Summary
Her præsenterer vi en metode til optisk billede handling potentialer, specielt i ventrikel-lignende inducerede pluripotente stamceller-afledt cardiomyocytes. Metoden er baseret på udtrykket promotor-drevet af en spænding-følsomme fluorescerende proteiner.
Abstract
Cardiomyocytes genereres fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSC-CMs) er en spirende værktøj i hjerte-kar-forskning. Snarere end at være en homogen population af celler, iPSC-CMs skabt af nuværende differentiering protokoller repræsenterer en blanding af celler med ventrikel-, atrieflimren-, og nodal-lignende fænotyper, som komplicerer fænotypiske analyser. Her, er en metode til optisk optage handling potentialer specifikt fra ventrikulær-lignende iPSC-CMs præsenteret. Dette opnås ved lentiviral transduktion med en konstruktion, hvor en genetisk kodet spænding indikator er under kontrol af en ventrikulær-specifikke promotor element. Når iPSC-CMs er transduced med denne konstruktion, udtrykkes spændingsmåler udelukkende i ventrikel-lignende celler, aktivering undertype-specifikke optisk membran potentielle optagelser ved hjælp af time-lapse Fluorescens mikroskopi.
Introduction
Cardiomyocytes (CMs) afledt af induceret pluripotente stamceller (iPSCs) er et kommende værktøj til at dissekere molekylære mekanismer for hjertesygdomme, at undersøge nye behandlingsformer, og at skærmen for negative hjerte narkotika effekter1,2 ,3. Lige fra starten, har arrhythmogenic sygdomme som channelopathies været et vigtigt fokus for denne forskning område4. Metoder til at undersøge elektriske fænotyper af CMs, såsom arytmier eller ændringer i aktionspotentialet (AP) morfologier, er derfor, i hjertet af denne teknologi.
En vigtig overvejelse i anvendelsen af iPSC-CMs er, at nuværende hjerte differentiering protokoller ikke resulterer i en homogen population af celler. I stedet, de er snarere en blanding af celler der ligner sinusknuden, atrieflimren, og ventrikulær CMs på forskellige niveauer af modning5,6,7,8. Denne forskelligartethed kan være en relevant kilde eksperimentel variation, især hvis parametre som AP varighed (APD) er undersøgt, som uløseligt er forskellige mellem CM undertyper (f.eks.APD er kortere i atrieflimren end i ventrikulær CMs). Den konventionelle tilgang til at løse dette problem er at undersøge enkelt iPSC-CMs ved hjælp af metoden patch klemme og klassificere hver celle som nodal-, atrieflimren-, eller ventrikulær-lignende, baseret på dens AP morfologi9. Enhver efterfølgende analyse kan begrænses derefter til de celler, der repræsenterer CM undertype af interesse. Den store ulempe ved denne strategi er dens begrænsede produktion og mangel på skalerbarhed. Derudover tillader patch klemme Elektrofysiologi invasiv art ikke billeddannelse af de samme celler sekventielt over længere perioder.
Her give vi eksperimentelle detaljer på en metode10 udviklet optisk billede APs i specifikke undertyper af iPSC-CMs. Dette overvinder problemet med subtype heterogenitet og øger dramatisk throughput sammenlignet med konventionelle metoder, så den hurtige fænotyper af iPSC-CMs bærer genetiske varianter eller bliver udsat for farmakologiske stoffer.
Oversigt over den undertype-specifikke optiske billeddannelse tilgang
En genetisk kodet spænding indikator (GEVI), hvis fluorescens egenskaber ændre på depolarisering og repolarisering af cellemembranen, bruges til optisk billede ændres af membran potentiale af CMs. GEVI anvendes her er den spænding-sensing fluorescerende protein VSFP-CR11, som består af en spænding-sensing transmembrane domæne smeltede sammen til et par en grøn (kløver) og en rød (mRuby2) fluorescerende proteiner (figur 1A). På grund af nærhed af de to fluorophores, excitation af den grønne fluorescerende proteiner resultater på en brøkdel af excitation energi overføres til den røde fluorescerende proteiner via Förster resonans energioverførsel (FRET). Derfor resulterer excitation af den grønne fluorescerende proteiner i en emission fra både grønne og de røde fluorescerende proteiner (figur 1A, øverste panel). Når cellen depolarizes, opstår en strukturel omlægning af spændingsmåler der giver sig udslag i en omlægning af de to fluorescerende proteiner, øge FRET effektivitet. Således overføres endnu mere for magnetisering energi fra grønne til de røde fluorescerende proteiner (figur 1A, nederste panel). Som et resultat, i en depolarized celle, grønne fluorescens emission er svagere, og den røde fluorescens emission er lysere end i en celle på hvile membran potentiale (figur 1B).
Figur 1: optiske billeddannelse af membran potentiale med VSFP-kr.NOTANR (A) A skematisk skildrer handlingen af spænding-følsomme fluorescerende proteiner VSFP-CR er vist. Ved depolarisering af cellemembranen, en strukturel omlægning i den spænding-sensing transmembrane domæne giver sig udslag i en omlægning af green (normal god landbrugspraksis) og rød (RFP) fluorescerende proteiner, øge effektiviteten af den intramolekylære Förster resonans energioverførsel (FRET). (B) emission spektre af en VSFP ved excitation af normal god landbrugspraksis i celler på den hvilende membran potentiale (øverste panel) og i depolariseret celler (nederste panel) er afbildet. Den spektrale ændring ved depolarisering er overdrevet for klarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Ændringer i FRET effektivitet spejling udsving af membranen potentiale er afbildet ved hjælp af et fluorescens mikroskop udstyret med en image splitter, som adskiller røde og grønne fluorescens emission og projekter dem på to tilstødende områder af chip af en sCMOS kamera (figur 2). Med dette set-up, kan fluorescens emission på to forskellige bølgelængde bands registreres samtidigt, hvilket giver mulighed for beregning af forholdet mellem rød til grøn fluorescens afspejler membran potentiale i hvert billede af en time-lapse serie.
Figur 2: konfiguration af imaging systemet. De vigtigste komponenter i den billedbehandlingssystem bruges til billede de spektrale ændringer af spænding-følsomme fluorescerende proteiner spejling membran potentielle ændringer på en høj tidsmæssige opløsning er afbildet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Udtryk for VSFP-CR i CMs er opnået ved lentiviral transduktion. Direkte udtryk til CM undertype af interesse, indeholder en lentivirus en promotor element ( MLC2v forstærker), der specifikt drev transskription i ventrikel-lignende iPSC-CMs10. Når iPSC-CMs, der repræsenterer en blanding af atrieflimren-lignende, nodal-lignende og ventrikel-lignende celler er transduced med denne lentivirus, er VSFP-CR kun udtrykt i ventrikel-lignende celler. Da den optiske aktionspotentialet imaging afhænger denne fluorescerende sensor, repræsenterer de optagede handling potentialer udelukkende CM undertype af interesse (figur 3).
Figur 3: promotor-drevet VSFP udtryk for undertype-specifikke membran potentielle imaging. (en) denne skematiske viser hvordan cardiomyocyte undertype-specifikke optisk aktionspotentialet optagelser er opnået. (b) iPSC-CMs inficeret med en VSFP under kontrol af den ventrikulære-specifikke MLC2v-forstærker er vist. Udtryk for en spændingsmåler ses kun i ventrikel-lignende CMs i normal god landbrugspraksis kanal (venstre panel). Der tilbydes også fasekontrast (midterste panel) og overlejringsbillede (højre panel). De hvide stiplede linjer markere celle grænser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af iPSC-afledte Cardiomyocytes til billedbehandling
Bemærk: Metoder til iPSC kultur og hjerte differentiering har været offentliggjort før12,13,14 og behandles ikke her i detaljer. Rensning af iPSC-CMs af manuel microdissection, magnetiske celleseparering eller laktat udvalg anbefales afhængigt af differentiering protokollen anvendes. For følgende protokol, blev microdissected explants fra slå områder, genereres ved hjælp af en éncellelag differentiering protokol13, taget på dag 15 i et hjerte differentiering og kulturperler indtil dag 30 på fibronektin-belagte plader som beskrevet før10.
- Tage cellen kultur plader ud af rugemaskinen og manuelt samler de kardiale explants ind microcentrifuge rør ved hjælp af en 200 µL pipette. Efter bundfældning, Aspirér supernatanten cellekultur og forsigtigt vaske explants 2 x med Hank er balanced salt løsning (HBSS).
- Adskille iPSC-CMs ved at tilføje collagenase type II (430 U/mL i HBSS) og dem der inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
- Efter bundfældning af de resterende store celle klumper, indsamle supernatanten, der indeholder de dissocierede enkelt iPSC-CMs og tilføje dette til frisk CM vedligeholdelse medium indeholdende en høj føtal bovint serum (FBS) koncentration (DMEM-F12, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 1: 100 MEM ikke-essentielle aminosyrer, 100 U/mL penicillin-streptomycin og 0,1 mM β-mercaptoethanol).
- Gentag dissociation, hvis der stadig er store celle klumper. Indsamle enkelt iPSC-CMs ved centrifugering og resuspend dem i CM medium indeholdende en lav FBS koncentration (2% FBS).
- Re-seed enkelt iPSC-CMs i en tæthed, så den efterfølgende billeddannelse af enkelte celler på en 3,5 cm glas-bund celle kultur microdish, der er blevet belagt med fibronektin (2 µg/cm2). Optimere seeding tætheden før de indleder høj overførselshastighed eksperimenter. Normalt, er 5 – 10 hjerte explants pr. 3,5 cm parabol tilstrækkelige; men dette stærkt afhænger af eksplantat størrelse og renhed.
- Kultur indre iPSC-CMs efter deres dissociation i CM vedligeholdelse medium indeholdende 2% FBS i mindst 48 timer til at sikre en tilstrækkelig opsving.
Bemærk: I de næste skridt, iPSC-CMs er transduced med en lentivirus kodning GEVI VSFP-CR under kontrol af en MLC2v forstærker10 for at opnå en ventrikulær-specifikke GEVI udtryk. Alternativt kan lentiviral konstruktioner giver mulighed for at udtrykke GEVI specifikt i nodal - eller atrieflimren-lignende celler, eller en uspecifik konstruere husly den allestedsnærværende udtrykt PGK promotor, være brugt10. Lentiviral plasmider er tilgængelige efter anmodning.
Forsigtig: Når du arbejder med lentiviral partikler, sikre, at arbejdsmiljøet har tilstrækkelig biosikkerhed niveau, overholder sikkerhedsforskrifterne for at arbejde med potentielt infektiøse agenser, og træffe de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. - Forberede infektion medium ved at blande lentivirus10-indeholdende cellekultur supernatanten, som er blevet produceret i HEK293 celler som beskrevet før15, med CMs vedligeholdelse medium (Se trin 1.3) i forholdet 1:1.
- Tilføj hexadimethrine bromid i en endelig koncentration på 8 µg/mL, effektivisere infektion.
Bemærk: På grund af den høje infektion effektivitet af iPSC-CMs forudgående koncentration af lentivirus gennem ultracentrifugering er normalt ikke nødvendigt. - Opsug CM vedligeholdelse medium fra enkelt iPSC-CMs og erstatte det med infektion medium udarbejdet under trin 1,7 og 1,8. Kultur de inficerede enkelt iPSC-CMs på mellemlang og infektion i 12 timer ved 37 ° C. Derefter Aspirér medium og erstatte det igen med CM vedligeholdelse medium.
Bemærk: Et fluorescens signal fra GEVI vises 48 h efter infektionen. En billeddannelse af membran potentiale optagelser er anbefalet, 72 h efter infektion tidligst at sikre en ordentlig signalstyrke. Enkelt inficeret iPSC-CMs kan dyrkes i mindst 3 uger og afbildet sekventielt. Hvis omfattende photobleaching opstår under en billeddannelse session, genopretter fluorescens signalet over tid. - Før imaging, udveksler cellekulturmedium ved Tyrodes løsning suppleres med Ca2 + (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM glukose, 1,8 mM CaCl2og 10 mM HEPES; pH 7,35).
2. optical membran potentielle optagelser
- Sted imaging salen indeholdende iPSC-CMs på scenen i en inverteret epifluorescensmikroskop udstyret med en image splitter, passende filter sæt og et kamera (f.eks., en sCMOS kamera) i stand til at høj hastighed billedbehandling på et højt følsomhed.
Bemærk: For eksempel, brug en 480/40 nm båndpas excitation filter kombineret med en 500 nm long-pass dichroic spejl i mikroskop, og en 568 nm long-pass dichroic spejl kombineret med 520/28 nm og 630/75 nm båndpas emission filtre i image splitter. For enkelt celle imaging giver en høj forstørrelse, høj numerisk blænde oliebestandighedsobjektet det bedste signal / støj-forhold. - Hvis elektrisk pacing er påkrævet, installere pacing elektroder i den billeddiagnostiske afdeling og forbinde dem til en stimulus generator.
Bemærk: Vi brugte en pacing indsatser, der indeholdt to platin elektroder og monteret i 3,5 cm glas-bund celle kultur retter. Cellerne ligger mellem elektroderne var afbildet. Typiske pacing parametre er rektangulære pulser af 5 ms i varighed, med en amplitude på 10 V/cm elektrode afstanden. - Vælge at bruge en opvarmet mikroskop fase for at sikre en stabil temperatur på iPSC-CMs under imaging, eller endda et mikroskop inkubation kammer set-up, hvis langsigtede imaging er bestemt.
- Bringe cellerne til at fokusere og placere en celle udtrykker GEVI ind i midten af feltet visning.
Bemærk: Dette gøres mest bekvemt ved hjælp af mikroskop ved hjælp af en grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller en rød, fluorescerende proteiner (RFP) filter sat til at identificere celler, der udtrykker GEVI okularer. - Angiv den optiske transmissionslængde, så udsendte lys dirigeres til image splitter. Skifte filter kuben i mikroskop til den skal kombineres med filtre i image splitter (Se Tabel af materialer).
- I softwaren styrer kameraet, skal du angive indstillingerne for erhvervelse, så høj hastighed billedbehandling (fx, 100 frames per sekund, med en eksponeringstid på 10 ms pr. ramme) er muligt.
Bemærk: Normalt, dette indebærer udsmidningen af kamera pixel (f.eks.8 x 8 pixel kamera chip er arkiveret lodret for at generere en pixel i den time-lapse film). - Oprette image splitter efter fabrikantens anvisninger. De to billeder, der repræsenterer de to forskellige emission bølgelængde bands skal være støder op til hinanden, hver besætter en halvdel af billedet.
Bemærk: Dette trin der skal udføres kun 1 x i begyndelsen af hver tænkelig session. - Kontroller og Juster om nødvendigt fokus i billedet produceret af kameraet.
- Justere lysstyrke lysets belysning, så enhver mætning af pixel undgås; Dette kan gøres lettest ved at bruge en farvepalet, der mættede pixels er repræsenteret af en unik farve.
Bemærk: Under alle disse forberedelser forud for billedbehandling, begrænse eksponeringen af prøven for excitation lys til den nødvendige mængde (dvs., ikke forlade lys over for længere perioder af tid) at undgå photobleaching af GEVI. - Oprette erhvervelse af tidsserierne (fx, 5.000 billeder på 100 frames pr. sekund for en serie varighed af 50 s). Dæmp lyset i rummet (herunder computerskærme) for at undgå omstrejfende lys påvirker målingen. Hvis excitations lys lukkeren ikke er kontrolleret af den billedbehandlingsprogrammer, åbne det lige før anskaffelsen.
- Start erhvervelse af billede-serien. Hvis elektrisk pacing ønskes, starte pacing sekvensen på det relevante tidspunkt, medmindre det startes automatisk af den billedbehandlingsprogrammer. Hvis anvendelsen af en farmakologisk agent er eftersøgt, gøre dette enten manuelt (f.eks.af pipettering 100 µL af agenten i en tidobbelt ende koncentration til optagelse salen indeholdende 900 µL af buffer, og forsigtigt blande det med en pipette) eller ved hjælp af en konstant-flow perfusion system.
- Når anskaffelsen er færdig, Luk excitations lys lukkeren hvis nødvendigt. Gemme optagelsen til harddisken.
- Forlader optagelsesindstillinger (dvs., eksponeringstid, billedfrekvens og lysintensitet) uændret, udføre en optagelse af baggrunden fluorescens (som i trin 2.11) over et område af den coverslip, der ikke indeholder celler eller en anden coverslip som ikke celler har været seedet.
Bemærk: Hvis sekventielle målingerne udføres uden at ændre indstillingerne for erhvervelse, kun én baggrund fluorescens optagelse er nødvendigt for alle disse målinger. - Hvis det ønskes, skal du udføre yderligere forsøg (trin 2.4 – 2.13) på forskellige iPSC-CMs placeret på den samme coverslip. Vær opmærksom på at alle CMs på coverslip vil blive berørt i tilfælde af et stof blev anvendt.
3. analyse
> Bemærk: Afhængigt af den software til billedbehandling anvendes (der er typisk en proprietær softwarepakke leveret af producenten af kameraet eller den hele fluorescens imaging system), det kan være muligt at udføre analysen af de erhvervede billeder delvis eller endog helt inden for denne softwarepakke. Dog her en arbejdsproces af billedanalyse, der kan udføres med open source-software (dvs., image analyse platform ImageJ)16, som bekvemt kan installeres ved hjælp af en distribution som Fiji17, og pakken R for statistiske computing18 er beskrevet. Kort, regioner af interesse (ROIs) repræsenterer celler eller baggrund tegnes i ImageJ, og den gennemsnitlige fluorescens i disse ROIs over tid er eksporteret til en fil, derefter, yderligere analyseres i R eller, alternativt, med regneark software.
- I billedbehandlingsprogrammer, gemme eller eksportere erhvervede billede tidsserier (både optagelse med cellerne og den tilsvarende baggrund optagelse) til et format (f.eks.TIF), der kan læses af ImageJ. Alternativt, brug BioFormats plugin (https://imagej.net/Bio-Formats), som giver rutiner aktivering ImageJ læse navnebeskyttet filformater fra forskellige mærker af imaging systemproducenter.
Bemærk: I følgende trin antages det at billeddannelse intervallerne er de samme i hele optagelsen. Hvis dette ikke er tilfældet, kan det være nødvendigt at eksportere timing information fra den software til billedbehandling og medtage den i den videre analyse. - Åbn TIF stakken med cellerne i ImageJ.
- Brug værktøjet frihånd markering til at tegne en ROI over en fluorescerende cardiomyocyte i den røde kanal. Sikre, at Investeringsafkastet er stor nok, så cellen ikke bevæger sig ud af ROI mens kontraherende.
- Åbn ROI manager plugin («analyser | Værktøjer | ROI Manager'), og tryk på knappen 'Tilføj [t]' tilføje denne ROI som ROI1.
- Træk ROI over den samme celle i den grønne kanal og tilføje denne ROI som ROI2.
- I ' analysere | Sæt målinger menuen Fravælg alle indstillinger undtagen 'Betyder grå værdi'.
Bemærk: Det har at blive skakmat en ImageJ session kun 1 x. - ROI manager, tryk på ' mere | Multi foranstaltning ' knappen. Vælg indstillingerne 'Måle alle skiver' og 'Én række pr. Skive' og tryk 'OK'. Der åbnes et vindue, der indeholder et regneark med tre rækker (Skive antallet og den gennemsnitlige fluorescens i de to ROIs der repræsenterer cellen i røde og den grønne kanal, henholdsvis).
- Brug ' fil | Gem som at gemme regnearket i en fil med semikolonseparerede værdier (CSV) fil.
- Luk vinduet med billedstak og vinduet regneark uden at lukke vinduet ROI manager. Åbn TIF stakken indeholder baggrund måling.
- ROI manager, tryk på ' mere | Multi foranstaltning' knappen. Vælg indstillingerne 'Måle alle skiver' og 'Én række pr. Skive' og tryk 'OK'.
- Brug ' fil | Gem som at gemme regnearket med baggrundsdata til en CSV-fil.
Bemærk: Følgende beregninger kan gøres med regneark software. Vi brugte R software18. Et simpelt eksempelscript, der læser den celle og baggrunden data fra filer "cell.csv" og "background.csv" udfører beregninger, og afbilder tid løbet af membran potentiale signalet leveres som supplerende kode fil 1. - Baggrund-optagelse, beregnes den gennemsnitlige intensitet i røde og den grønne kanal. Trække denne baggrund signal fra de signaler, der repræsenterer cellen i den røde og grønne kanal til at beregne baggrundskorrigeret RFP og normal god landbrugspraksis signaler, henholdsvis.
- Beregn forholdet RFP/normal god landbrugspraksis som et surrogat for membran potentiale.
Bemærk: Dette forhold er dimensionsløs. Alternativt kan det være normaliseret til sin oprindelige værdi (dvs., ΔR/R0). Vigtigere, er nyttige oplysninger indeholdt i de tidsmæssige ændringer ikke i de absolutte værdier af dette forhold. På grund af ulige photobleaching af normal god landbrugspraksis og en RFP opstà ¥ r en baseline drift i dette forhold. Hvis det er nødvendigt, kan sådan en baseline drift rettes ved at konstruere en oprindelig kurve og fratrække det fra RFP/NGL forholdet10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 4a, er en repræsentativ enkelt iPSC-CM afbildet med hvide punkterede linjer mærkning ROI trukket under imaging analysen i RFP (venstre) og normal god landbrugspraksis (højre side)-kanal. Signalet fra RFP kanal viser en periodisk stigning i fluorescerende intensitet under hver aktionspotentialet (figur 4b, øverste panel). Som beskrevet i indledningen, er det på grund af en stigende FRET forårsaget af ændringer i den membran potentiale (figur 1). Konkurrenceloven, viser normal god landbrugspraksis signal en periodisk fald i fluorescerende intensitet (figur 4b, midterste panel). RFP/NGL ratio (figur 4b, nederste panel) er den biologiske signal bruges i efterfølgende analyser, som APD50 og APD90 målinger. Ved hjælp af denne metode, 30 dage gamle ventrikulær-lignende iPSC-CMs tempo på 0,5 Hz viste en gennemsnitlig APD50 (varighed fra begyndelsen af aktionspotentialet indtil repolarisering er afsluttet med 50%) af 439 ms (± 46 ms) og en gennemsnitlig APD90 (varighed indtil repolarisering er afsluttet med 90%) af 520 ms (± 47 ms) (fig. 4 c).
Figur 4: principper af billedanalyse og grundlæggende aktionspotentialet karakteristika. (en) den samtidig indspillede RFP (højre side) og normal god landbrugspraksis (venstre side) Fluorescens af en enkelt iPSC-CM er vist. De hvide stiplede linjer repræsenterer områder af interesse (ROI) anvendes til billedbehandling analyse. (b) Raw spor af baggrundskorrigerede RFP, normal god landbrugspraksis, og RFP/NGL signaler afledt af ROI er vist. (c) midler og SEM af APD90 og APD50 af enkelt ventrikulær-lignende iPSC-CMs ved stuetemperatur og med 0,5-Hz pacing er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at vise, at metoden også er i stand til at opfange ændringer i aktionspotentialet varighed, var iPSC-CMs elektrisk stimuleres ved øget stimulation priser spænder fra 0,4 til 2,5 Hz, øge sats hver fem beats (figur 5). En typisk optisk indspillet membran potentielle signal fra en iPSC-CM er vist i figur 5a. De første fire handling potentialer på hver slå sats var gennemsnit, demonstrerer en progressiv afkortning af handling potentialer ved øget slå satser (figur 5b). Gennemsnit efterfølgende tempofyldt beats er en effektiv metode til at reducere støj iboende til optisk indspillet handling potentialer10. Det bør nævnes, at afbillede eksperimentet ikke kunne fange det fulde beløb af sats-afhængige aktionspotentialet afkortning muligt, i betragtning af at vi tempo cellen til kun fem slag på hver pacing sats, hvilket ikke måske er tilstrækkelige til at nå ligevægt.
Figur 5: effekten af pacing hyppigheden af aktionspotentialet varigheden. (en) En iPSC-CM var tempo på stigende frekvenserne spænder fra 0,4 til 2,5 Hz som angivet (enkelt elektrisk pacing pulserne er repræsenteret ved pilene). (b) For hver pacing frekvens, en gennemsnit AP blev beregnet ud fra de første fire APs ved denne frekvens. De gennemsnit APs afbildet som en overlejring, demonstrerer AP afkortning med stigende pacing priser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Metoden kan også bruges til at undersøge elektrofysiologiske virkninger af lægemidler anvendt til iPSC-CMs (figur 6). Her, blev isoprenalin, en ikke-selektiv β-adrenoreceptor agonist, anvendt til spontant-slå iPSC-CMs som angivet, fører til en hurtig stigning i den slå (figur 6a). En dosis-respons kurve viser effekten af forskellige Isoproterenol koncentrationer på slå hyppigheden af iPSC-CMs er vist i fig. 6b.
Figur 6: effekten af isoprenalin på slå frekvens. (en) repræsentative rå optisk aktionspotentialet sporing af et spontant bankende enkelt iPSC-CM er vist. Isoproterenol (med en endelig koncentration på 1 µM) blev føjet til iPSC-CMs, som angivet ved baren. (b) denne dosis-respons kurve viser effekten af forskellige isoproterenol koncentrationer på slå hyppigheden af iPSC-CMs. fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her giver en optisk registrering af APs fra en bestemt undertype (dvs., ventrikel-lignende celler) af CMs genereret fra menneskelige iPSCs. Menneskelige iPSC-CMs er en spirende værktøj til at løse en lang række biologiske og medicinske problemer, og differentiering til forskellige CM undertyper er en vigtig kilde til eksperimentel variation. Ved hjælp af specifikke promotor elementer, er udtryk for en GEVI specifikt opnået i CMs repræsenterer undertype af interesse, som er derefter optisk afbildet.
Vellykket erhvervelse af APs fra enkelt iPSC-CMs, afhænger af den reseeding tæthed efter dissociation. Hvis cellerne er tilsås for tæt, er det tidskrævende at finde isolerede enkelt iPSC-CMs, der ikke er en del af en elektrisk syncytium. Dog påvirker også lav seeding tætheder negativt overlevelsen af cellerne. Således, en systematisk afprøvning af forskellige seeding tætheder er anbefalet, især før de indleder eksperimenter, der er afhængige af høj overførselshastighed billeddannelse.
Under image erhvervelse gennemgår VSFP photobleaching, som kan påvirke negativt signal / støj-forhold, især under længere eksperimenter. Hvis hurtig photobleaching er til stede under eksperimentet, venligst sikre at excitations lys lukkeren kun åbnes under image erhvervelse eller ved nødvendige præparationstrin (søger efter og fokuserer på at udtrykke VSFP celler), som bør være udføres så hurtigt som muligt. Derudover reducere styrken i excitation lys til det nødvendige minimum og gøre brug af det dynamiske område af høj følsomhed kameraet bruges til billede erhvervelse.
Når du tegner ROI under billedanalyse, være opmærksom på at iPSC-CMs flyttes under sammentrækning og bør forblive inden for ROI i alle billederne i en billedstak. På grund af ratiometric karakteren af VSFP, enhver bevægelse af cellen ud af ROI fører ikke til kunstige signaler men kan påvirke negativt signalkvalitet. Men ROIs, der er for store og omfatter unødigt store ikke-signal-producerende områder også negativt påvirker signal / støj-forhold og bør undgås.
For at opnå Repræsentative resultater, differentieret iPSC-CMs, der har fået lov til at modnes i mindst 30 dage efter et hjerte induktion er blevet brugt. Efter denne periode med modning, forskellige CM undertyper, såsom nodal-, atrieflimren-, eller ventrikulær-lignende celler kan skelnes. Disse celler er stadig umodne og nå kun en embryonale-lignende fænotype på todimensionelle (2D) kultur systemer påvirker elektriske egenskaber samt calcium håndtering af19. Disse generelle begrænsninger af iPSC-CMs skal betragtes, som de kan forvirre eksperimentelle resultater uafhængigt af metoden bruges til at måle handling potentialer. Mere avancerede tre-dimensionel (3-D) kultur systemer har vist lovende resultater mod yderligere modning20, og metoden beskrevet her kunne være værdifuldt i denne sammenhæng.
Den nuværende guld standard for måling APs af iPSC-CMs er patch klemme optagelser, som giver mulighed for en meget detaljeret analyse af forskellige AP egenskaber og muliggør endda måling enkelt ion-kanal strømninger. Derudover kan absolutte værdier (f.eks., den hvilende membran potentiale) måles. Derimod er optisk AP optagelser baseret på relative ændringer af membran potentiale. På grund af den relativt langsomme iboende kinetik af VSFP, visse AP egenskaber, såsom "overskridelsen", kan være afrundede fra aflæsninger og en meningsfuld kvantificering af hurtig funktioner, såsom AP upstroke hastighed, er det ikke muligt. Dog i en typisk eksperimentel set-up, ikke de absolutte værdier, men forskelle i værdier (f.eks.mellem forskellige cellelinjer eller før og efter anvendelsen af et stof) er målt. Dette kan opnås pålideligt med optisk metoden i dette manuskript til egenskaber som AP varighed (f.eks. APD90 eller APD50) eller slå sats, med en meget højere overførselshastigheder i forhold til patch klemme10 . Desuden, denne teknologi ikke-invasiv art tillader flere målinger af den samme celle over tid10. Optisk AP optagelser og patch klemme bør således betragtes som supplerende redskaber og anvendes alt efter de eksperimentelle spørgsmål, der skal besvares.
Optisk AP optagelser kan opnås enten ved udtryk for en GEVI eller ved anvendelse af en potentiometrisk fluorescerende farvestof (fx, di-8-ANEPPs)21. De fluorescerende farvestoffer er normalt mere gunstig fluorescens kinetik men ikke kan rettes til en bestemt undertype af cardiomyocytes, som de ikke er genetisk-kodet. En række GEVIs baseret på forskellige funktionsprincipper har været udviklede22. Her, er FRET-baserede GEVI VSFP-CR11 brugt. Den største årsag til dette valg var ratiometric karakteren af denne indikator, der reagerer på cellulære depolarisering med en stigning i rød og et fald i grøn fluorescens, hvis de grønne fluorescerende proteiner er glade. Dette er fordelagtigt inden for kardiologi, fordi sådan en ratiometric indikator er mindre modtagelige for artefakter forårsaget af celle bevægelser skyldes sammentrækninger af cardiomyocytes end indikatorer, der reagerer på depolarization kun ved en ændring af deres Fluorescens intensitet.
Mens kun resultater fra eksperimenter målretning ventrikulær-lignende iPSC-CMs ved hjælp af MLC2v forstærker præsenteres her, er det også muligt at målrette atrieflimren - eller nodal-lignende CMs ved hjælp af forskellige undertype-specifikke promotor elementer10. For at beskrive metoden i detaljer, dette manuskript fokuseret på imaging enkelt iPSC-CMs, der har været seedet på et glas coverslip, da dette muliggør analysen af AP egenskaber af enkelt celler og giver den højeste signal / støj-forhold. Denne teknologi sætter imidlertid også billeddannelse af CMs, der er integreret med andre celler i en elektrisk syncytium eller en 3D-struktur. Dette er af særlig interesse som 3D-celle kultur modeller anvendes i stigende grad og har vist sig at give egenskaber adskiller sig fra 2-D modeller20. Afhængigt af den billeddiagnostiske set-up og definitionen af ROIs, kan optiske signaler analyseres fra større områder af den 3D-væv eller fra enkelt celler i vævet. Desuden flere celler kan være afbildet samtidigt og analyseres separat, fører til en betydelig stigning i overførselshastighed.
Tilsammen, kan den metode, der præsenteres her forbedre anvendeligheden af iPSC-CMs inden for arytmi forskning ved at aktivere den hurtige optiske fænotyper af iPSC-CMs for arytmi-relaterede fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den tyske Research Foundation (Si 1747/1-1), andet Kröner-Fresenius-Stiftung og Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
