Summary
यहां हम ऑप्टिकली छवि कार्रवाई क्षमता के लिए एक विधि वर्तमान, वेंट्रिकुलर में विशेष रूप से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes की तरह । विधि प्रमोटर-एक वोल्टेज के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति संचालित पर आधारित है ।
Abstract
Cardiomyocytes मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से उत्पंन (iPSC-सीएमएस) हृदय अनुसंधान में एक उभरते उपकरण हैं । बजाय कोशिकाओं के एक समरूप जनसंख्या जा रहा है, iPSC-सीएमएस वर्तमान भिंनता प्रोटोकॉल द्वारा उत्पंन वेंट्रिकुलर के साथ कोशिकाओं का मिश्रण प्रतिनिधित्व करते हैं, अलिंद-, और phenotypes, जो phenotypic विश्लेषण पेचीदा की तरह नोडल । यहां, एक विधि से ऑप्टिकली रिकॉर्ड कार्रवाई संभावित वेंट्रिकुलर से विशेष रूप से iPSC-सीएमएस की तरह प्रस्तुत किया है । यह एक निर्माण जिसमें एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज सूचक एक वेंट्रिकुलर-विशिष्ट प्रमोटर तत्व के नियंत्रण में है के साथ lentiviral transduction द्वारा हासिल की है । जब iPSC-सीएमएस इस निर्माण के साथ transduced रहे हैं, वोल्टेज संवेदक विशेष रूप से वेंट्रिकुलर की तरह कोशिकाओं में व्यक्त की है, उपप्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल झिल्ली क्षमता समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रिकॉर्डिंग को सक्षम करने से ।
Introduction
Cardiomyocytes (सीएमएस) प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पंन (iPSCs) हृदय रोग के आणविक तंत्र काटना करने के लिए एक उभरते हुए उपकरण हैं, उपंयास उपचार की जांच करने के लिए, और प्रतिकूल कार्डियक दवा प्रभाव के लिए स्क्रीन1,2 ,3. शुरू से ही सही, channelopathies जैसे arrhythmogenic रोगों इस अनुसंधान क्षेत्र का एक महत्वपूर्ण ध्यान दिया गया है4. नतीजतन, इस तरह के ताल विकारों या कार्रवाई संभावित (एपी) morphologies में परिवर्तन के रूप में सीएमएस के विद्युत phenotypes की जांच करने के लिए तरीके, इस प्रौद्योगिकी के दिल में हैं ।
iPSC के आवेदन में एक महत्वपूर्ण विचार-सीएमएस है कि वर्तमान हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल कोशिकाओं की एक समरूप जनसंख्या में परिणाम नहीं है । इसके बजाय, वे नहीं बल्कि परिपक्वता के विभिंन स्तरों पर साइनस नोड, अलिंद, और वेंट्रिकुलर सीएमएस जैसी कोशिकाओं का मिश्रण कर रहे है5,6,7,8। इस विविधता प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के एक प्रासंगिक स्रोत है, खासकर अगर एपी अवधि (APD) के रूप में मानकों की जांच कर रहे हैं, जो आंतरिक रूप से सेमी उपप्रकार के बीच अलग हो सकता है (जैसे, APD अलिंद में वेंट्रिकुलर सेमी की तुलना में कम है) । पारंपरिक दृष्टिकोण इस समस्या का समाधान करने के लिए एक iPSC-सेमी पैच दबाना विधि का उपयोग कर की जांच करने के लिए और प्रत्येक कक्ष के रूप में वर्गीकृत करने के लिए नोडल-, अलिंद-, या वेंट्रिकुलर की तरह, अपनी एपी आकृति विज्ञान9पर आधारित है । इसके बाद किसी भी विश्लेषण के बाद ब्याज की सेमी उपप्रकार का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं को प्रतिबंधित किया जा सकता है । इस रणनीति के प्रमुख दोष अपने सीमित प्रवाह और दरिद्रता की कमी है । इसके अलावा, पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के इनवेसिव प्रकृति क्रमिक रूप से विस्तारित समय अवधि में एक ही कोशिकाओं के इमेजिंग की अनुमति नहीं है ।
यहां, हम एक विधि10 iPSC-सीएमएस के विशिष्ट उपप्रकार में ऑप्टिकली छवि ए पी एस के लिए विकसित पर प्रयोगात्मक विवरण प्रदान करते हैं । यह उपप्रकार विविधता की समस्या पर काबू पा और नाटकीय रूप से पारंपरिक तरीकों की तुलना में प्रवाह बढ़ जाती है, iPSC के तेजी से phenotyping-सीएमएस आनुवंशिक वेरिएंट ले जा रहा है या औषधीय एजेंटों को उजागर की अनुमति ।
उप-प्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल इमेजिंग approach का ओवरव्यू
एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज संकेतक (GEVI), जिसका प्रतिदीप्ति गुण ध्रुवीकरण और कोशिका झिल्ली के ध्रुवीकरण पर बदल, ऑप्टिकली सेमी की झिल्ली की क्षमता में परिवर्तन की छवि के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां लागू GEVI वोल्टेज-संवेदन फ्लोरोसेंट प्रोटीन VSFP-सीआर11, जो एक वोल्टेज-संवेदन transmembrane एक जोड़ी से जुड़े डोमेन के होते है एक हरे (तिपतिया घास) और एक लाल (mRuby2) फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आंकड़ा 1a) । दो fluorophores के करीब निकटता के कारण, उत्तेजना ऊर्जा का एक अंश में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन परिणाम के उत्तेजना Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के माध्यम से लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन को हस्तांतरित किया जा रहा है । इसलिए, हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आंकड़ा 1a, ऊपरी पैनल) दोनों से एक उत्सर्जन में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के परिणाम उत्तेजना । जब कोशिका के ध्रुवीकरण, वोल्टेज संवेदक के एक संरचनात्मक rearrangement होता है कि दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक अभिविन्यास में तब्दील हो, झल्लाहट दक्षता में वृद्धि. इस प्रकार, उत्तेजना ऊर्जा के और भी लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आंकड़ा 1a, निचले पैनल) के लिए हरी से स्थानांतरित कर रहा है । एक परिणाम के रूप में, एक विध्रुवीय कोशिका में, हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन dimmer है, और लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में एक कोशिका की तुलना में उज्जवल है झिल्ली की क्षमता (आंकड़ा 1b) आराम कर रहा है ।
चित्रा 1: VSFP-सीआर के साथ झिल्ली क्षमता की ऑप्टिकल इमेजिंग । (क) एक योजनाबद्ध वोल्टेज की कार्रवाई के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन VSFP-सीआर दर्शाया गया है । कोशिका झिल्ली के ध्रुवीकरण पर, वोल्टेज संवेदन transmembrane डोमेन में एक संरचनात्मक पुनर्स्थापन हरे (GFP) और लाल (आरएफपी) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक अभिविन्यास में तब्दील हो, intramolecular Förster की क्षमता में वृद्धि अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट). (ख) शेष झिल्ली क्षमता (ऊपरी पैनल) में और विश्लेषित कोशिकाओं (निचले पैनल) में कोशिकाओं में GFP के उत्तेजना पर एक VSFP के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा चित्रित कर रहे हैं । विध्रुवीकरण पर वर्णक्रमीय परिवर्तन स्पष्टता के लिए अतिरंजित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
झल्लाहट क्षमता में परिवर्तन झिल्ली क्षमता के उतार चढ़ाव मिरर एक प्रतिदीप्ति एक छवि अलगानेवाला है, जो लाल और हरे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अलग और उंहें दो आसंन क्षेत्रों पर परियोजनाओं के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged रहे है एक sCMOS कैमरा (चित्रा 2) की चिप । इस सेट अप के साथ, दो अलग तरंग दैर्ध्य बैंड पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एक साथ दर्ज किया जा सकता है, जो एक समय चूक श्रृंखला के हर छवि में झिल्ली की क्षमता को प्रतिबिंबित करने के लिए लाल-से-हरे प्रतिदीप्ति के अनुपात की गणना की अनुमति देता है ।
चित्र 2: इमेजिंग सिस्टम का कॉंफ़िगरेशन । इमेजिंग प्रणाली के प्रमुख घटकों को वोल्टेज के वर्णक्रमीय परिवर्तन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक उच्च लौकिक संकल्प पर झिल्ली संभावित परिवर्तन मिरर चित्रण किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
सीएमएस में VSFP-सीआर की अभिव्यक्ति lentiviral transduction ने हासिल की है. करने के लिए प्रत्यक्ष अभिव्यक्ति के लिए मुख्यमंत्री के उपप्रकार के हित, lentivirus एक प्रवर्तक तत्व ( MLC2v बढ़ाने) है कि विशेष रूप से वेंट्रिकुलर में प्रतिलेखन ड्राइव-iPSC की तरह-सीएमएस10शामिल हैं । जब iPSC-सीएमएस कि अलिंद की तरह, नोडल की तरह है, और वेंट्रिकुलर की तरह कोशिकाओं के मिश्रण का प्रतिनिधित्व इस lentivirus के साथ transduced हैं, VSFP-सीआर केवल वेंट्रिकुलर की तरह कोशिकाओं में व्यक्त की है । ऑप्टिकल कार्रवाई संभावित इमेजिंग के बाद से इस फ्लोरोसेंट संवेदक पर निर्भर करता है, दर्ज की गई कार्रवाई की क्षमता विशेष रूप से ब्याज की मुख्यमंत्री उपप्रकार का प्रतिनिधित्व (चित्रा 3) ।
चित्र 3: उप-प्रकार-विशिष्ट झिल्ली संभावित इमेजिंग के लिए प्रवर्तक-चालित VSFP व्यंजक । (क) इस योजनाबद्ध कैसे cardiomyocyte उपप्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग प्राप्त कर रहे है दिखाता है । (ख) iPSC-सीएमएस वेंट्रिकुलर-विशिष्ट MLC2v-बढ़ाने के नियंत्रण में एक VSFP के साथ संक्रमित दिखाया गया है । वोल्टेज सेंसर की अभिव्यक्ति वेंट्रिकुलर में ही मनाया जाता है-GFP चैनल में सीएमएस की तरह (बाएँ पैनल). चरण कंट्रास्ट (मध्य पैनल) और ओवरले इमेज (दायां पैनल) भी दिए गए हैं । सफ़ेद डॉटेड रेखाएं कक्ष सीमाएं चिह्नित करतीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Protocol
1. इमेजिंग के लिए iPSC-व्युत्पन्न Cardiomyocytes की तैयारी
नोट: iPSC संस्कृति और हृदय विभेद के लिए तरीके12,13,14 से पहले प्रकाशित किया गया है और यहां विस्तार से चर्चा नहीं कर रहे हैं । iPSC की शुद्धि-मैनुअल microdissection, चुंबकीय कोशिका जुदाई, या स्तनपान कराने के चयन द्वारा सीएमएस की सिफारिश की है, भेदभाव प्रोटोकॉल के आधार पर इस्तेमाल किया । निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए, पिटाई क्षेत्रों से microdissected explants, एक monolayer भेदभाव प्रोटोकॉल13का उपयोग कर उत्पंन, एक हृदय भेदभाव के 15 दिन पर ले जाया गया और fibronectin-लेपित प्लेटों पर 30 दिन तक संस्कृति के रूप में वर्णित इससे पहले10.
- सेल संस्कृति मशीन से बाहर ले प्लेटें और मैंयुअल रूप से microcentrifuge ट्यूबों में कार्डियक explants एक २०० µ l पिपेट का उपयोग कर इकट्ठा । अवसादन के बाद, सेल संस्कृति supernatant महाप्राण और धीरे से हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ explants 2x धो लो ।
- अलग कर देना iPSC-सीएमएस collagenase प्रकार द्वितीय जोड़कर (४३० U/एमएल HBSS में) और उंहें ३७ ° c पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- शेष बड़े सेल के झुरमुट के अवसादन के बाद, supernatant कि असंबद्ध एकल iPSC-सीएमएस शामिल है और यह ताजा सेमी रखरखाव एक उच्च भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एकाग्रता (DMEM-F12, 20% FBS, 2 मिमी युक्त से जोड़ने के लिए इकट्ठा L-glutamine, 1:100 मेम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, १०० U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin, और ०.१ mM β-mercaptoethanol).
- यदि बड़े सेल के झुरमुट बने रहें तो पृथक्करण को दोहराएं । एक iPSC-सीएमएस द्वारा ले लीजिए और उंहें सेमी मध्यम में एक कम FBS एकाग्रता (2% FBS) से युक्त resuspend ।
- फिर से बीज एकल iPSC-सीएमएस एक ३.५ सेमी ग्लास-नीचे सेल संस्कृति microdish है कि fibronectin के साथ लेपित किया गया है पर एकल कोशिकाओं के बाद इमेजिंग की अनुमति घनत्व में सेमी (2 µg/ उच्च प्रवाह प्रयोगों में उलझाने से पहले सीडिंग घनत्व को ऑप्टिमाइज़ करें । आमतौर पर, 5 – 10 कार्डियक explants प्रति ३.५ cm डिश पर्याप्त हैं; हालांकि, यह भारी explant आकार और पवित्रता पर निर्भर करता है ।
- संस्कृति एकल iPSC सेमी रखरखाव में उनके पृथक्करण के बाद सीएमएस के लिए 2% FBS से कम ४८ एच के लिए एक पर्याप्त वसूली सुनिश्चित करने के लिए ।
नोट: अगले चरणों में, iPSC-सीएमएस एक VSFP-विशिष्ट MLC2v अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए एक वेंट्रिकुलर बढ़ाने10 के नियंत्रण में GEVI GEVI-CR एंकोडिंग lentivirus के साथ transduced कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, lentiviral GEVI को विशेष रूप से नोडल-या अलिंद-जैसी कक्षों में व्यक्त करने की अनुमति देता है, या बैरे-व्यक्त PGK प्रवर्तक के साथ एक विशिष्ट निर्माण करता है,10का उपयोग किया जा सकता है । Lentiviral plasmids अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।
चेतावनी: lentiviral कणों के साथ काम करते समय, यह सुनिश्चित करें कि काम के माहौल में पर्याप्त रूप से सुरक्षा स्तर है, संभावित संक्रामक एजेंटों के साथ काम करने के लिए सुरक्षा निर्देशों का पालन करें, और आवश्यक सुरक्षा एहतियात बरतें । - lentivirus10युक्त कोशिका संस्कृति supernatant, जो HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित किया गया है के रूप में15से पहले वर्णित के मिश्रण से संक्रमण माध्यम तैयार, सीएमएस रखरखाव माध्यम से (१.३ कदम देखें) एक 1:1 अनुपात में ।
- संक्रमण दक्षता बढ़ाने के लिए 8 µ g/mL के अंतिम एकाग्रता में hexadimethrine ब्रोमाइड जोड़ें ।
नोट: ultracentrifugation के माध्यम से lentivirus के iPSC सेमी पूर्व एकाग्रता की उच्च संक्रमण क्षमता के कारण आम तौर पर आवश्यक नहीं है । - महाप्राण एकल iPSC-सीएमएस से मुख्यमंत्री रखरखाव माध्यम है और यह कदम १.७ और १.८ के दौरान तैयार संक्रमण माध्यम से बदल जाते हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12 एच के लिए संक्रमण के माध्यम में संक्रमित एकल iPSC-सीएमएस संस्कृति । फिर, मध्यम महाप्राण और इसे फिर से बदलें सेमी रखरखाव माध्यम के साथ ।
नोट: GEVI से एक प्रतिदीप्ति संकेत संक्रमण के बाद ४८ एच प्रकट होता है । झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग की एक इमेजिंग की सिफारिश की है, जल्दी में संक्रमण के बाद ७२ ज, एक उचित संकेत शक्ति सुनिश्चित करने के लिए । एकल संक्रमित iPSC-सीएमएस के लिए कम से अधिक 3 सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत किया जा सकता है और क्रमिक छवि । एक इमेजिंग सत्र के दौरान व्यापक photobleaching होती है, तो प्रतिदीप्ति संकेत समय के साथ पुनर्प्राप्त करता है । - इमेजिंग करने से पहले, Tyrode के समाधान के द्वारा कक्ष संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान Ca2 + (१३५ mm NaCl, ५.४ mm KCl, 1 mm MgCl2, 10 mm ग्लूकोज, १.८ mm CaCl2, और 10 mm HEPES; पीएच ७.३५) के साथ पूरक है ।
2. ऑप्टिकल झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग
- एक उल्टे epifluorescence माइक्रोस्कोप एक छवि अलगानेवाला, उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ सुसज्जित के मंच पर iPSC-सीएमएस युक्त इमेजिंग चैंबर प्लेस, और एक कैमरा (जैसे, एक sCMOS कैमरा) उच्च गति इमेजिंग में सक्षम एक उच्च संवेदनशीलता.
नोट: उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप में एक ५०० एनएम लांग पास dichroic मिरर के साथ संयुक्त एक 480/40 एनएम बैंड-पास उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करें, और एक ५६८ एनएम लंबे समय से गुजारें dichroic दर्पण 520/28 एनएम और 630/75 एनएम बैंड के साथ संयुक्त-पास उत्सर्जन फिल्टर छवि अलगानेवाला में । एकल सेल इमेजिंग के लिए, एक उच्च आवर्धन, उच्च संख्यात्मक-एपर्चर तेल विसर्जन उद्देश्य सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करता है । - यदि विद्युत पेसिंग की आवश्यकता है, इमेजिंग चैंबर में पेसिंग इलेक्ट्रोड स्थापित करें और उन्हें एक उत्तेजना जनरेटर से कनेक्ट.
नोट: हम दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड निहित है और ३.५ सेमी ग्लास-नीचे सेल संस्कृति व्यंजन में सज्जित एक पेसिंग इनसेट इस्तेमाल किया । इलेक्ट्रोड के बीच स्थित कक्ष imaged थे । ठेठ पेसिंग पैरामीटर 5 ms की अवधि में आयताकार दालें हैं, एक आयाम के साथ 10 V/cm इलेक्ट्रोड दूरी. - वैकल्पिक रूप से, एक गर्म माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करने के लिए iPSC-सीएमएस के एक स्थिर तापमान इमेजिंग के दौरान, या यहां तक कि एक खुर्दबीन मशीन चैंबर सेट अप सुनिश्चित करने के लिए यदि दीर्घकालिक इमेजिंग करना है ।
- ध्यान केंद्रित करने के लिए कक्षों को लाएं और GEVI को देखने वाले फ़ील्ड के मध्य में अभिव्यक्त करने वाले कक्ष को रखें ।
नोट: यह सबसे आसानी से माइक्रोस्कोप के eyepieces का उपयोग करके किया जाता है एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग (GFP) या एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) फिल्टर GEVI व्यक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सेट. - ऑप्टिकल पथ सेट इतना है कि उत्सर्जित प्रकाश छवि अलगानेवाला के लिए कराई है । एक को माइक्रोस्कोप में फिल्टर घन स्विच छवि अलगानेवाला में फिल्टर के साथ संयुक्त होना करने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें).
- सॉफ्टवेयर में कैमरे को नियंत्रित करने, अधिग्रहण सेटिंग्स सेट ताकि उच्च गति इमेजिंग (जैसे, १०० फ्रेम प्रति सेकंड, 10 ms प्रति फ्रेम की एक जोखिम समय के साथ) संभव है ।
नोट: आमतौर पर, इसमें कैमरा पिक्सल का बिन्नी शामिल होता है (जैसे, कैमरा चिप के 8 x 8 पिक्सल्स को टाइम-चूक फिल्म में एक पिक्सेल जेनरेट करने के लिए बिन्नी हैं) । - निर्माता के निर्देश के अनुसार छवि अलगानेवाला सेट करें । दो दो अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य बैंड का प्रतिनिधित्व छवियों को एक दूसरे के निकट होना चाहिए, प्रत्येक छवि के एक आधे पर कब्जा ।
नोट: यह चरण केवल 1x प्रत्येक इमेजिंग सत्र की शुरुआत में किया जा करने के लिए है । - जांच करें और, यदि आवश्यक हो, कैमरे द्वारा उत्पादित छवि का ध्यान समायोजित ।
- ताकि पिक्सल के किसी भी संतृप्ति से बचा जाता है रोशनी प्रकाश की चमक को समायोजित; यह सबसे आसानी से एक रंग पैलेट जिसमें संतृप्त पिक्सल एक अनूठा रंग द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे है का उपयोग करके किया जा सकता है ।
नोट: इमेजिंग करने से पहले इन सभी तैयारी के दौरान, आवश्यक राशि के लिए उत्तेजना प्रकाश करने के लिए नमूने के जोखिम को सीमित (यानी, समय की विस्तारित अवधि के लिए प्रकाश पर छोड़ नहीं) GEVI के photobleaching से बचने के लिए. - समय श्रृंखला का अधिग्रहण सेट करें (उदा., ५० s की श्रृंखला की अवधि के लिए १०० फ़्रेम में ५,००० छवियां प्रति सेकंड) । कमरे (कंप्यूटर पर नज़र रखता है सहित) में प्रकाश मंद माप को प्रभावित करने आवारा प्रकाश से बचने के लिए । यदि उत्तेजना लाइट शटर इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित नहीं है, यह सिर्फ अधिग्रहण शुरू करने से पहले खोलो ।
- छवि श्रृंखला के अधिग्रहण शुरू करते हैं । यदि विद्युत पेसिंग वांछित है, उचित समय बिंदु पर पेसिंग अनुक्रम शुरू, जब तक यह स्वचालित रूप से इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा शुरू की है । यदि एक औषधीय एजेंट के आवेदन करना चाहता है, यह या तो मैंयुअल रूप से (उदाहरणके लिए, pipetting १०० µ एल द्वारा एक दस गुना अंत एकाग्रता में एजेंट के ९०० µ l युक्त रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए, और धीरे से यह पिपेट के साथ मिश्रण) या एक का उपयोग करके निरंतर प्रवाह छिड़काव प्रणाली ।
- अधिग्रहण समाप्त होने पर, यदि आवश्यक हो तो उत्तेजना लाइट शटर बंद करें । रिकॉर्डिंग को हार्ड ड्राइव पर सहेजें ।
- रिकॉर्डिंग सेटिंग्स छोड़ने (यानी, जोखिम समय, फ्रेम दर, और प्रकाश की तीव्रता) अपरिवर्तित, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की एक रिकॉर्डिंग प्रदर्शन (चरण २.११ के रूप में) coverslip के एक क्षेत्र पर नहीं कोशिकाओं से युक्त या एक से अधिक coverslip जिस पर कोई कोशिकाओं को वरीयता दी गई है ।
नोट: यदि अनुक्रमिक माप अधिग्रहण सेटिंग्स को बदलने के बिना किया जाता है, केवल एक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग इन सभी माप के लिए आवश्यक है । - यदि चाहें, तो अतिरिक्त प्रयोगों (कदम 2.4-2.13) अलग iPSC पर एक ही coverslip पर स्थित सीएमएस करते हैं । ध्यान रखें कि coverslip पर सभी सीएमएस एक दवा लागू किया गया था मामले में प्रभावित हो जाएगा ।
3. विश्लेषण
> ध्यान दें: इमेजिंग सॉफ्टवेयर के आधार पर इस्तेमाल किया (जो आम तौर पर एक मालिकाना सॉफ्टवेयर कैमरा या पूरे प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली के निर्माता द्वारा प्रदान की पैकेज है), यह हासिल छवियों का विश्लेषण आंशिक रूप से प्रदर्शन करने के लिए संभव हो सकता है या यहां तक कि पूरी तरह से इस सॉफ्टवेयर पैकेज के भीतर । हालांकि, यहां छवि विश्लेषण के एक कार्यप्रवाह है कि खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है (यानी, छवि विश्लेषण मंच ImageJ)16, जो आसानी से इस तरह के रूप में एक वितरण का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है फिजी17, और के लिए आर पैकेज सांख्यिकीय कंप्यूटिंग18 वर्णित हैं । संक्षेप में, ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) कोशिकाओं या पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व ImageJ में तैयार कर रहे हैं, और समय के साथ इन ROIs में मतलब प्रतिदीप्ति एक फ़ाइल को निर्यात किया जाता है, तो, आगे आर में विश्लेषण या, वैकल्पिक रूप से, स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के साथ ।
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, सहेजें या निर्यात की छवि समय श्रृंखला (दोनों कोशिकाओं और इसी पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग युक्त रिकॉर्डिंग) एक प्रारूप करने के लिए (जैसे, TIF) कि ImageJ द्वारा पढ़ा जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, का उपयोग करें (https://imagej.net/Bio-Formats), जो imagej सक्षम करने के लिए इमेजिंग प्रणाली निर्माताओं के विभिंन ब्रांडों से मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों पढ़ने के लिए दिनचर्या प्रदान करता है ।
नोट: निंन चरण माने है कि इमेजिंग अंतराल रिकॉर्डिंग के दौरान समान हैं । यदि यह मामला नहीं है, यह इमेजिंग सॉफ्टवेयर से समय जानकारी निर्यात और आगे विश्लेषण में शामिल करने के लिए आवश्यक हो सकता है । - TIF स्टैक ImageJ में कक्षों वाले खोलें ।
- लाल चैनल में एक फ्लोरोसेंट cardiomyocyte पर रॉय आकर्षित करने के लिए मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि roi काफी बड़ा है, ताकि सेल अनुबंध करते समय roi से बाहर न चले.
- रॉय प्रबंधक प्लगइन खोलें ('विश्लेषण । उपकरण । रॉय प्रबंधक ') और प्रेस ' जोड़ें [टी] ' बटन ROI1 के रूप में इस रॉय को जोड़ने के लिए ।
- रॉय को ग्रीन चैनल में एक ही सेल पर ड्रैग करें और इस roi को ROI2 के रूप में जोड़ें.
- ' में विश्लेषण । माप सेट करें ' मेनू, ' मतलब ग्रे मूल्य 'के अलावा सभी विकल्पों का चयन करें ।
नोट: यह एक ImageJ सत्र में ही 1x किया जाना है । - रॉय प्रबंधक में, प्रेस ' अधिक । बहु माप ' बटन । चुनें ' सभी स्लाइसें माप ' और ' एक टुकड़ा प्रति पंक्ति ' विकल्प और प्रेस ' ठीक '। एक खिड़की तीन पंक्तियों के साथ एक स्प्रेडशीट (स्लाइस संख्या और दो ROIs में लाल और हरे चैनल में कक्ष का प्रतिनिधित्व करने का मतलब प्रतिदीप्ति, क्रमशः) खुल जाता है ।
- ' का प्रयोग करें फ़ाइल । इस रूप में सहेजें ' स्प्रेडशीट को कॉमा सेपरेटेड वैल्यू (CSV) फ़ाइल में सहेजें ।
- छवि स्टैक और ROI प्रबंधक विंडो बंद किए बिना स्प्रेडशीट विंडो के साथ विंडो को बंद करें । पृष्ठभूमि माप वाली TIF स्टैक खोलें ।
- रॉय प्रबंधक में, प्रेस ' अधिक । बहु माप' बटन । चुनें ' सभी स्लाइसें माप ' और ' एक टुकड़ा प्रति पंक्ति ' विकल्प और प्रेस ' ठीक '।
- ' का प्रयोग करें फ़ाइल । इस रूप में सहेजें ' स्प्रेडशीट को पृष्ठभूमि डेटा के साथ अंय CSV फ़ाइल में सहेजने के लिए ।
नोट: निंनलिखित गणना स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है । हम आर सॉफ्टवेयर18का इस्तेमाल किया । एक साधारण उदाहरण स्क्रिप्ट है कि फ़ाइलों से सेल और पृष्ठभूमि डेटा पढ़ता है "cell. csv" और "बैकग्राउंड. csv" गणना करता है, और भूखंडों झिल्ली संभावित संकेत के समय पाठ्यक्रम अनुपूरक कोड फ़ाइल 1के रूप में प्रदान की जाती है । - पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग से, लाल रंग में और हरे चैनल में औसत तीव्रता की गणना । क्रमशः पृष्ठभूमि-सही आरएफपी और GFP संकेतों की गणना करने के लिए लाल और हरे चैनल में सेल का प्रतिनिधित्व करने वाले संकेतों से इस पृष्ठभूमि संकेत घटाना ।
- झिल्ली की क्षमता के लिए एक किराए के रूप में, आरएफपी अनुपात की गणना/GFP ।
नोट: यह अनुपात क्वांटिटी है. वैकल्पिक रूप से, यह अपने प्रारंभिक मूल्य के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है (यानी, ΔR/ महत्वपूर्ण बात, उपयोगी जानकारी लौकिक परिवर्तन में निहित है बजाय इस अनुपात के निरपेक्ष मूल्यों में । GFP और आरएफपी के असमान photobleaching के कारण, इस अनुपात में एक आधारभूत बहाव हो सकता है. यदि आवश्यक हो, तो इस तरह के एक आधारभूत बहाव एक आधारभूत वक्र का निर्माण और आरएफपी/GFP अनुपात10से इसे घटाकर द्वारा ठीक किया जा सकता है ।
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Representative Results
चित्रा 4aमें, एक प्रतिनिधि एकल iPSC-मुख्यमंत्री आरएफपी (बाईं ओर) और GFP (दाईं ओर) चैनल में इमेजिंग विश्लेषण के दौरान खींचा रॉय अंकन सफेद बिंदीदार लाइनों के साथ चित्रित किया है. आरएफपी चैनल से संकेत प्रत्येक कार्रवाई की क्षमता (चित्रा 4b, ऊपरी पैनल) के दौरान फ्लोरोसेंट तीव्रता में एक आवधिक वृद्धि से पता चलता है । जैसा कि परिचय में वर्णित है, यह झिल्ली की क्षमता में परिवर्तन की वजह से एक बढ़ती हुई झल्लाहट की वजह से है (चित्रा 1). Concordantly, GFP संकेत फ्लोरोसेंट तीव्रता में एक आवधिक कमी (चित्रा 4b, मध्य पैनल) से पता चलता है । आरएफपी/GFP अनुपात (फिगर 4b, लोअर पैनल) इस तरह के APD५० और APD९० माप के रूप में बहाव विश्लेषण, में इस्तेमाल जैविक संकेत है । इस विधि का उपयोग कर, 30-दिवसीय वेंट्रिकुलर-iPSC-सीएमएस की तरह ०.५ हर्ट्ज पर paced एक मतलब APD५० दिखाया (कार्रवाई की क्षमता की शुरुआत से अवधि तक ध्रुवीकरण ४३९ ms (± ४६ एमएस) के ५०% से पूरा हो गया है और एक मतलब APD९० (अवधि जब तक पुनर्ध्रुवीकरण ५२० ms (± ४७ ms) (figure 4c) का ९०%) तक पूरा हो गया है ।
चित्रा 4: छवि विश्लेषण और बुनियादी कार्रवाई संभावित विशेषताओं के सिद्धांतों । (क) इसके साथ ही दर्ज आरएफपी (दाईं ओर) और GFP (लेफ्ट साइड) प्रतिदीप्ति के एक-एक iPSC-CM को दिखाया गया है. सफ़ेद डॉटेड रेखाएं इमेजिंग विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए ब्याज (ROI) क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करती हैं । (b) रॉय से व्युत्पंन पृष्ठभूमि-सही आरएफपी, GFP, और आरएफपी/GFP संकेतों के कच्चे निशान दिखाए जाते हैं । (ग) कमरे के तापमान पर और ०.५ हर्ट्ज पेसिंग के साथ एक वेंट्रिकुलर की तरह iPSC-सीएमएस के APD९० और APD५० के अर्थ और SEM दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
को प्रदर्शित करने के लिए कि विधि भी कार्रवाई संभावित अवधि में परिवर्तन पर कब्जा करने में सक्षम है, iPSC-सीएमएस विद्युत उत्तेजना बढ़ रही ०.४ से २.५ हर्ट्ज दर, हर पांच धड़कता (आंकड़ा 5) को बढ़ाने पर उत्तेजित थे । एक ठेठ ऑप्टिकली दर्ज की झिल्ली एक iPSC से संभावित संकेत-सेमी चित्रा 5में दिखाया गया है । प्रत्येक पिटाई की दर पर पहले चार कार्रवाई क्षमता औसत थे, वृद्धि की धड़कन दर (चित्रा 5b) पर कार्रवाई की क्षमता का एक प्रगतिशील छोटा प्रदर्शन । बाद में paced धड़क रहा औसत ऑप्टिकली दर्ज की कार्रवाई क्षमता10करने के लिए निहित शोर को कम करने का एक प्रभावी तरीका है. यह है कि हम प्रत्येक पेसिंग दर पर केवल पांच धड़कता है, जो संतुलन तक पहुंचने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है के लिए सेल paced, यह देखते हुए कि चित्रण प्रयोग संभव दर निर्भर कार्रवाई संभावित छोटा की पूरी राशि पर कब्जा नहीं हो सकता है उल्लेख किया जाना चाहिए ।
चित्रा 5: कार्रवाई संभावित अवधि पर पेसिंग आवृत्ति का प्रभाव । (क) एक iPSC-सेमी ०.४ से २.५ हर्ट्ज के रूप में संकेत (एकल विद्युत पेसिंग दालों तीर द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं) को लेकर बढ़ती आवृत्तियों पर paced था. (ख) प्रत्येक पेसिंग आवृत्ति के लिए, एक औसत एपी इस आवृत्ति पर पहले चार एपीएस से गणना की गई थी । औसत ए पी ए ओवरले के रूप में रची जाती है, पेसिंग दरों में वृद्धि के साथ छोटा एपी का प्रदर्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
विधि भी iPSC-सीएमएस (चित्रा 6) के लिए लागू दवाओं के electrophysiological प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, isoproterenol, एक गैर चयनात्मक β-adrenoreceptor एगोनिस्ट, अनायास की धड़कन iPSC-सीएमएस के रूप में संकेत दिया, धड़कन दर (चित्रा 6a) में एक त्वरित वृद्धि करने के लिए अग्रणी लागू किया गया था । एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र iPSC की धड़कन आवृत्ति पर अलग Isoproterenol सांद्रता का असर दिखा-सीएमएस चित्रा घमण्डमें दिखाया गया है ।
चित्रा 6: धड़कन आवृत्ति पर isoproterenol का प्रभाव. (क) प्रतिनिधि रॉ ऑप्टिकल कार्रवाई की संभावित अनुरेखण एक सहज-पिटाई एकल iPSC-सेमी दिखाया गया है । Isoproterenol (1 µ एम के अंतिम एकाग्रता के साथ) के रूप में बार द्वारा संकेत दिया iPSC-सीएमएस के लिए जोड़ा गया था । (ख) इस खुराक-प्रतिक्रिया वक्र iPSC-सीएमएस की धड़कन आवृत्ति पर अलग isoproterenol सांद्रता के प्रभाव से पता चलता है. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
विधि यहां वर्णित एक विशिष्ट उप प्रकार से ए पी एस के एक ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग (यानी, वेंट्रिकुलर कोशिकाओं की तरह) मानव iPSCs से उत्पंन सीएमएस के सक्षम बनाता है । मानव iPSC-सीएमएस एक उभरते उपकरण के लिए जैविक और चिकित्सा समस्याओं की एक विशाल विविधता का पता है, और अलग सेमी उपप्रकार के भेदभाव प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता का एक महत्वपूर्ण स्रोत है । विशिष्ट प्रमोटर तत्वों का उपयोग करके, एक GEVI की अभिव्यक्ति विशेष रूप से ब्याज की उपप्रकार का प्रतिनिधित्व सीएमएस में हासिल की है, जो तो ऑप्टिकल छवि है ।
एकल iPSC से ए पी एस के सफल अधिग्रहण-सीएमएस पृथक्करण के बाद पुनर्बीज घनत्व पर निर्भर करता है । यदि कोशिकाओं को भी घने बीज है, यह समय लेने के लिए अलग एकल iPSC-सीएमएस कि एक विद्युत syncytium का हिस्सा नहीं है मिल रहा है । हालांकि, बहुत-कम सीडिंग घनत्व नकारात्मक कोशिकाओं के अस्तित्व को प्रभावित करते हैं । इस प्रकार, विभिंन सीडिंग घनत्व के एक व्यवस्थित परीक्षण की सिफारिश की है, विशेष रूप से प्रयोगों है कि उच्च प्रवाह इमेजिंग पर निर्भर कर रहे है में उलझाने से पहले ।
छवि अधिग्रहण के दौरान, VSFP बहोत photobleaching है, जो कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, विशेष रूप से अब प्रयोगों के दौरान । यदि रैपिड photobleaching प्रयोग के दौरान मौजूद है, कृपया सुनिश्चित करें कि उत्तेजना प्रकाश शटर केवल छवि अधिग्रहण के दौरान या आवश्यक तैयारी चरणों के दौरान खोला गया है (के लिए खोज और VSFP-व्यक्त कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित), जो होना चाहिए जितनी जल्दी हो सके प्रदर्शन किया । इसके अलावा, उत्तेजना प्रकाश की शक्ति कम आवश्यक ंयूनतम राशि के लिए और उच्च संवेदनशीलता छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल कैमरे के गतिशील रेंज का उपयोग करें ।
जब छवि विश्लेषण के दौरान रॉय ड्राइंग, पता है कि iPSC-सीएमएस संकुचन के दौरान कदम और छवि ढेर के सभी छवियों में रॉय के भीतर रहना चाहिए । VSFP की ratiometric प्रकृति के कारण, रॉय से बाहर सेल के किसी भी आंदोलन कृत्रिम संकेतों के लिए नेतृत्व नहीं करता है, लेकिन नकारात्मक संकेत गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है । हालांकि, ROIs है कि बहुत बड़े है और अनावश्यक रूप से बड़े गैर संकेत उत्पादक क्षेत्रों में भी नकारात्मक संकेत-शोर अनुपात को प्रभावित और बचना चाहिए शामिल हैं ।
प्रतिनिधि परिणामके लिए, विभेदित iPSC-सीएमएस कि एक हृदय प्रेरण उपयोग किया गया है के बाद कम से कम 30 दिनों के लिए परिपक्व करने के लिए अनुमति दी गई है । परिपक्वता की इस अवधि के बाद, अलग सेमी उपप्रकार, जैसे कि नोडल-, अलिंद-, या वेंट्रिकुलर-की तरह कोशिकाओं प्रतिष्ठित किया जा सकता है । इन कोशिकाओं को अभी भी अपरिपक्व है और केवल एक भ्रूण की तरह phenotype दो में पहुंच-आयामी (2-डी) संस्कृति प्रणालियों विद्युत गुणों को प्रभावित करने के साथ ही कैल्शियम से निपटने के19। iPSC के इन सामांय सीमाओं-सीएमएस पर विचार करने की जरूरत है, क्योंकि वे प्रयोगात्मक कार्रवाई क्षमता को मापने के लिए इस्तेमाल विधि से स्वतंत्र परिणाम मिल सकता है । अधिक उंनत तीन आयामी (3-डी) संस्कृति प्रणालियों आगे परिपक्वता20की ओर आशाजनक परिणाम दिखाई है, और विधि यहां वर्णित इस संदर्भ में मूल्यवान हो सकता है ।
iPSC-सीएमएस के ए पी एस मापने के लिए वर्तमान सोने के मानक पैच दबाना रिकॉर्डिंग है, जो अलग एपी विशेषताओं का एक बहुत विस्तृत विश्लेषण की अनुमति है और यहां तक कि एकल आयन चैनल धाराओं को मापने में सक्षम बनाता है । इसके अलावा, निरपेक्ष मूल्यों (जैसे, आराम झिल्ली की क्षमता) मापा जा सकता है । इसके विपरीत, ऑप्टिकल एपी रिकॉर्डिंग झिल्ली की क्षमता के सापेक्ष परिवर्तन पर आधारित हैं । VSFP के अपेक्षाकृत धीमी आंतरिक कैनेटीक्स के कारण, इस तरह के "overshoot" के रूप में कुछ एपी विशेषताओं, रीडिंग से कुंद किया जा सकता है, और एपी स्ट्रोक वेग के रूप में तेजी से सुविधाओं के एक सार्थक quantitation, संभव नहीं है. हालांकि, एक ठेठ प्रयोगात्मक सेट अप में, निरपेक्ष मूल्यों नहीं है, लेकिन मूल्यों में अंतर (जैसे, अलग सेल लाइनों के बीच या पहले और एक दवा के आवेदन के बाद) मापा जाता है । यह मज़बूती से एपी अवधि की तरह विशेषताओं के लिए इस पांडुलिपि में वर्णित ऑप्टिकल विधि के साथप्राप्त किया जा सकता है (जैसे, APD९० या APD५०) या पिटाई की दर, एक बहुत अधिक प्रवाह के साथ के रूप में पैच क्लैंप 10 की तुलना में . इसके अलावा, इस प्रौद्योगिकी के गैर इनवेसिव प्रकृति10समय के साथ एक ही सेल के कई माप की अनुमति देता है । इस प्रकार, ऑप्टिकल एपी रिकॉर्डिंग और पैच दबाना पूरक उपकरण के रूप में विचार किया जाना चाहिए और प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर इस्तेमाल किया है कि जवाब देने की जरूरत है ।
ऑप्टिकल एपी रिकॉर्डिंग या तो एक GEVI की अभिव्यक्ति द्वारा या एक potentiometric फ्लोरोसेंट डाई (जैसे, di-8-ANEPPs)21के आवेदन द्वारा हासिल किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट रंजक आमतौर पर अधिक अनुकूल प्रतिदीप्ति कैनेटीक्स है, लेकिन cardiomyocytes के एक निश्चित उपप्रकार के लिए निर्देशित नहीं किया जा सकता है के रूप में वे आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग नहीं हैं । विभिन्ना ऑपरेटिंग सिद्धांतों के आधार पर GEVIs की संख्या२२विकसित की गई है. इधर, झल्लाहट आधारित GEVI VSFP-सीआर11 का उपयोग किया जाता है । इस विकल्प का प्रमुख कारण यह सूचक है, जो लाल रंग में वृद्धि के साथ सेलुलर ध्रुवीकरण के प्रति प्रतिक्रिया करता है और हरे रंग की प्रतिदीप्ति में कमी अगर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्साहित है की ratiometric प्रकृति था । यह कार्डियोलोजी के क्षेत्र में लाभप्रद है क्योंकि इस तरह के एक ratiometric संकेतक कम संकेतकों से cardiomyocytes के संकुचन की वजह से सेल आंदोलनों की वजह से कलाकृतियों के लिए अतिसंवेदनशील है कि केवल एक परिवर्तन के द्वारा ध्रुवीकरण के लिए प्रतिक्रिया प्रतिदीप्ति तीव्रता.
जबकि केवल MLC2v बढ़ाने का उपयोग कर वेंट्रिकुलर-जैसे iPSC-सीएमएस लक्ष्यीकरण प्रयोगों से परिणाम यहां प्रस्तुत कर रहे हैं, यह भी लक्ष्य अलिंद-या सेमी अलग उप प्रकार विशिष्ट प्रमोटर तत्वों का उपयोग कर10की तरह संभव है । विस्तार में विधि का वर्णन करने के लिए, इस पांडुलिपि इमेजिंग एकल iPSC पर ध्यान केंद्रित-सीएमएस कि एक गिलास coverslip पर वरीयता प्राप्त किया गया है, के रूप में यह एकल कोशिकाओं के एपी गुणों के विश्लेषण में सक्षम बनाता है और उच्चतम संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्रदान करता है । हालांकि, इस प्रौद्योगिकी भी सीएमएस के इमेजिंग कि एक विद्युत syncytium या एक 3-डी संरचना में अंय कोशिकाओं के साथ एकीकृत कर रहे है सक्षम बनाता है । यह 3 डी सेल संस्कृति मॉडल के रूप में विशेष रुचि का है तेजी से इस्तेमाल कर रहे है और 2 से अलग गुण प्रदान दिखाया गया है-डी मॉडल20। इमेजिंग सेट अप और ROIs की परिभाषा के आधार पर, ऑप्टिकल संकेतों 3-डी ऊतक के बड़े क्षेत्रों से या ऊतक के भीतर एकल कोशिकाओं से विश्लेषण किया जा सकता है । इसके अलावा, कई कोशिकाओं को एक साथ imaged जा सकता है और अलग से विश्लेषण, प्रवाह में काफी वृद्धि के लिए अग्रणी ।
एक साथ ले लिया, यहां प्रस्तुत विधि अतालता के लिए iPSC-सीएमएस के रैपिड ऑप्टिकल phenotyping को सक्षम करने से अतालता अनुसंधान के क्षेत्र में iPSC-सीएमएस की प्रयोज्यता में सुधार कर सकते है phenotypes के लिए
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एसआई 1747/1-1), और Kröner-Fresenius-Stiftung, और ड्यूश Stiftung फर Herzforschung से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
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