Summary
在这里, 我们提出了一种光学图像动作电位的方法, 特别是在心室样诱导多潜能干细胞衍生心肌细胞。该方法基于对电压敏感的荧光蛋白的启动子驱动表达式。
Abstract
由人类诱导的多潜能干细胞 (iPSC CMs) 产生的心肌细胞是心血管研究的新兴工具。目前的分化协议所产生的 iPSC-CMs, 与其说是同质的细胞群, 不如说是细胞与心室、心房和结节样表型的混合体, 这就复杂了对表型的分析。本文提出了一种从心室样 iPSC-CMs 的光学记录动作电位的方法。这是通过慢病毒载体转导与一个结构, 其中一个基因编码的电压指示器是在一个心室特定的启动子元素的控制。当 iPSC CMs 与此构造转基因时, 电压传感器只表达在心室样细胞中, 使用时间失效荧光显微镜使亚型特定的光学膜电位记录得以实现。
Introduction
由诱导多能干细胞 (iPSCs) 衍生的心肌细胞 (CMs) 是一种新的工具, 用于解剖心脏疾病的分子机制, 研究新的治疗方法, 并筛查1、2 的不良心脏药物效应。,3。从一开始, 致心律失常疾病如 channelopathies 已经成为这个研究领域的一个重要的焦点4。因此, 研究 CMs 电子表型的方法, 如心律失常或动作电位 (AP) 形态的变化, 是该技术的核心。
在应用 iPSC CMs 的一个重要的考虑是, 目前的心脏分化协议并没有导致细胞的同源种群。相反, 它们是在不同的成熟度5,6,7,8, 类似窦房结, 心房和心室 CMs 的细胞的混合物。这种异质性可能是实验变异性的相关来源, 特别是如果研究了 AP 持续时间 (apd) 的参数, 这在 CM 亚型 (例如, 在心房的 APD 比心室 CMs 短)。解决这一问题的常规方法是使用膜片钳方法调查单个 iPSC CMs, 并根据 AP 形态学9将每个细胞分类为节、心房或心室状。随后的任何分析都可以限制为表示感兴趣的 CM 子类型的单元格。该策略的主要缺点是其吞吐量有限, 且缺乏可伸缩性。而且, 膜片钳电生理学的侵入性不允许在延长的时间段内按顺序对同一细胞进行成像。
在这里, 我们提供的实验细节的方法10发展到光学图像 ap 的特定亚型 iPSC CMs。这克服了亚型异质性的问题, 大大增加了与传统方法相比的吞吐量, 允许快速分型 iPSC CMs 携带遗传变种或接触到药理制剂。
亚型特定光学成像方法综述
一种基因编码的电压指示器 (GEVI), 其荧光特性在细胞膜的退极化和复极化上发生变化, 用于 CMs 膜电位的光学图像变化。GEVI 在这里应用的是电压传感荧光蛋白 VSFP-CR11, 它包括一个电压传感跨膜领域融合到一对绿色 (三叶草) 和红色 (mRuby2) 荧光蛋白 (图 1A)。由于两个显影的接近, 绿色荧光蛋白的激发会导致激发能量的一小部分通过Förster 共振能量转移 (烦恼) 转移到红色荧光蛋白中。因此, 绿色荧光蛋白的激发导致了绿色和红色荧光蛋白的排放 (图 1A, 上部板)。当细胞 depolarizes 时, 电压传感器的结构重排发生转化为两种荧光蛋白的重新定位, 提高了烦恼的效率。因此, 更多的励磁能量从绿色转移到红色荧光蛋白 (图 1A, 下板)。因此, 在偏振光细胞中, 绿色荧光发射是变暗, 红色荧光发射比在静止膜电位下的细胞更亮 (图 1B)。
图 1: VSFP 膜电位的光学成像.(a) 显示了一种描述电压敏感荧光蛋白 VSFP 的作用的示意图。在细胞膜的退极化后, 电压传感跨膜领域的结构重排转化为绿色 (GFP) 和红色 (RFP) 荧光蛋白的重新定位, 提高分子内 Förster 的效率。共振能量传递 (烦恼)。(B) 描述了 VSFP 在静止膜电位 (上板) 和偏振光细胞 (下板) 的细胞中激发 GFP 的发射光谱。在退极化时的光谱变化被夸大为清晰。请单击此处查看此图的较大版本.
在焦虑效率的变化, 镜像的波动, 膜电位的影像是使用一个荧光显微镜配备了图像分配器, 分离红色和绿色的荧光排放, 并将其投射到两个相邻的区域sCMOS 相机的芯片 (图 2)。利用这一设置, 可以同时记录两个不同波长波段的荧光发射量, 从而能够计算出一个时间序列的每一个图像中的红-绿荧光比值来反映膜电位。
图 2: 成像系统的配置.描述了成像系统的主要组成部分, 用于图像的电压敏感荧光蛋白的光谱变化镜像的薄膜电位变化的高时间分辨率。请单击此处查看此图的较大版本.
慢病毒载体转导实现了 VSFP 在 CMs 中的表达。为了直接表达对 CM 亚型的兴趣, 慢病毒北疆包含一个启动器元素 ( MLC2v增强), 特别推动转录在心室样 iPSC-CMs10。当 iPSC-CMs, 代表心房样, 节样, 和心室样细胞的混合转基因与此慢病毒北疆, VSFP CR 只表达在心室样细胞。由于光学动作电位成像依赖于这种荧光传感器, 记录的动作电位完全代表了 CM 亚型的兴趣 (图 3)。
图 3: 用于子类型特定的膜电位成像的启动子驱动的 VSFP 表达式.(a) 这个示意图显示了心肌细胞亚型特定的光学动作电位记录是如何实现的。(b) VSFP 在心室特异 MLC2v-enhancer 控制下感染 iPSC 的 CMs。电压传感器的表达仅观察到 GFP 通道中的心室样 CMs (左面板)。还提供了相位对比度 (中间板) 和叠加图像 (右面板)。白色虚线标记单元格边界。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. iPSC 心肌细胞成像的制备
注: 在12、13、14之前已经公布了 iPSC 培养和心脏分化的方法, 并没有详细讨论。采用人工显微切割、磁性细胞分离或乳酸选择的方法纯化 iPSC CMs, 这取决于所使用的鉴别协议。对于以下的协议, microdissected 外植体从殴打地区, 产生使用单层分化协议13, 被采取在15天的心脏分化和培养, 直到30天的纤维粘连蛋白涂层板, 如所述在10之前。
- 将细胞培养皿从孵化器中取出, 用200µL 吸管手动将心脏外植体收集到离心管中。沉淀后, 吸入细胞培养上清液, 用汉克平衡盐溶液 (HBSS) 轻轻冲洗外植体2x。
- 游离 iPSC-CMs, 加入胶原酶 II 型 (430 U/毫升在 HBSS) 和孵化他们在37°c 30 分钟。
- 在剩余的大细胞团簇沉淀后, 收集含有分离的单 iPSC CMs 的上清液, 并将其添加到含有高胎牛血清浓度 (DMEM-F12, 20%, 2 毫米的新鲜 CM 维持培养基中)。l-谷氨酰胺, 1:100 的非必需氨基酸, 100 毫升青霉素-链霉素, 0.1 毫米β巯基乙醇)。
- 重复分离, 如果大细胞团簇保持。用离心法收集单 iPSC-CMs, 并将其并用重悬在含有低血清浓度 (2% 血清) 的 CM 培养基中。
- 重新种子单 iPSC-CMs 在密度允许随后成像的单细胞在3.5 厘米的玻璃底部细胞培养 microdish, 已经涂上纤维连接蛋白 (2 µg/cm2)。在进行高通量实验之前, 优化播种密度。通常, 每 3.5 cm 菜5–10心脏外植体是充足的;然而, 这很大程度上取决于外植体的大小和纯度。
- 培养单 iPSC-CMs 后, 其离解在 CM 维护培养基中含有2% 的血清至少48小时, 以确保足够的恢复。
注意: 在接下来的步骤中, iPSC CMs 是转基因与慢病毒北疆编码 GEVI VSFP 增强10的控制下, 以达到心室特定的 MLC2v 表达式。或者, 慢病毒载体构造允许表达 GEVI 特别是在结节或心房样细胞, 或一个不特异的结构窝藏无所不在表达 PGK 启动子, 可使用10。慢病毒载体质粒可根据要求提供。
注意: 使用慢病毒载体粒子时, 确保工作环境具有足够的生物安全水平, 遵守与潜在感染性药物合作的安全指示, 并采取必要的安全措施。 - 通过混合慢病毒北疆10-含细胞培养的上清液, 制备感染培养基, HEK293 细胞中所述的15, 与 CMs 维护培养基 (见步骤 1.3) 在1:1 的比例。
- 在最终浓度为8µg/毫升的铵中加入溴化铵, 以提高感染的效率。
注意: 由于 iPSC-CMs 的高感染效率, 慢病毒北疆通过离心的事先集中通常是不必要的。 - 从单 iPSC CMs 中吸取 CM 维护介质, 并将其替换为步骤1.7 和1.8 中准备的感染介质。培养被传染的单一 iPSC-CMs 在传染媒介12小时在37°c。然后, 吸入培养基, 再用 CM 维护培养基替换。
注: GEVI 的荧光信号在感染后出现48小时。推荐一种膜电位记录的影像, 最早感染后72小时, 以确保信号强度正确。单一感染 iPSC-CMs 可以培养至少3周, 并按顺序进行成像。如果在成像会话期间发生广泛的漂白, 则荧光信号会随着时间的推移而恢复。 - 成像前, 用 Tyrode 溶液交换细胞培养基, 辅以钙2 + (135 毫米氯化钠, 5.4 毫米氯化钾, 1 毫米氯化镁2, 10 毫米葡萄糖, 1.8 毫米 CaCl2, 10 毫米 HEPES; pH 7.35)。
2. 光学膜电位记录
- 将包含 iPSC CMs 的成像室放置在倒置荧光显微镜的舞台上, 配有图像分配器、适当的过滤器集和照相机 (例如, sCMOS 相机), 能够高速成像灵敏度。
注: 例如, 在显微镜中使用 480/40 nm 带通励磁过滤器和 500 nm 长通分色镜, 以及 568 nm 长通分色镜与 520/28 nm 和 630/75 nm 带通发射过滤器结合在图像分配器中。对于单细胞成像, 高放大、高数值孔径的油浸泡目标提供了最佳的信噪比。 - 如果需要电起搏, 在成像室安装起搏电极, 并将其连接到刺激发生器。
注: 我们使用了一个起搏插入, 其中包含两个铂电极和安装在3.5 厘米的玻璃底部细胞培养皿。位于电极之间的细胞被成像。典型的起搏参数为长度为5毫秒的矩形脉冲, 振幅为10伏/厘米的电极距离。 - 或者, 使用一个加热的显微镜阶段, 以确保在成像期间 iPSC-CMs 的稳定温度, 甚至显微镜孵化室设置, 如果长期成像是有意的。
- 使单元格集中, 并将单元格表达 GEVI 到查看字段的中心。
注意: 通过使用绿色荧光蛋白 (GFP) 或红色荧光蛋白 (RFP) 过滤器来识别表达 GEVI 的细胞, 这是最方便的目镜。 - 设置光学路径, 使发出的光被路由到图像拆分器。将显微镜中的过滤器立方体切换到要与图像分配器中的滤镜相结合的滤镜 (见材料表)。
- 在控制摄像机的软件中, 设置采集设置, 以便高速成像 (如每秒100帧, 每帧10毫秒的曝光时间) 是可能的。
注意: 通常, 这涉及到相机像素的 binning (例如, 8 x 8 像素的相机芯片是作废生成一个像素的时间推移电影)。 - 根据制造商的指示设置图像拆分器。两个代表两个不同发射波长波段的图像应该是相邻的, 每一个都占据图像的一半。
注意: 此步骤必须在每个映像会话开始时仅执行1x。 - 检查, 如有必要, 调整相机产生的图像的焦点。
- 调整光照光的亮度, 以避免像素的任何饱和度;这可以最容易地通过使用调色板, 其中饱和像素代表了独特的颜色。
注: 在成像前的所有准备工作中, 将样品的曝光量限制在激发光到必要的数量 (即, 不要留在长时间的光), 以避免漂白的 GEVI。 - 设定时间序列的承购 (例如, 5000 张图片在100帧每秒在五十年代的系列期间)。把房间里的光线调暗 (包括电脑显示器), 以避免影响测量的杂散光。如果励磁光快门不受成像软件控制, 则在开始采集之前先打开它。
- 开始获取图像系列。如果需要电起搏, 则在适当的时间点启动起搏序列, 除非图像软件自动启动。如果需要药理剂的应用, 请手动 (例如, 通过吹打100µL 的混合剂, 在一个有900µL 缓冲的记录室, 并与吸管轻轻混合) 或使用恒流灌注系统。
- 当采集完成后, 必要时关闭励磁灯快门。将录制保存到硬盘驱动器。
- 将录制设置 (即曝光时间、帧速率和光照强度) 保持不变, 请在不包含单元格的盖玻片区域或另一盖玻片上执行背景荧光 (如步骤 2.11) 的记录, 而不细胞被播种了。
注意: 如果在不改变采集设置的情况下执行顺序测量, 那么所有这些测量只需要一个背景荧光记录。 - 如果需要, 对位于同一盖玻片上的不同 iPSC CMs 执行额外的实验 (步骤 2.4–2.13)。注意, 盖玻片上的所有 CMs 都会受到影响, 以防药物被应用。
3. 分析
> 注意: 根据所使用的成像软件 (通常是由相机制造商或整个荧光成像系统提供的专有软件包), 可能对获得的图像进行部分或甚至完全在这个软件包内。然而, 这里有一个可以用开源软件 (即图像分析平台 ImageJ)16进行的图像分析工作流, 可以方便地使用诸如斐济17这样的分发程序进行安装, 而 R 包用于描述了统计计算18 。简言之, 在 ImageJ 中绘制了表示单元格或背景的感兴趣区域 (ROIs), 随着时间的推移, 这些 ROIs 中的平均荧光将导出到一个文件中, 然后, 在 R 中或以电子表格软件进行进一步分析。
- 在成像软件中, 将获取的图像时间序列 (包含单元格的记录和相应的背景录制) 保存或导出为可由 ImageJ 读取的格式 (例如TIF)。或者, 使用 BioFormats 插件 (https://imagej.net/Bio-Formats), 它提供了允许 imagej 从不同品牌的成像系统制造商那里读取专有文件格式的例程。
注意: 以下步骤假定整个录制中的成像间隔是相同的。如果情况并非如此, 则可能需要从图像软件中导出计时信息, 并将其包括在进一步分析中。 - 打开包含 ImageJ 中单元格的 TIF 堆栈。
- 使用手绘选择工具可以在红色通道中的荧光心肌细胞上绘制 ROI。确保 roi 足够大, 以便在收缩时单元格不会移出 roi。
- 打开 ROI 管理器插件 ('分析 |工具 |roi 管理器 '), 然后按"添加 [t]"按钮将此 ROI 添加为 ROI1。
- 将 roi 拖到绿色通道中的同一单元格中, 并将此 roi 添加为 ROI2。
- 在"分析 |设置测量 "菜单, 取消选择除" 平均灰度值 "以外的所有选项。
注意: 这必须在 ImageJ 会话中进行1x。 - 在 ROI 管理器中, 按"更多 |多项措施 "按钮。选择"测量所有切片"和"每个切片的一行" 选项, 然后按"确定"。打开一个窗口, 其中包含三行的电子表格 (在两个 ROIs 中分别表示红色和绿色通道中的单元格的切片数和平均值荧光)。
- 使用"文件 |另存为 ""以将电子表格保存为逗号分隔值 (CSV) 文件。
- 在不关闭 ROI 管理器窗口的情况下, 使用图像堆栈和电子表格窗口关闭窗口。打开包含背景测量的 TIF 堆栈。
- 在 ROI 管理器中, 按"更多 |多项措施"按钮。选择"测量所有切片"和"每个切片的一行" 选项, 然后按"确定"。
- 使用"文件 |另存为 "将电子表格与背景数据保存到另一个 CSV 文件中。
注意: 可以使用电子表格软件进行以下计算。我们使用了 R 软件18。一个简单的示例脚本, 它从文件 "单元格. csv" 和 "背景. csv" 中读取单元格和背景数据, 执行计算, 并绘制膜电位信号的时间过程作为辅助代码文件 1提供。 - 从背景记录中, 计算红色和绿色通道的平均强度。从表示红色和绿色通道中的单元格的信号中减去此背景信号, 分别计算背景校正的 RFP 和 GFP 信号。
- 作为膜电位的替代品, 计算出 RFP/GFP 的比值。
注意: 这个比率是无量纲的。或者, 它可以被规范化为它的初始值 (即, ΔR0)。重要的是, 有用的信息包含在时间的变化, 而不是在这个比率的绝对值。由于 GFP 和 RFP 的漂白不均匀, 因此可能会出现基线漂移。如有必要, 可以通过构造基线曲线并将其从 RFP/GFP 比率10中减去, 从而纠正这种基线漂移。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在图 4a中, 用白色虚线标明了在 RFP (左侧) 和 GFP (右侧) 通道中的图像分析过程中绘制的 ROI, 并描述了一个代表的单 iPSC CM。从 RFP 通道发出的信号显示每次动作电位期间荧光强度的周期性增加 (图 4b, 上部板)。如导言所述, 这是由于膜电位的变化引起的焦虑加剧 (图 1)。和谐, GFP 信号显示荧光强度周期性下降 (图 4b, 中间板)。RFP/GFP 比值 (图 4b, 下板) 是用于下游分析的生物信号, 如 apd50和 apd90测量。使用这种方法, 30 天老心室状 iPSC CMs 节奏在0.5 赫兹显示了平均 apd50 (持续时间从行动电位开始直到复极化完成 50%) 439 ms (@ 46 ms) 和平均 apd90 (持续时间直到复极化完成 90%) 520 毫秒 (47 毫秒) (图 4c)。
图 4: 图像分析原理和基本动作电位特征.(a) 显示单 iPSC 的同时记录的 RFP (右端) 和 GFP (左侧) 荧光。白色虚线表示用于图像分析的感兴趣区域 (ROI)。(b) 显示从 ROI 中获得的背景修正的 rfp、gfp 和 rfp/gfp 信号的原始痕迹。(c) 在室温和0.5 赫兹起搏的情况下, 采用90和50的单心室 iPSC CMs 的方法和扫描电镜。请单击此处查看此图的较大版本.
为了证明该方法还能够捕获动作电位持续时间的变化, iPSC-CMs 被电刺激, 在增加的刺激率范围从0.4 到 2.5 Hz, 提高每五节拍的速度 (图 5)。一个典型的光学记录的膜电位信号从一个 iPSC CM 如图 5a所示。在每一个跳动率的前四动作电位平均值, 表明在提高跳动率的动作电位逐渐缩短 (图 5b)。平均后续节奏节拍是降低光学记录动作电位固有噪声的有效方法10。应该提到的是, 所描述的实验可能无法捕捉到完全依赖速率的动作电位缩短的可能性, 因为在每个起搏速率下, 我们的细胞只有五节拍, 这可能不足以达到平衡。
图 5: 起搏频率对动作电位持续时间的影响.(a)一个 iPSC 厘米的节奏在不断增加的频率范围从0.4 到2.5 赫兹表明 (单电起搏脉冲由箭头表示)。(b) 对于每个起搏频率, 平均 ap 是从该频率的前四 ap 计算出来的。平均 ap 绘制为叠加, 表明 ap 缩短, 提高起搏率。请单击此处查看此图的较大版本.
该方法还可用于研究应用于 iPSC CMs 的药物的电生理效应 (图 6)。在这里, 异丙肾上腺素, 一个非选择性β adrenoreceptor 激动剂, 被应用于自发跳动的 iPSC CMs, 如所示, 导致迅速增加殴打率 (图 6a)。图 6b显示了不同异丙肾上腺素浓度对 iPSC-CMs 跳动频率的影响的剂量-反应曲线。
图 6: 异丙肾上腺素对跳动频率的影响.(a) 显示了自发跳动的单 iPSC 的代表性原始光学动作电位跟踪。异丙肾上腺素 (最终浓度为1µM) 被添加到 iPSC CMs, 如酒吧所示。(b) 此剂量反应曲线显示不同异丙肾上腺素浓度对 iPSC 的跳动频率的影响. 误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
此处描述的方法允许从人类 iPSCs 生成 CMs 的特定子类型 (即心室样细胞) 中的 ap 进行光学记录。人类 iPSC-CMs 是一个新兴的工具, 以解决巨大的各种生物和医学问题, 和分化不同的 CM 亚型是一个重要的来源的实验变异性。通过使用特定的启动子元素, GEVI 的表达式在 CMs 中具体实现, 表示感兴趣的子类型, 然后进行光学成像。
从单 iPSC CMs 中成功获取 ap 取决于分离后的补种密度。如果这些细胞的 reseeded 太密, 那么找到不属于电子合胞体的孤立的单 iPSC CMs 是很耗时的。但是, 太低的播种密度对细胞的存活有负面影响。因此, 建议对不同播种密度进行系统测试, 特别是在从事依赖高通量成像的实验之前。
在图像采集过程中, VSFP 经历漂白, 这可能对信噪比产生负面影响, 特别是在较长的实验中。如果在实验过程中存在快速漂白, 请确保只有在图像采集过程中或在必要的准备步骤 (搜索和聚焦于 VSFP 表达式细胞) 中打开激发光快门, 这应该是尽快完成。另外, 将励磁灯的功率降低到所需的最小量, 并利用高灵敏度相机的动态范围进行图像采集。
当在图像分析过程中绘制 ROI 时, 请注意 iPSC CMs 在收缩期间移动, 并应停留在图像堆栈的所有图像的 roi 中。由于 VSFP 的比例性质, 细胞从 ROI 中的任何运动都不会导致人工信号, 但可能会对信号质量产生负面影响。但是, ROIs 太大, 包括不必要的大的非信号产生区也会对信噪比产生负面影响, 应该避免。
对于有代表性的结果, 有区别的 iPSC-CMs 已经被允许成熟至少30天后, 心脏诱导已经使用。经过这段成熟期后, 不同的 CM 亚型, 如节, 心房, 或心室样细胞可以区分。这些细胞仍然是不成熟的, 只在二维 (2 维) 培养系统中达到一个类似胚胎的表型, 影响电性能以及钙处理19。iPSC CMs 的这些一般限制需要考虑, 因为它们可能会混淆实验结果, 而不依赖于测量动作电位的方法。更先进的三维 (3 D) 培养系统已显示出有望进一步成熟20的结果, 这里描述的方法在这方面可能是有价值的。
目前用于测量 iPSC CMs 的金标准是膜片钳录音, 它允许对不同 AP 特性进行非常详细的分析, 甚至能够测量单个离子通道电流。此外, 可以测量绝对值 (如静止膜电位)。相比之下, 光学 AP 记录是基于膜电位的相对变化。由于 VSFP 的内在动力学相对缓慢, 某些 AP 特征, 如 "超调" 可能会从读数中变钝, 并且有意义的定量的快速特征, 如 AP 向上速度, 是不可能的。然而, 在一个典型的实验性的设置, 而不是绝对的价值, 但价值的差异 (例如, 不同的细胞线之间或药物的应用之前和之后) 测量。这可以可靠地实现与本手稿中描述的特性, 如 AP 持续时间 (例如, apd90或 apd50) 或跳动率, 具有更高的吞吐量比膜片钳10.此外, 这种技术的非侵入性允许在10时间内对同一细胞进行多次测量。因此, 光学 AP 记录和补丁钳应被视为互补工具, 并根据需要回答的实验问题使用。
光学 AP 记录可以通过 GEVI 的表达或电位荧光染料 (如di-8-ANEPPs)21的应用来实现。荧光染料通常有更有利的荧光动力学, 但不能定向到某种类型的心肌细胞, 因为他们没有基因编码。根据不同的工作原理, 开发了 GEVIs22。这里使用的是基于烦恼的 GEVI VSFP-CR11 。这一选择的主要原因是这个指标的比例性质, 它反应细胞退极化与红色的增加和绿色荧光的下降, 如果绿色荧光蛋白是兴奋的。这在心脏病学领域是有利的, 因为这样的比例指标对细胞运动造成的工件的影响较小, 因为它的心肌收缩比仅通过改变其对退极化反应的指标容易。荧光强度。
虽然这里介绍了以MLC2v增强剂为靶向心室状 iPSC cms 的实验结果, 但也有可能使用不同的子类型特定的启动子元素10来靶向心房或节状 cms。为了详细描述这个方法, 这篇手稿的重点是成像单 iPSC-CMs, 已经播种在玻璃盖玻片, 因为这使得分析的 AP 性质的单细胞和提供最高的信噪比。然而, 这种技术还能使与电子合胞体或3维结构中的其他细胞集成的 CMs 成像。这是特殊的兴趣, 因为3维细胞培养模型越来越多地使用, 并已被证明提供不同的属性2维模型20。根据成像设置和 ROIs 的定义, 可以从3维组织的较大区域或组织内的单个细胞分析光学信号。此外, 多个细胞可以同时进行成像和分析, 从而大大提高了吞吐量。
同时, 本文提出的方法可以提高 iPSC-cms 在心律失常相关表型中的快速光学分型, 从而改善 iPSC 在心律失常研究领域的适用性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了德国研究基金会 (Si 1747/1-1)、其他 Kröner-费森尤斯基金会和德意志基金会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
