Summary
ここで具体的には心室のような誘導多能性幹細胞由来心筋細胞イメージ活動電位光学的方法を提案する.メソッドは、電位感受性蛍光タンパク質のプロモーターに駆動される式に基づいています。
Abstract
ひと誘導多能性幹細胞 (iPSC CMs) から生成された心筋細胞、循環器病研究に新たなツールです。均一な細胞集団ではなく、現在の差別化プロトコルによって生成された iPSC CMs 心室細胞の混合物を表す-心房、-、およびリンパ節のような表現型表現型解析を複雑にします。ここでは、心室のような iPSC CMs から具体的に活動電位の光学的記録の方法が表示されます。これは、遺伝子にコードされた電圧インジケーターが心室固有プロモーター要素の制御の下で、構成要素にレンチ ウイルス伝達によって達成されます。IPSC CMs は、この構造体の導入は、電圧センサー、心室のような細胞でのみ表されます、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いたサブタイプ特異光学膜潜在的な録音を有効にします。
Introduction
心筋 (CMs) 由来の誘導多能性幹細胞 (Ips) が解剖心臓副作用効果1,2 の分子機構新規治療法を調査するため、心臓病や画面にする新たなツール、3。スタートから右 channelopathies などの不整脈疾患はこの研究領域4の重要な焦点をされています。その結果、不整脈や活動電位 (AP) 形態の変化など、CMs の電気の表現型を調べる方法は、この技術の中心。
IPSC CMs のアプリケーションの重要な考察は現在心筋分化誘導方法が同種の細胞の人口で起因しません。洞結節、心房に似た細胞と成熟5,6,7,8のさまざまなレベルでの心室の CMs の混合物ではなくされます。この不均一性は、関連するソースをすることができます実験的変動の AP 持続時間 (APD) などのパラメーターを検討した場合に特に本質的に異なる CM サブタイプ間 (例えばAPD は短いよりも心室の CMs で心房)。この問題に対処するための従来のアプローチはパッチ クランプ法を用いた単一 iPSC CMs を調査し、節として各セルを分類する-心房、-、または心室のように、その AP 形態9に基づいて。任意の後続の分析は興味の CM のサブタイプを表すセルにし、制限できます。この方法の主な欠点は、その限られたスループットとスケーラビリティの欠如です。また、パッチ クランプ電気生理学の侵襲的な性質は、長期にわたる連続同じ細胞のイメージングを許可しません。
ここでは、光学的 iPSC CMs の特定のサブタイプの APs をイメージする開発方法10実験の詳細を提供します。これはサブタイプの不均一性の問題を克服し、iPSC CMs の遺伝的変異を運ぶまたは薬理学的にさらされるエージェントの急速な表現をできるように、従来の方法と比較してスループットが大幅に増加します。
サブタイプに固有の光イメージング手法の概要
その蛍光特性を脱分極および細胞膜の再分極時に変更、遺伝子にコードされた電圧インジケーター (GEVI) を使用して、CMs の膜電位の変化を光学的にイメージします。ここに適用 GEVI は電圧検出蛍光タンパク質 VSFP CR11緑 (クローバー) と赤 (mRuby2) 蛍光タンパク質 (図 1 a) のペアに融合した電圧感知の膜貫通ドメインから成っています。2 つの同時の近くのため緑色蛍光タンパクの励起は、赤の蛍光タンパク質を介して蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) に転送されている励起エネルギーの一部の結果します。したがって、緑色蛍光タンパクの励起は、緑、赤の蛍光タンパク質 (図 1 a、上部のパネル) からの排出量の結果します。細胞は脱分極、FRET 効率を高める 2 つの蛍光タンパク質の向きかえに変換する電圧センサーの構造転位が発生します。したがって、励起エネルギーのさらに転送されます、緑から赤色けい光たんぱく質 (図 1 a、下部のパネル)。その結果、脱分極のセルに緑の蛍光性の放出は、調光器と赤い蛍光性の放出は、安静時の膜電位 (図 1 b) セルよりも明るい。
図 1: 膜電位 VSFP 単位での光イメージング(A) A の回路図 VSFP CR を示す電位感受性蛍光タンパク質のアクションを描いたします。細胞膜の脱分極時に電圧センサーの膜貫通ドメインの構造転位変換緑 (GFP) と赤 (RFP) 蛍光蛋白質、分子の蛍光を効率の向きかえ共鳴エネルギー移動 (FRET)。(B) 排出量の静止膜電位 (上部パネル) 細胞および脱分極細胞 (下段) GFP 励起による VSFP のスペクトルが描かれています。脱分極時にスペクトルの変化がわかりやすくするために誇張されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
膜電位の変動をミラーリング FRET 効率の変化、赤と緑の蛍光放出を分離し、2 つの隣接する領域に投影する画像分割を搭載した蛍光顕微鏡を使ってイメージ化します。sCMOS カメラ (図 2) のチップ。このセットアップで、2 つの異なる波長の蛍光性の放出を記録できます同時に、膜電位コマ撮りシリーズのすべてのイメージを反映するように赤と緑の蛍光性の比率の計算が可能します。
図 2: イメージング システムの構成します。イメージング システムの主要なコンポーネントは、高時間分解能で膜電位変化をミラーリング電位感受性蛍光タンパク質のスペクトルの変化が描かれている画像に使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
CMs の VSFP CR の式は、レンチ ウイルス伝達によって実現されます。CM のサブタイプに興味の表現を直接に、レンチ ウイルスには特に心室のような iPSC CMs10で転写をドライブ プロモーター要素 ( MLC2vエンハンサー) が含まれています。心房のような節のようなおよび心室のような細胞の混合物を表す iPSC CMs はこのレンチ ウイルスで導入した、VSFP CR が心室のような細胞のみで表現されます。この蛍光センサーに依存する光の活動電位イメージング、記録された活動電位は排他的関心 (図 3) の CM のサブタイプを表します。
図 3: サブタイプに固有の膜電位イメージングのための VSFP のプロモーターに駆動される式。(、) この回路図は、心筋細胞サブタイプに固有の光の活動電位記録を実現する方法を示しています。(b) iPSC-CMs 心室固有 MLC2v エンハンサーの制御の下で VSFP に感染しているが表示されます。電圧センサーの表現は、GFP チャネル (左側のパネル) の心室のような CMs でだけ観察されます。位相コントラスト (中央のパネル) とオーバーレイ イメージ (右側のパネル) が備わっています。白の点線は、セルの境界をマークします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Protocol
1. iPSC 由来心筋細胞のイメージングのための準備
注: iPSC の文化および心臓の分化法12,13,14前に公開されている、ここで詳しく説明されません。使用する分化プロトコルによって手動レーザーマイクロダイ セクション、磁気細胞分離、または乳酸選択によって iPSC CMs の浄化をお勧めします。次のプロトコルの生成された領域を破ってから microdissected を外植体単分子膜分化プロトコル13を使用して心臓分化の 15 日に撮影された, 前述のフィブロネクチン コート プレート 30 日目まで培養前に10。
- インキュベーター外培養皿の細胞を取るし、手動で 200 μ L ピペットを用いた遠心管に心臓植を収集します。沈降後、細胞培養上清を吸引し、ハンクと 2 x のバランスのとれた植は水洗いして塩ソリューション (HBSS)。
- コラゲナーゼ タイプ II を追加して iPSC CMs を切り離す (HBSS で 430 U/mL) と 37 ° C, 30 分でそれらを孵化させなさい。
- 残りの大細胞の沈降の塊と解離単一の iPSC CMs を含む上清は収集高いウシ胎児血清 (FBS) 濃度 20 %fbs、2 mM (DMEM F12、新鮮な CM メンテナンス中にこれを追加L-glutamine、1: 100 の MEM 非本質的なアミノ酸、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、0.1 mM β-メルカプトエタノール)。
- 大細胞塊が残っている場合は、解離を繰り返します。収集遠心分離によって単一の iPSC CMs と CM 培低 FBS 濃度でそれらを再懸濁します (2 %fbs)。
- フィブロネクチン (2 μ g/cm2) でコーティングしており、3.5 cm ガラス下部セルの文化 microdish の単一セルの後続の画像を許可する密度の単一 iPSC CMs を再シードします。高スループット実験を行う前に播種密度を最適化します。通常、3.5 cm 皿あたり 5-10 心臓植、十分です。ただし、これは重く植サイズと純度に依存します。
- 2% を含む CM メンテナンス中で解離後単一の iPSC CMs を文化、少なくとも 48 時間の十分な回復を確実に政府短期証券。
注: 次の手順で iPSC CMs は GEVI VSFP-CR MLC2vエンハンサー10の制御の下で心室固有 GEVI 式を達成するためにエンコード レンチ ウイルスを導入が。使用10または、レンチ ウイルス構造結節や心房と同様の細胞で特に GEVI を表現することができますまたは PGK の普遍的発現プロモーターをかくまっている不特定の構築などができます。レンチ ウイルスのプラスミドのリクエストも承ります。
注意: レンチ ウイルス粒子を操作するときは、作業環境が適切なバイオ セーフティ レベル、可能性のある感染性病原体を扱うための安全指示に従うし、必要な安全対策を講じることを確認します。 - レンチ ウイルス10を混合することによって感染メディアの準備-15CMs 用培地で前に説明したように HEK293 細胞で生産されている細胞培養上清を含む (手順 1.3 参照) 1:1 の比率で。
- 8 μ g/mL の感染効率を高めるための最終的な集中に hexadimethrine ブロマイドを追加します。
注: 高い感染による遠心をレンチの iPSC CMs 前濃度の効率通常必要はありません。 - 単一の iPSC CMs から CM 維持培地を吸引し、1.7 と 1.8 の手順で調製した感染培地にそれを置き換えます。37 ° C で 12 h の感染媒体に感染した単一 iPSC CMs の文化します。培地を吸引し、再び CM メンテナンス中に置き換えます。
注: GEVI から蛍光信号感染後 48 時間が表示されます。膜の潜在的な録音のイメージング、勧め、早ければ感染後 72 時間適切な信号強度を確保します。単一感染 iPSC CMs は、少なくとも 3 週間培養し、順番にイメージを作成できます。広範な退色がイメージング セッション中に発生した場合蛍光信号を時間の経過とともに回復します。 - 画像、前に Ca2 +を添加したタイロード液で細胞培養液を交換 (135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM グルコース、1.8 mM CaCl2、および 10 mM HEPES; pH 7.35)。
2. 光学的膜電位記録
- 画像分割、適切なフィルター セット、および可能高高速撮像カメラ (例えば、sCMOS カメラ) を搭載した倒立落射蛍光顕微鏡のステージ上 iPSC CMs を含むイメージング室の場所感度。
メモ: たとえば、480/40 nm バンドパス励起フィルターの使用は、顕微鏡で 500 nm ロングパス ・ ダイクロイック ミラーと組み合わせて、568 nm ロングパス ・ ダイクロイック ミラーを併用 520/28 nm と 630/75 nm バンドパス排出フィルター イメージ分割。単一細胞のイメージング、高倍率、高開口油浸対物レンズは、最高の信号対雑音比を提供しています。 - 電気的ペーシングが必要な場合、イメージングの商工会議所でペーシング電極をインストールし、刺激発生器に接続します。
注意: 3.5 cm ガラス底細胞培養皿にペーシング挿入 2 つの白金電極を含まれている、装備を使用しています。電極の間にある細胞をイメージしました。典型的なペーシング パラメーターは、10 V/cm の電極距離の振幅と時間 5 ms の矩形波です。 - 必要に応じて、長期的な画像である場合、イメージング、または顕微鏡インキュベーション室セットアップも中に iPSC CMs の安定した温度を確保するため加熱顕微鏡ステージを使用します。
- フォーカスをセルをもたらすし、視野の中心に GEVI を表現するセルを配置します。
注: 緑色蛍光タンパク質 (GFP) または赤の蛍光タンパク質 (RFP) フィルター セット GEVI を発現する細胞を識別するために、顕微鏡の接眼レンズを使用して、これは最も便利な場所です。 - 放出される光が画像スプリッターを経由するように光パスを設定します。フィルター キューブを顕微鏡で画像スプリッターのフィルターと組み合わせることの 1 つに切り替える (テーブルの材料を参照してください)。
- カメラを制御するソフトウェア、(例えば、100 フレーム/秒、1 フレームあたり 10 ms の露光時間で) 高速撮像が可能取得設定を設定します。
注: 通常、これはカメラのピクセルのビニング含まれます (例えば8 × 8 ピクセル カメラ チップのコマ撮りムービーで 1 ピクセルを生成するビニング、)。 - 製造元の指示に従ってイメージの分割を設定します。それぞれ 1 つを占めて、2 つの異なる発光波長バンドを表す 2 つの画像は、互いに隣接するべき画像の半分。
注: するこの手順は、各撮像セッションの初めにだけ 1 つの x を実行します。 - 確認し、必要に応じて、カメラによって生成されたイメージのフォーカスを調整します。
- 照明光の明るさを調整、ピクセルの任意の飽和状態を避けなさい。これは、飽和のピクセルは独特の色で表されるカラー パレットを使用して、最も簡単に実行できます。
注: これらイメージ作成前準備時に必要な量 (すなわち、長時間の点灯にしないで) を光励起するサンプルの露出を制限 GEVI の変質を避けるために。 - タイム シリーズのデータ集録設定 (例えば、100 フレーム/秒 50 のシリーズの持続期間のために 5,000 枚 s)。測定に影響を及ぼす迷光を避けるために (コンピューターのモニターを含む) 部屋の明かりを暗きます。励起光シャッターがイメージング ソフトウェアによって制御されていない場合は、データ収集の開始の直前に開きます。
- 一連のイメージの取り込みを開始します。電気的ペーシングが必要な場合は、イメージング ソフトウェアによって自動的に開始しない限り、適切な時点でペーシングのシーケンスを開始します。薬理学的エージェントのアプリケーションが場合は、このいずれかを手動で行う (例えばバッファーの 900 μ L を含むと優しく混ぜるピペット記録室に 10 倍終わり濃度エージェントの 100 μ L 分注によって) またはを使用して、定流量灌流システム。
- 買収が完了したら、必要に応じて、励起光シャッターを閉じます。記録をハード ディスク ドライブに保存します。
- そのまま録画の設定 (すなわち、露出時間、フレーム レート、および光強度) を残して、実行 (ステップ 2.11) と同様に背景の蛍光性の記録を別の coverslip 以上セルを含まない coverslip の領域にないです。セルがシードされています。
注: 取得の設定を変更することがなく連続測定を実行すると、1 つだけのバック グラウンド蛍光記録すべてのこれらの測定のため必要です。 - 必要な場合、同じ上にある別の iPSC CMs に追加実験 (ステップ 2.4-2.13) を実行します。薬を適用した場合に、上のすべての CMs を受けることを注意してください。
3. 分析
> 注: イメージング ソフトウェアに応じて使用されます (これは通常カメラまたは蛍光イメージング システムの全体の製造元によって提供される独自のソフトウェア パッケージ)、あるいは部分的に取得した画像の分析を実行することがあります完全にこのソフトウェア パッケージです。ただし、ここで実行できる画像解析のワークフロー オープン ソース ソフトウェア (すなわち、イメージ解析プラットフォーム ImageJ)16、フィジー17などのための R パッケージの配布を使用して便利なインストールが可能な統計計算18のとおりです。簡単に、セルや背景を表す (ROIs) の関心の領域、ImageJ で描画され、時間をかけてこれらの Roi の平均蛍光はさらに R または、代わりに、表計算ソフトで分析される、その後、ファイルにエクスポートします。
- イメージング ソフトウェアの保存または取得した画像時系列 (セルを含む記録と対応するバック グラウンド録画の両方) を (例えばTIF) ImageJ で読み取ることができる形式にエクスポートします。また、イメージング システム メーカーのさまざまなブランドから独自のファイル形式を読む、ImageJ を有効にするルーチンを提供します BioFormats プラグイン (https://imagej.net/Bio-Formats) を使用します。
注: 次の手順は、イメージングの間隔が記録全体で同じであると仮定します。そうでない場合は、イメージング ソフトウェアのタイミング情報をエクスポートしてさらに分析に含める必要があります。 - ImageJ のセルを含む TIF スタックを開きます。
- フリーハンド選択ツールを使用して、赤のチャンネルに蛍光心筋細胞上の投資収益率を描きます。投資収益率が十分な大きさになるため、セルが契約中の投資収益率を移動しませんを確認します。
- ROI マネージャーのプラグインを開く ('分析 |ツール |ROI マネージャー ') ROI1 としてこの ROI を追加する追加] [t]ボタンを押します。
- 緑のチャンネルで同じセルに ROI をドラッグし、ROI2 としてこの ROI を追加します。
- の ' 分析 |測定の設定メニュー、 '平均グレー値'を除くすべてのオプションの選択を解除します。
注: これは、ImageJ セッションでのみ 1 x を行う必要があります。 - ROI マネージャーで、を押して ' より |マルチ メジャー 'ボタン。'すべてのスライスを測定'と'スライスごとに 1 行'オプションを選択し、 「OK」を押します。3 つの行 (スライス数とそれぞれ赤と緑のチャネルでは、セルを表す 2 つの Roi の平均蛍光) とスプレッドシートを含むウィンドウが開きます。
- 使用' ファイル |名前を付けて保存 'コンマ区切り値 (CSV) ファイルにスプレッドシートを保存します。
- ROI マネージャー ウィンドウを閉じずに、画像のスタックとウィンドウやスプレッドシート ウィンドウを閉じます。バック グラウンド測定を含む TIF スタックを開きます。
- ROI マネージャーで、を押して ' より |マルチ メジャー'ボタン。'すべてのスライスを測定'と'スライスごとに 1 行'オプションを選択し、 「OK」を押します。
- 使用' ファイル |保存としての別の CSV ファイルに背景データとスプレッドシートを保存します。
注: 次の計算は表計算ソフトで行うことができます。R ソフトウェア18を使いました。ファイル"cell.csv"から"background.csv"のセルと背景データ、計算を実行して膜の潜在的な信号の時間的経過をプロットを読む簡単な例スクリプトは、補足コード ファイル 1として提供されます。 - 背景の記録から、赤と緑のチャネルの平均強度を計算します。この RFP のバック グラウンド補正を計算するために赤と緑のチャネル内のセルを表す信号からバック グラウンド信号と GFP の信号をそれぞれ引きます。
- 膜電位の代理として RFP/GFP の比率を計算します。
注: この比は無次元です。また、初期値 (すなわちΔR/R0) に正規化することができます。重要なは、この比率の絶対値ではなく変化で、有用な情報が含まれています。GFP と RFP の不均一な退色のため、この比率のベースラインのドリフトが発生します。必要に応じて、基準曲線を構成する RFP/GFP 比10からそれを減算することによってそのようなベースラインのドリフトを修正する可能性があります。
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Representative Results
図 4 a、代表的な単一 iPSC CM は RFP (左側) と GFP (右側) チャネルのイメージング分析中に描かれた ROI をマーキング白点線で描かれています。RFP チャネルからの信号は、それぞれの活動電位 (図 4 b、上部のパネル) の中に蛍光強度の周期的な増加を示しています。前述の導入で、これは膜電位 (図 1) の変化による増加フレット原因です。的外れ、gfp 蛍光強度 (図 4 b、中央のパネル) の定期的な減少を示しています。RFP/GFP 比 (図 4 b、下のパネル) は、APD50や90の APD 測定などの下流解析で使用される生物学的信号です。このメソッドは、30 日齢のような心室 iPSC CMs 439 ms (± 46 ms) と平均 APD90 (期間の平均 APD50 (活動電位の再分極が 50% 完了するまでの初めからの期間) を示した 0.5 Hz でペースを使用してください。再分極を 90% 完了) 520 ms (± 47 ms) の (図 4 c)。
図 4: 画像解析と基本的な活動電位特性の原則です。(を) 同時に記録された RFP (右側)、単一の iPSC CM の (左側にある) GFP 蛍光が表示されます。白の点線は、イメージング解析に使用する利息 (収益率 ROI) の領域を表しています。(b) 原料背景修正 RFP、GFP の痕跡し、投資収益率から派生した RFP/GFP シグナルが表示されます。(c) 手段と SEM の APD90単心室のような iPSC CMs 0.5 Hz ペーシングと室温での APD50が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
メソッドも活動電位持続時間の変化をキャプチャが可能であることを示すため、iPSC CMs 電気刺激率 0.4 からの率を増加させる、2.5 Hz に至るまですべて 5 ビート (図 5) を増やすことで刺激します。1 つの iPSC CM から典型的な光学的記録膜の潜在的な信号は、図 5 aに表示されます。各打撃のレートで最初の 4 つの活動電位の平均と、高められた敗北率 (図 5 b) 活動電位の進歩的な短縮を示します。後続のペースでビートを平均化は活動電位の光学的記録10に固有のノイズを減少させる効果的な方法です。特筆すべきは描かれている実験が短縮可能なことを考えると我々 のペースの平衡に到達できない可能性がありますそれぞれのペーシング レートでのみ 5 ビートのセル速度依存性活動電位の全額をキャプチャ可能性があります。
図 5: 活動電位持続時間に及ぼすペーシングの頻度。(を) IPSC CM は 0.4 に至る 2.5 Hz 示される頻度は増大のペースだった (単一のペーシング パルスは矢印で表されます)。(b) ペーシング周波数毎に平均 AP がこの周波数で最初の 4 つの Ap から算出しました。平均の APs は、ペーシング レートの増加とともに短縮 AP を示す、オーバーレイとしてプロットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
メソッドは、iPSC CMs (図 6) に適用される薬を電気生理学的に検討することも使用できます。ここでは、示される、暴行率 (図 6 a) のプロンプトの増加につながる、イソプロテレノール、非選択的 β-アドレナリン受容体アゴニストは自発的に打ち iPSC CMs に適用されました。図 6bに iPSC CMs の打撃頻度にイソプロテレノール濃度の異なる効果を示す用量反応曲線を示します。
図 6: 暴行周波数におよぼすイソプロテレノール。(に) 自発的に暴行の代表的な生光電位トレースの単一 iPSC CM が表示されます。イソプロテレノール (最終濃度 1 μ M) とは、バーで示されているように、iPSC CMs に追加されました。(b) この用量反応曲線は、iPSC の打撃頻度の異なるイソプロテレノール濃度の効果を示しています-cms エラーバーは標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明したメソッドは、ヒトの Ips から生成された CMs の特定のサブタイプ (すなわちのような心室細胞) から APs の光学的記録をできます。人間 iPSC CMs は、巨大な様々 な生物や医療の問題に対処するための新たなツールと CM サブタイプごとに分化実験的変動の重要な源であります。特異的プロモーターの要素を使用して、GEVI の式は特に光学的イメージがその後の関心のサブタイプを表す CMs で行われます。
単一の iPSC CMs から APs の買収に成功、解離後 reseeding の密度に依存します。セルは余りに密で再シードされ、隔離された単一 iPSC-CMs は電気シンシチウムの一部ではないを見つけるに時間がかかるです。しかし、あまりにも低播種密度、細胞の生存に悪影響します。したがって、特に高速イメージングに依存する実験を行う前に、異なる播種密度の体系的なテストすることをお勧めします。
画像集録中に、VSFP は退色は、信号対雑音比の長い実験中に特に悪影響を受けます。急速な退色が実験中に存在する場合は、画像取得中またはする必要があります必要な準備手順 (検索と VSFP 発現細胞に焦点を当てて) 中にのみ励起光シャッターが開きますを確認してください。できるだけ早く実行されます。さらに、励起光を必要最小限の量の電力を削減し、画像取り込み用高感度カメラのダイナミック レンジの使用します。
画像解析中に投資収益率を描画する場合は、iPSC CMs が収縮中に移動し、画像のスタックのすべての画像の ROI 内に滞在する必要があります注意してください。VSFP のレシオ メトリック性質のため投資収益率からセルの任意の動きは人工信号にはつながらないが、信号の品質に悪影響を及ぼす可能性があります。しかし、大きすぎる、悪影響も不必要に大きく非信号生産地域を含む・ ロワは信号対雑音比に影響を与える、避けるべきであります。
代表の結果は、心臓の誘導が使用されている後少なくとも 30 日間成熟する許可されている iPSC CMs を区別しました。成熟のこの期間後異なる CM サブタイプ、よう節-心房、-、または心室のような細胞を区別することができます。これらの細胞がまだ成熟していないと二次元 (2 D) 文化システム処理19カルシウムだけでなく、電気的特性に影響を与えるのだけは萌芽期のような表現型に到達します。IPSC CMs のこれらの一般的な制限は、実験結果の活動電位を測定するために使用されるメソッドの独立者を混同するかもしれないと考慮する必要があります。高度な三次元 (3 D) 培養システムに向けてさらに成熟20、有望な結果が示されているし、ここで説明するメソッドは、このコンテキストで貴重かもしれない。
IPSC CMs の測定の Ap の現在のゴールド スタンダードは違うの AP の特性の非常に詳細な分析を許可するパッチ クランプの記録を単一イオン チャネル電流の測定をも可能します。さらに、絶対的な値 (例えば、静止膜電位) の測定が可能対照的に、光の AP の録音は、膜電位の相対的変化に基づいています。VSFP 組み込み比較的遅い速度のため「オーバー シュート」など、特定 AP 特性は、測定値から鈍化可能性がありますと AP 脱分極相速度などの高速機能意味のある定量分析不可能です。しかし、典型的な実験設定の絶対的な値ではなく、(例えば、異なる細胞間または薬物のアプリケーションの前後) の値の違いに測定されます。これは確実に AP 期間のような特性のこの原稿で説明されている光学的手法を達成することができます (例えば、 APD90または APD50) または暴行率、パッチク ランプ10 と比較してはるかに高いスループット.さらに、この技術の非侵襲的な性質は10時間以上同じセルの複数の測定値をことができます。したがって、光 AP 録音とパッチク ランプが補完ツールとして考えられているが、回答する必要があります実験の質問に応じて使用します。
光の AP 録音は、GEVI の式または電位差の蛍光染料 (例えばディ 8 ANEPPs)21のアプリケーションのいずれかで実現できます。蛍光染料は通常より有利な蛍光動態が彼らがない遺伝子にコードされた、心筋細胞の特定のサブタイプに指示することはできません。別の動作原理に基づく GEVIs の数は、先進22をされています。、ここでフレット ベース GEVI VSFP CR11が使用されます。この選択の主な理由は、緑色蛍光タンパク質が興奮している場合、赤と緑の蛍光性の減少と細胞の分極防止作用に反応するこのインジケーターのレシオ メトリック性質だった。これは循環器の分野で有利なそのようなレシオ メトリック指標指標の変更によってだけ脱分極に対応するよりも心筋細胞の収縮により細胞の運動によって生じる不具合を受けにくいので、蛍光強度。
MLC2vエンハンサーを使用してのような心室 iPSC CMs をターゲットの実験からの結果だけはここで表示されますが、また心房- または節のような別のサブタイプに固有のプロモーターの要素10を使用して CMs をターゲットすることが可能です。方法について詳細に説明するため、この原稿は、単一細胞の ap 通信特性の解析を有効に最高の信号対雑音比を提供していますこれとガラス基盤にシードされている単一の iPSC CMs をイメージングに焦点を当てた。ただし、この技術は、電気シンシチウムまたは 3次元構造の他のセルと統合されている CMs のイメージングもできます。これは特別な関心と三次元細胞培養モデルがますます使用される、2 D モデル20から異なるプロパティを提供するために示されています。イメージングのセットアップ、Roi の定義によって大きな 3次元組織の領域から、または組織内の単一のセルから、光信号を分析できます。さらに、複数のセルを同時にイメージおよび個別に分析できるスループットの大幅な増加に 。
一緒に取られて、ここで紹介した方法が不整脈に関連した表現の iPSC CMs の急速な光表現を有効にすることによって不整脈研究の分野で iPSC CMs の適用性を向上します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、ドイツ研究振興協会 (Si 1747/1-1)、他の Kröner フレゼニウス財団、ドイツ財団 für Herzforschung からの補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
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