스 라인 드리프트 기준 곡선을 구성 하 고 RFP/GFP 비율10에서 빼서 수정할 수 있습니다.
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Representative Results
그림 4a에서 대표 단일 iPSC CM RFP (왼쪽)와 GFP (오른쪽) 채널에서 이미징 분석 하는 동안 그린 투자 수익을 표시 하얀 점선으로 그려져 있습니다. RFP 채널에서 신호 (그림 4b, 상단 패널) 각 활동 전위 동안 형광 강도 주기적 증가 보여줍니다. 소개에 설명 된 대로 이것은 잠재적인 막 (그림 1)에 있는 변화에 기인한 증가 무서 워. Concordantly, GFP 신호는 형광 강도 (그림 4b, 중간 패널)에서 정기적인 감소를 보여 줍니다. RFP/GFP 비율 (그림 4b, 하단 패널)는 APD50 및 APD90 측정 등 다운스트림 분석에 사용 된 생물학 신호. 이 방법, 30 일 된 심 실 같은 iPSC-CMs 439 ms (± 46 ms)와 평균 APD90 (기간 평균 APD50 (활동 전위는 repolarization 50% 완료 될 때까지 처음부터 기간) 보였다 0.5 Hz에서 진행을 사용 하 여 repolarization 90% 완료)까지 520 ms (± 47 ms)의 (그림 4c).
그림 4: 이미지 분석 및 기본 활동 전위 특성의 원칙. (한) 동시에 기록 된 RFP (오른쪽) 단일 iPSC CM의 GFP (왼쪽) 형광 표시 됩니다. 흰색 점선의 (수익 ROI) 이미징 분석에 대 한 사용 영역을 나타냅니다. (b) 배경 수정 RFP, GFP, 원시 흔적 고 RFP/GFP 신호는 투자 수익에서 파생 된 표시 됩니다. (c) 수단과 SEM의 APD90 APD50 단일 심 실 같은 iPSC-CMs의 실내 온도 0.5 Hz 속도 함께 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
메서드는 또한 활동 전위 기간에 변경의 능력을 보여, iPSC CMs 전기 증가 자극 속도 0.4에서 2.5 Hz, 속도 증가 마다 5 비트 (그림 5)에서 자극 했다. 한 iPSC-CM에서 전형적인 광학 기록 막 잠재적인 신호는 그림 5a에 표시 됩니다. 각 박동 속도에서 처음 4 개의 활동 전위 증가 박동 속도 (그림 5b)에서 활동 전위의 진보적인 단축 시연 평균 했다. 이후의 진행된 박동을 평균 활동 전위 광학 기록10에 소음을 줄이는 효과적인 방법입니다. 그것은 묘사 실험 속도-종속 활동 전위는 우리가 균형에 도달 하기에 충분 하지 않을 수도 있습니다 각 서 성 속도로 5 비트에 대 한 셀을 진행 가능, 단축의 전액을 캡처하지 수 언급 되어야 합니다.
그림 5: 활동 전위 기간에 서 성 주파수의 효과. (한) 는 iPSC CM 주파수 0.4에서 2.5 Hz에 이르기까지 표시 된 증가에 진행 했다 (단일 전기 서 성 펄스는 화살표로 표시 됩니다). (b) 서 성 각 주파수에 대 한 평균된 AP이이 주파수에서 처음 4 개의 Ap에서 계산 했다. 평균된 Ap은 오버레이로 서 성 속도 증가 함께 단축 AP를 보여주는 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
메서드 또한 iPSC CMs (그림 6)에 적용 하는 약물의 electrophysiological 효과 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, isoproterenol, 비 선택적인 β-adrenoreceptor 주 작동 근, 표시, 프롬프트 박동 속도 (그림 6a) 증가 선도 저절로 박동 iPSC-CMs 적용 했다. 복용량 응답 곡선 iPSC CMs의 박동 주파수에 다른 Isoproterenol 농도의 영향을 보여주는 그림 6b에 나와 있다.
그림 6: 박동 주파수에 isoproterenol의 효과. (한) 저절로-박동의 대표적인 원시 광 활동 전위 추적 단일 iPSC CM 표시 됩니다. 막대에 표시 된 대로 (1 µ M의 최종 농도)와 Isoproterenol iPSC CMs에 추가 되었습니다. (b)이 복용량 응답 곡선 표시 iPSC의 박동 주파수에 다른 isoproterenol 농도의 효과-표준 편차를 나타내는 CMs. 오류 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 설명 하는 방법을 인간의 Ipsc에서 생성 하는 CMs의 특정 하위 (즉, 같은 심 실 세포)에서 Ap의 광학 기록 수 있습니다. 인간의 iPSC-CMs는 거 대 한 다양 한 생물학과 의료 문제를 해결 하기 위해 새로운 도구 이며 다른 CM 하위 형식에 차별화 실험적인 다양성의 중요 한 소스. 특정 발기인 요소를 사용 하 여는 GEVI의 식 CMs에 관심, 하위를 나타내는 있는 광학 이미지 다음에 구체적으로 달성 된다.
단일 iPSC-CMs에서 APs의 성공적인 인수 분리 후 reseeding 밀도에 따라 달라 집니다. 셀 너무 밀도가 다시 시드해야는, 그것은 고립 된 하나의 iPSC-CMs는 전기 syncytium에 속하지 않는 찾을 수 있습니다. 그러나, 너무 낮은 시드 밀도 부정적인 세포의 생존에 영향을. 따라서, 다른 시드 밀도의 체계적인 테스트 것이 좋습니다, 특히 높은 처리량 영상에 의존 하는 실험에 참여 하기 전에.
이미지 수집 동안에 VSFP 부정적인 영향을 미칠 수 신호 대 잡음 비율, 더 이상 실험 중 특히 photobleaching을 겪 습. 실험 기간 동안 급속 한 photobleaching 경우 확인 하십시오 이미지 수집 또는 필요한 준비 단계 (검색을 표현 하는 VSFP 세포에 초점) 되어야 여기 빛 셔터만 열 최대한 빨리 수행 됩니다. 또한, 여기 필요한 최소한에 빛의 힘을 감소 하 고 만들 이미지 수집에 사용 되는 고감도 카메라의 동적 범위를 사용 하 여.
이미지 분석 중 투자 수익을 그릴 때 유의 iPSC CMs 수축 동안 이미지 스택의 모든 이미지에 ROI 내에서 체재 해야 한다. VSFP의 비율 특성상 투자 수익에서 셀의 모든 움직임 인공 신호 리드 하지 않습니다 하지만 신호 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, ROIs 너무 커서 하 또한 부정적인 불필요 하 게 큰 비 신호 생산 분야 신호 대 잡음 비율에 영향을 하 고 피해 야 한다.
대표 결과, 심장 유도 사용 후 적어도 30 일 동안 성숙 하기 위하여 허용 된 iPSC CMs 분화. 성숙의이 기간 후에 다른 CM 하위, 같은 꾸벅꾸벅 졸 기-심 방,-, 또는 심 실 모양의 세포를 구분할 수 있습니다. 이 셀이 아직 성숙 되지 않으며 칼슘19처리로 서 전기적 특성에 영향을 미치는 2 차원 (2 차원) 문화 시스템에만 배아 모양의 형에 도달. IPSC CMs의 이러한 일반적인 제한 필요 간주, 그들은 활동 전위를 측정 하는 데 사용 되는 방법의 독립적인 실험 결과 혼동 수 있습니다. 고급 3 차원 (3 차원) 문화 시스템 추가 성숙은20,으로 유망한 결과 나타났습니다 그리고 여기 설명 하는 방법을 이런이 맥락에서 가치가 있을 수 있습니다.
IPSC CMs의 측정 APs의 현재 골드 표준 다른 AP 특성의 매우 상세한 분석을 허용 하는 패치 클램프 기록 이며 심지어 단일 이온 채널 전류 측정을 가능 하 게. 또한, 절대 값 (예:, 휴식 막 잠재적인) 측정할 수 있습니다. 대조적으로, 광학 AP 녹음 막 잠재력의 상대적 변화에 근거한 다. VSFP의 상대적으로 느린 본질적인 활동 때문 "슛" 등 특정 AP 특성 수치에서 무딘 수 있습니다 하 고 빠른 기능, AP 상승 운동 속도 등의 의미 있는 정량 불가능 합니다. 그러나, 전형적인 실험 설정에서 절대 값이 아니라, 하지만 차이 값 (예를 들어, 서로 다른 세포 사이 또는 전후 약물의 응용 프로그램)에서 측정 됩니다. 이 안정적으로 AP 기간 같은 특성에 대 한이 원고에 설명 된 광학 방법으로 달성 될 수 있다 (예를 들어, APD90 또는 APD50) 또는 박동 속도 패치 클램프10에 비해 훨씬 더 높은 처리량 . 또한,이 기술은 비-침략 적 성격의10시간 동안 동일한 셀의 여러 측정을 수 있습니다. 따라서, 광학 AP 녹음 및 패치 클램프 한다 상호 보완적인 도구로 간주 되며 응답 될 필요가 있는 실험적인 질문에 따라 사용.
광학 AP 녹음 한 GEVI의 표현 또는 potentiometric 형광 염료 (예를 들어, 디-8-ANEPPs)21의 응용 프로그램에 의해 얻을 수 있습니다. 형광 염료 하지만 일반적으로 호의 베푸는 형광 활동으로 그들은 하지 유전자-인코딩하는 cardiomyocytes의 특정 하위에 지시 될 수 없습니다. GEVIs 다른 운영 원칙에 따라 수 개발된22되었습니다. 여기, 무서 워 기반 GEVI VSFP-CR11 이 사용 됩니다. 이 선택에 대 한 주요 이유는 셀룰러 도발은 빨간색에서 증가와 녹색 형광 감소에 반응 하는 녹색 형광 단백질 흥분 하는 경우이 표시등의 비율 특성 이었다. 이 때문에 심장의 분야에서 유리 같은 비율 지표는 지표의 변화에 의해서만 depolarization 반응 보다 cardiomyocytes의 수축으로 인해 셀 움직임에 의해 발생 하는 아티팩트에 적습니다 그들의 형광 강도입니다.
만 심 실 같은 iPSC- MLC2v 증강 인자를 사용 하 여 CMs를 대상으로 하는 실험에서 결과 여기에 표시 됩니다, 하는 동안 그것은 또한 심 방 또는 꾸벅꾸벅 졸 기-같은 다른 하위 특정 발기인 요소10을 사용 하 여 CMs 대상 수 있습니다. 자세하게에서 방법을 설명 하기 위해이 원고 이미징이 단일 세포의 AP 속성의 분석을 가능 하 게 하 고 높은 신호 대 잡음 비율을 제공 합니다 유리 coverslip에 시드는 단일 iPSC CMs에 집중 했다. 그러나,이 기술은 또한 전기 syncytium 또는 3 차원 구조에 있는 다른 세포와 통합 CMs의 이미지 수 있습니다. 이것은 특별 한 관심의 3 차원 셀 문화는 점점 사용 모델과 2 차원 모델20에서 다른 속성을 제공 하기 위해 표시 되었습니다. 이미지 설정 및 ROIs는의 정의 따라 조직 내의 단일 셀 또는 3 차원 직물의 더 큰 영역에서 광 신호를 분석할 수 있습니다. 또한, 여러 셀 동시에 몇 군데 수 하 고, 별도로 분석 처리량에 상당한 증가를 선도.
함께 찍은, 여기에 제시 된 방법 iPSC-부정맥 관련 고기에 대 한 CMs의 급속 한 광 형질을 함으로써 iPSC-CMs 부정맥 연구의 분야에서의 적용을 높일 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 연구 재단 (Si 1747/1-1), 다른 Kröner-Fresenius-재단, 그리고 도이치 재단에 Herzforschung에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
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