Summary
Her presenterer vi en metode til optisk image handling potensial, spesielt i ventrikkel som indusert pluripotent Stamcelle-avledet cardiomyocytes. Metoden er basert på arrangøren-drevet uttrykk for en spenning-sensitive fluorescerende protein.
Abstract
Cardiomyocytes generert fra menneskelige indusert pluripotent stamceller (iPSC-CMs) er en nye verktøy i hjerte forskning. Snarere enn å være en homogen populasjon av celler, iPSC-CMs generert av gjeldende differensiering protokoller representerer en blanding av celler med ventrikkel-, atrial-, og knutepunktet-lignende fenotyper, kompliserer fenotypiske analyser. Her vises en metode til optisk posten handling potensial spesielt fra ventrikkel-lignende iPSC-CMs. Dette oppnås ved lentiviral signaltransduksjon med en konstruksjon som en genetisk kodet spenning indikator er under kontroll av et ventrikkel-spesifikke promoter element. Når iPSC-CMs er transduced med denne konstruksjonen, uttrykkes spenningssensoren utelukkende i ventrikkel-lignende celler, slik at Undertypespesifikke optisk membran potensielle innspillinger med time-lapse fluorescens mikroskopi.
Introduction
Cardiomyocytes (CMs) avledet fra indusert pluripotent stamceller (iPSCs) er en nye verktøy for å analysere molekylære mekanismer av hjertesykdom, undersøke romanen terapi, og skjermen for uønskede cardiac narkotika effekter1,2 ,3. Helt fra starten, har arrhythmogenic sykdommer som channelopathies vært et viktig fokus i denne forskning området4. Følgelig er metoder for å undersøke elektrisk fenotyper CMS, som arytmi eller endringer i handlingen potensial (AP) morphologies, i hjertet av denne teknologien.
En viktig faktor i anvendelsen av iPSC-CMs er at gjeldende cardiac differensiering protokoller ikke resultere i en homogen populasjon av celler. I stedet er de snarere en blanding av celler som ligner sinus node, atrial, og ventrikkel CMs på ulike nivåer av modning5,6,7,8. Denne heterogene kan være en relevante kilde av eksperimentell variasjoner, spesielt hvis parametere som AP varighet (APD) er undersøkt, som egentlig skiller mellom CM-deltyper (f.eksAPD er kortere atrial enn i ventrikkel CMs). Konvensjonelle tilnærming til dette problemet er å undersøke enkelt iPSC-CMs med metoden oppdateringen klemme og klassifisere hver celle som knutepunktet-, atrial-, eller ventrikkel som, basert på dens AP morfologi9. Alle påfølgende analyse kan deretter begrenses til cellene representerer CM undertypen av interesse. Den store ulempen med denne strategien er den begrenset produksjon og mangel på skalerbarhet. Dessuten tillater ikke invasiv art på oppdateringen klemme elektrofysiologi avbilding av de samme cellene sekvensielt over lengre tidsperioder.
Her gir vi eksperimentelle detaljer på en metode10 utvilket optisk image APs i bestemte undergrupper av iPSC-CMs. Dette overvinner problemet med undertypen heterogenitet og øker dramatisk i forhold til konvensjonelle metoder, slik at den raske phenotyping for iPSC-CMs bærer genetisk varianter eller blir utsatt for farmakologisk agenter.
Oversikt over Undertypespesifikke optisk tenkelig tilnærming
En genetisk kodet spenning indikator (GEVI), fluorescens egenskapene endre depolarization og repolarisasjon i cellemembranen, brukes å optisk image endringer av membran potensialet i CMs. GEVI brukt her er spenning-sensing fluorescerende protein VSFP-CR11, som består av et spenning-sensing transmembrane domene smeltet til et par av en grønn (kløver) og en rød (mRuby2) fluorescerende protein (figur 1A). På grunn av nærheten til de to fluorophores, magnetisering av grønne fluorescerende protein resultater på en brøkdel av eksitasjon overføres til den røde fluorescerende protein via han selvmord resonans energioverføring (bånd). Derfor resulterer magnetisering av grønne fluorescerende protein i et utslipp fra både grønne og røde fluorescerende proteiner (figur 1A, øvre panel). Når cellen depolarizes, oppstår det en strukturell omorganisering av spenningssensoren som oversetter til en nyorientering av to fluorescerende proteiner, øke bånd effektiviteten. Dermed overføres enda mer av eksitasjon fra grønn til rød fluorescerende protein (figur 1A, nedre panel). Resultatet i en depolarized celle, grønne fluorescens utslipp er dimmer og røde fluorescens utslipp er lysere enn i en celle på hvile membran potensial (figur 1B).
Figur 1: optisk avbilding av membran potensial med VSFP-Kreditnotabeløp (A) A skjematisk som spenning-sensitive fluorescerende protein VSFP-CR vises. Ved depolarization i cellemembranen oversettes en strukturell omorganisering i spenning-sensing transmembrane domenet til en nyorientering i grønt (GFP) og rød (RFP) fluorescerende protein, øke effektiviteten av den intramolekylære han selvmord resonans energioverføring (bånd). (B) utslipp spektra av en VSFP på magnetisering av GFP i cellene på hvile membran potensialet (øvre panel) og depolarized celler (nedre panel) er avbildet. Spectral endringen på depolarization er overdrevet for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Endringene i bånd effektiviteten speiling svingninger membran potensial er avbildet med fluorescens mikroskop utstyrt med en bilde splitter, som skiller røde og grønne fluorescens utslipp og prosjekter dem på to tilstøtende områder av chip til et sCMOS kamera (figur 2). Med dette oppsettet, kan fluorescens utslipp på to forskjellige bølgelengde band tas opp samtidig, som gjør beregningen av forholdet rød til grønn fluorescens å reflektere membranen i hvert bilde av en time-lapse serie.
Figur 2: konfigurasjonen av tenkelig systemet. Hovedkomponentene tenkelig systemet brukes til bilde spectral endringene av spenning-sensitive fluorescerende protein speiling endres membran potensial med en høy timelige oppløsning er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Uttrykk for VSFP-CR i CMs oppnås ved lentiviral signaltransduksjon. For direkte uttrykk til CM undertypen av interesse, inneholder lentivirus et arrangøren element ( MLC2v forsterker) som spesielt driver transkripsjon i ventrikkel-lignende iPSC-CMs10. Når iPSC-CMs som representerer en blanding av cellene atrial-lignende, knutepunktet-lignende og ventrikkel som er transduced med denne lentivirus, er VSFP-CR uttrykt i ventrikkel som cellene. Siden optisk handling potensial avbilding avhenger fluorescerende sensor, representerer de registrerte handlingen potensialene utelukkende CM undertypen av interesse (Figur 3).
Figur 3: Promoter-drevet VSFP uttrykk for Undertypespesifikke membran potensielle bildebehandling. (en) dette skjematisk viser hvordan cardiomyocyte Undertypespesifikke optisk handling potensial recordings er oppnådd. (b) iPSC-CMs infisert med en VSFP under kontroll av ventrikkel-spesifikke MLC2v-enhancer vises. Uttrykk for spenningssensoren er observert i ventrikkel-lignende CMs i GFP kanalen (venstre panel). Kontrast (midten panel) og overleggsbildet (høyre panel) tilbys også. De hvite prikkete merke cellekantlinjene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av iPSC-avledet Cardiomyocytes for Imaging
Merk: Metoder for iPSC kultur og cardiac differensiering blitt publisert før12,13,14 og er ikke omtalt her i detalj. Rensing av iPSC-CMs manuell microdissection, magnetiske celle separasjon eller laktat utvalg anbefales, avhengig av differensiering protokollen som brukes. For følgende protokollen, ble microdissected explants fra slo områder, generert ved hjelp av en monolayer differensiering protokollen13, tatt på dag 15 av en hjertestans differensiering og kultivert inntil dag 30 på fibronectin-belagte plater som beskrevet før10.
- Ta cellen kultur plater av inkubatoren og manuelt samle cardiac explants i microcentrifuge rør med en 200 µL pipette. Etter sedimentering, Sug opp cellen kulturen supernatant og forsiktig vaske explants 2 x med Hank er balansert salt løsning (HBSS).
- Distansere iPSC-CMs ved å legge collagenase type II (430 U/mL i HBSS) og Inkuber dem på 37 ° C i 30 min.
- Etter sedimentering gjenværende store cellen grupperer, samle nedbryting som inneholder dissosiert enkelt iPSC-CMs og legge dette til frisk CM vedlikehold medium som inneholder en høy fosterets bovin serum (FBS) konsentrasjon (DMEM-F12, 20% FBS, 2 mM L-Glutamine, 1: 100 MEM ikke-essensielle aminosyrer, 100 U/mL penicillin-streptomycin og 0,1 mM β-mercaptoethanol).
- Gjenta dissosiasjon hvis store celle klumper forblir. Samle single iPSC-CMs med sentrifugering og resuspend dem i CM medium som inneholder en lav FBS konsentrasjon (2% FBS).
- Nytt frø enkelt iPSC-CMs i en tetthet slik at etterfølgende avbilding av enkeltceller på en 3,5 cm glass bunn celle kultur microdish som har vært belagt med fibronectin (2 µg/cm2). Optimalisere seeding tetthet før engasjerende i høy gjennomstrømming eksperimenter. Vanligvis er 5-10 cardiac explants per 3,5 cm parabolen nok; Imidlertid avhenger dette tungt på explant størrelse og renhet.
- Kultur enkelt iPSC-CMs etter deres dissosiasjon i CM vedlikehold medium som inneholder 2% FBS for minst 48 timer å sikre en tilstrekkelig utvinning.
Merk: I de neste trinnene iPSC-CMs er transduced med en lentivirus koding GEVI VSFP-CR under kontroll av en MLC2v enhancer10 for å oppnå et ventrikkel-spesifikke GEVI uttrykk. Alternativt kan lentiviral konstruksjoner tillater for å uttrykke GEVI spesielt i knutepunktet - eller atrial som celler eller en uspesifikke konstruere skjuler overalt uttrykt PGK selskapet, være brukt10. Lentiviral plasmider er tilgjengelig på forespørsel.
Advarsel: Når du arbeider med lentiviral partikler, sikre at arbeidsmiljøet har tilstrekkelig biosikkerhet nivået, overholder sikkerhetsinstruksjonene for arbeid med potensielt smittestoffer, og ta de nødvendige forholdsreglene. - Forberede infeksjon medium ved å blande lentivirus10-inneholder cellekultur supernatant, som har blitt produsert i HEK293 celler som beskrevet før15, med CMs vedlikehold medium (se trinn 1.3) i en 1:1 ratio.
- Legg hexadimethrine bromide i en siste konsentrasjon av 8 µg/mL å forbedre infeksjon effektiviteten.
Merk: På grunn av den høye infeksjonen effektiviteten av iPSC-CMs tidligere konsentrasjonen av lentivirus gjennom ultracentrifugation er vanligvis ikke nødvendig. - Sug opp CM vedlikehold mediet enkelt iPSC-CMs og erstatte den med infeksjon mediet utarbeidet under trinn 1,7 og 1,8. Kultur infiserte enkelt iPSC-CMs i infeksjon medium for 12 h på 37 ° C. Deretter Sug opp mediet og erstatte den igjen med CM vedlikehold medium.
Merk: Et fluorescens signal fra GEVI vises 48 timer etter smitte. Bilde av membran potensialet opptakene anbefales, 72 h etter smitte tidligst å sikre et riktig signalstyrke. Enkelt infiserte iPSC-CMs kan kultivert i minst 3 uker og fotografert sekvensielt. Hvis omfattende photobleaching oppstår under en tenkelig, gjenoppretter fluorescens signalet over tid. - Før bildebehandling, utveksle celle kultur medium av Tyrodes løsning med Ca2 + (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM glukose, 1,8 mM CaCl2og 10 mM HEPES; pH 7.35).
2. optisk membran potensial Recordings
- Plass tenkelig kammeret som inneholder iPSC-CMs på scenen av en omvendt epifluorescence mikroskop utstyrt med en bilde splitter, aktuelle filteret sett og et kamera (f.eks, en sCMOS-kamera) som høyhastighets bildebehandling på et høyt følsomhet.
Merk: For eksempel bruke en 480/40 nm båndpass eksitasjon filtrere kombinert med 500 nm lang-pass dichroic speil i mikroskopet, og et 568 nm lang-pass dichroic speil kombinert med 520/28 nm og 630/75 nm båndpass utslipp filtre i bilde splitter. For encellede bildebehandling gir en høy forstørrelse, høy-numerisk-blender nedsenking oljeobjektiv beste signal-til-støy-forhold. - Hvis elektrisk pacing kreves, installere pacing elektrodene i tenkelig kammeret og koble dem til en stimulans generator.
Merk: Vi brukte en pacing innsatt som inneholdt to platina elektroder og montert i 3,5 cm glass bunn celle kultur retter. Cellene mellom elektrodene ble fotografert. Typisk pacing parametere er rektangulære pulser av 5 ms varighet, med en amplituden til 10 V/cm elektrode avstand. - Alternativt kan du bruke en oppvarmet microscope scene for å sikre en jevn temperatur på iPSC-CMs under avbildning eller med et mikroskop inkubasjon kammer oppsett hvis langsiktige imaging er ment.
- Ta med cellene å fokusere og plassere en celle uttrykke GEVI i midten av feltet ser.
Merk: Dette er mest praktisk gjort ved hjelp av okularene av mikroskopet ved hjelp av en grønn fluorescerende protein (GFP) eller en rød fluorescerende protein (RFP) filteret satt til å identifisere celler som uttrykker GEVI. - Angi den optiske banen slik at lyset fra cellen rutes til bilde splitter. Bytte filter kuben i mikroskopet til den å bli kombinert med filtrene i bilde splitter (se Tabell for materiale).
- Angi oppkjøpet innstillingene i programvaren kontrollere kameraet slik at høyhastighets imaging (f.eks, 100 bilder per sekund, med en eksponeringstid på 10 ms hver ramme) er mulig.
Merk: Vanligvis er dette innebærer binning kameraet piksler (f.eks8 x 8 piksler av kameraet chip er binned vil generere én piksel i time-lapse filmen). - Definere bilde splitter i henhold til produsentens instruksjoner. De to bildene som representerer de to forskjellige utslipp bølgelengde bandene bør være ved siden av hverandre, hver med en halvdel av bildet.
Merk: Dette trinnet må være utført bare 1 x i begynnelsen av hver tenkelig økt. - Kontroller og, om nødvendig justere fokus av bildet produsert av kameraet.
- Juster lysstyrken på belysning lyset slik at alle metning pikslene unngås; Dette kan gjøres enkelt ved hjelp av en fargepalett som mettet piksler er representert med en unik farge.
Merk: Under alle disse forberedelser før bildebehandling, begrense eksponering for eksempel magnetisering lys til den nødvendige mengden (dvs.ikke la lyset på for utbygget perioder) å unngå photobleaching av GEVI. - Definere oppkjøpet av tiden serien (f.eks, 5 000 bilder på 100 bilder per sekund for en serie varighet på 50 s). Dempe lyset i rommet (inkludert dataskjermer) for å unngå uønsket lys påvirker måling. Hvis eksitasjon lys lukkeren ikke er kontrollert av tenkelig programvare, kan du åpne den like før oppkjøpet.
- Starte oppkjøpet av bildet serien. Hvis elektrisk pacing ønskes, start pacing sekvensen på det aktuelle tidspunktet, hvis det startes automatisk av tenkelig programvare. Hvis programmet en farmakologisk agent er ønsket, gjør dette enten manuelt (f.eksav pipettering 100 µL av agent i en tidoblet slutten konsentrasjon til opptak kammeret som inneholder 900 µL av bufferen, og forsiktig blande det med pipette) eller en konstant flyt perfusjon system.
- Når oppkjøpet er fullført, Lukk eksitasjon lys lukkeren om nødvendig. Lagre opptaket på harddisken.
- Leaving innspillingsalternativene (dvs., eksponeringstid, bildefrekvens og lysintensiteten) uendret, utføre en innspilling av bakgrunnen fluorescens (som trinn 2.11) over en region av dekkglassvæske ikke inneholder celler eller en annen dekkglassvæske som ikke celler har blitt sådd.
Merk: Hvis sekvensiell mål utføres uten å endre innstillingen oppkjøpet, eneste bakgrunnen fluorescens innspillingen er nødvendig for alle disse målingene. - Eventuelt kan du utføre flere eksperimenter (trinn 2.4-2.13) på forskjellige iPSC-CMs ligger på den samme dekkglassvæske. Vær oppmerksom på at alle CMs på dekkglassvæske påvirkes i tilfelle et stoff som ble brukt.
3. analyse
> Merk: Avhengig av bildebehandlingsprogramvare brukes (som vanligvis er en proprietær programvarepakke leveres av produsenten av kameraet eller den hele fluorescensen tenkelig system), kan det være mulig å utføre analyse av ervervet bilder delvis eller i denne programvarepakken. Men her en arbeidsflyt av bildeanalyse som kan utføres med åpen kildekode (dvs.bildet analyse plattformen ImageJ)16, som kan installeres enkelt bruke en distribusjon som Fiji17og R-pakke for Statistisk databehandling18 er beskrevet. Kort, regioner av interesse (ROIs) som representerer celler eller bakgrunn tegnes i ImageJ og mener fluorescens i disse ROIs over tid eksporteres til en fil, deretter videre analyseres i R eller alternativt med regneark.
- I tenkelig programvare, lagre eller eksportere ervervet bildet tidsserien (opptak som inneholder cellene og tilsvarende bakgrunnen innspillingen) til et format (f.eksTIF) som kan leses av ImageJ. Alternativt, bruk BioFormats plugin (https://imagej.net/Bio-Formats), som gir rutiner slik at ImageJ lese proprietære filformater fra forskjellige merker av tenkelig systemprodusenter.
Merk: De følgende trinnene forutsetter at tenkelig intervallene er det samme hele innspillingen. Hvis dette ikke er tilfelle, kan det være nødvendig å eksportere timing informasjonen fra tenkelig programvare og inkludere den i ytterligere analyse. - Åpne TIF stakken inneholder cellene i ImageJ.
- Bruk Frihånd markeringsverktøyet til å tegne en avkastning over en fluorescerende cardiomyocyte i den røde kanalen. Kontroller at Avkastningen er store nok slik at cellen ikke flytte ut av Avkastningen mens kontrahering.
- Åpne ROI manager plugin ("analyser | Verktøy | ROI Manager') og trykk på "Legg til [t]" for å legge denne avkastning som ROI1.
- Dra Avkastningen over samme celle i den grønne kanalen og legge dette avkastning som ROI2.
- I ' analysere | Angi mål menyen, Fjern merket for alle alternativene unntatt 'Betyr grå verdi'.
Merk: Dette må gjøres bare 1 x i en ImageJ økt. - Trykk på i Avkastningen manager, "mer | Multi mål ' knappen. Velg alternativene 'Måle alle skiver' og 'Én rad per sektor' og trykk 'OK'. Det åpnes et vindu som inneholder et regneark med tre rader (hvor skive og den mener fluorescensen i de to ROIs representerer cellen i røde og den grønne kanalen, henholdsvis).
- Bruk ' filen | Lagre som å lagre regnearket i en kommadelt fil (CSV).
- Lukk vinduet med bildestakk og vinduet regneark uten å lukke vinduet ROI manager. Åpne TIF stakken inneholder bakgrunn målingen.
- Trykk på i Avkastningen manager, "mer | Multi mål' -knappen. Velg alternativene 'Måle alle skiver' og 'Én rad per sektor' og trykk 'OK'.
- Bruk ' filen | Lagre som å lagre regnearket med bakgrunn dataene til en CSV-fil.
Merk: Følgende beregninger kan gjøres med regneark. Vi brukte R programvare18. Et enkelt eksempelskript som leser den celle og bakgrunn data fra filer "cell.csv" og "background.csv" utfører beregningene og tomter tid løpet av membran potensialet signalet er gitt som supplerende kode filen 1. - Fra bakgrunnen innspillingen, beregne gjennomsnitt intensiteten i røde og den grønne kanalen. Trekk denne bakgrunn signal fra signaler som representerer cellen i røde og grønne kanalen å beregne bakgrunn-korrigert RFP og GFP signaler, henholdsvis.
- Som et surrogat for membran potensial, beregne forholdet RFP/GFP.
Merk: Dette forholdet er dimensjonsløs. Alternativt kan det normaliseres til den opprinnelige verdien (dvs., ΔR/R0). Viktigere, finnes nyttig informasjon i timelige endringene i stedet for absolutte verdier for dette forholdet. På grunn av ujevn photobleaching GFP og RFP, kan det oppstå en planlagt drift i dette forholdet. Om nødvendig kan slik opprinnelige drift rettes ved å opprette en planlagt kurve og trekke det fra RFP/GFP forholdet10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 4a, er en representant enkelt iPSC-CM avbildet med hvite stiplede linjer markerer Avkastningen trukket under tenkelig analysen RFP (venstre) og GFP (høyre side) kanalen. Signalet fra RFP kanalen viser en periodisk økning i fluorescerende intensitet under hver handling potensial (figur 4b, øvre panel). Som beskrevet i innledningen, skyldes dette en økende bånd skyldes endringer i membranen potensielle (figur 1). Concordantly, viser GFP signalet en periodisk nedgang i fluorescerende intensitet (figur 4b, midtre panelet). RFP/GFP er (figur 4b, nedre panel) biologisk signalet i nedstrøms analyser, som APD50 og APD90 målinger. Ved hjelp av denne metoden, 30 dager gamle ventrikkel-lignende iPSC-CMs tempo ved 0,5 Hz viste en gjennomsnittlig APD50 (varigheten fra begynnelsen av handlingen potensialet til på repolarisasjon ferdig med 50%) av 439 ms (± 46 ms) og en gjennomsnittlig APD90 (varighet til på repolarisasjon ferdig med 90%) av 520 ms (± 47 ms) (Figur 4 c).
Figur 4: prinsipper for bildeanalyse og grunnleggende handling potensial egenskaper. (en) samtidig opptak RFP (høyre side) og GFP (venstre) fluorescens en enkelt iPSC-cm vises. De hvite prikkete representerer områder av interesse (ROI) brukes for bildebehandling analyse. (b) Raw spor av bakgrunn-korrigert RFP, GFP, og RFP/GFP signaler fra Avkastningen vises. (c) midler og SEM av APD90 og APD50 av enkelt ventrikkel-lignende iPSC-CMs ved romtemperatur og med 0,5-Hz pacing vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å demonstrere at metoden er også kan fange endringer i handlingen potensial varighet, var iPSC-CMs påtrykkes øke stimulering priser varierer fra 0,4 til 2,5 Hz, øke renten hver fem slag (figur 5). Et typisk optisk-innspilte membran potensielle signal fra en iPSC CM er vist i figur 5a. Fire første handling potensial på hver juling rate var gjennomsnitt, demonstrere en progressiv forkortelse av handlingen potensial til økt juling priser (figur 5b). Snitt påfølgende tempo beats er en effektiv metode for å redusere støyen iboende optisk-innspilte handling potensialer10. Det bør nevnes at avbildet eksperimentet ikke kan fange opp hele beløpet rate-avhengige handling potensial forkorte mulig, gitt at vi tempo cellen for bare fem beats på hver pacing rente, som ikke kanskje er tilstrekkelig til å nå likevekt.
Figur 5: effekten av pacing frekvensen på hele handlingen potensial. (en) En iPSC CM var tempo øke frekvensene fra 0,4 til 2,5 Hz som angitt (de enkelt elektriske pacing pulser vises med piler). (b) For hver pacing frekvens, en gjennomsnitt AP ble beregnet fra de fire første APs på denne frekvensen. Gjennomsnitt APs tegnes som et overlegg, demonstrere AP forkortelse med økende pacing priser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Metoden kan også brukes til å undersøke elektrofysiologiske effekten av legemidler brukt til iPSC-CMs (figur 6). Her, ble isoproterenol, en ikke-selektive β-adrenoreceptor Agonistiske, brukt til spontant-juling iPSC-CMs som angitt, fører til en rask økning i vibrerende rate (figur 6a). En dose-respons kurve viser effekten av ulike Isoproterenol konsentrasjoner på vibrerende frekvensen for iPSC-CMs er vist i figur 6b.
Figur 6: effekten av isoproterenol på frekvensen vibrerende. (en) representant rå optisk handling potensial sporing av spontant-juling enkelt iPSC CM vises. Isoproterenol (med en siste konsentrasjon på 1 µM) ble lagt til iPSC-CMs som indikert av baren. (b) denne dose-respons-kurven viser effekten av ulike isoproterenol konsentrasjoner på vibrerende frekvensen for iPSC-CMs. feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her kan et optisk opptak med APs fra en bestemt undertype (dvs., ventrikkel-lignende celler) av CMs generert fra menneskelige iPSCs. Menneskelige iPSC-CMs er en nye verktøy for å ta et stort utvalg av biologisk og medisinsk problemer, og differensiering til forskjellige CM-deltyper er en viktig kilde til eksperimentell variasjoner. Ved å bruke spesifikke promoter elementer, oppnås uttrykk for en GEVI spesielt i CMs som representerer undertypen av interesse, som er så optisk fotografert.
Det vellykkede oppkjøpet av APs fra enkelt iPSC-CMs er avhengig av reseeding tetthet etter dissosiasjon. Hvis cellene er reseeded for tett, er det tidkrevende å finne isolert enkelt iPSC-CMs som ikke er del av en elektrisk syncytium. Imidlertid påvirker for lav seeding tettheter negativt overlevelse av cellene. Derfor anbefales en systematical testing av forskjellige seeding tettheter spesielt før engasjerende i eksperimenter som er avhengige av høy gjennomstrømming bildebehandling.
Under bildet oppkjøpet gjennomgår VSFP photobleaching, noe som kan negativt påvirke signal-til-støy-forhold, spesielt under lengre eksperimenter. Hvis raske photobleaching under eksperimentet, kontroller at eksitasjon lys lukkeren åpnes bare under bildeopptak eller under nødvendig forberedelsene (etter og fokuserer på VSFP-uttrykke celler), som skal utført så raskt som mulig. I tillegg redusere kraften i magnetisering lys til et minimum nødvendig og gjøre bruk av det dynamiske utvalget av høy følsomhet kameraet brukes for bildeopptak.
Når tegning Avkastningen under bildet analysen, være klar over at iPSC-CMs flytte under sammentrekning og skal bo i Avkastningen i alle bilder av bildestakk. På grunn av ratiometric natur på VSFP, enhver bevegelse av cellen av Avkastningen føre ikke til kunstig signaler men kan negativt påvirke signalkvaliteten. Men ROIs som er for stor og omfatter unødvendig stor ikke-signal-produserende områder også negativt påvirke signal-til-støy forholdet og bør unngås.
Differensiert iPSC-CMs som har fått lov å modne i minst 30 dager etter at en cardiac induksjon har blitt brukt for Representant resultater. Etter denne perioden av modning, ulike CM subtyper, som knutepunktet-, atrial-, eller ventrikkel som cellene kan skilles. Disse cellene er fremdeles umoden og nå bare en embryonale-lignende fenotypen i todimensjonale (2D) kultur systemer påvirker elektriske egenskaper samt kalsium håndtering19. Disse generelle begrensninger for iPSC-CMs må vurderes, som de kan forvirre eksperimentelle resultater uavhengig av metoden som brukes for å måle handling potensialer. Mer avanserte tredimensjonale (3D) kultur systemer har vist lovende resultater mot ytterligere modning20, og metoden beskrevet her kan være nyttig i denne sammenheng.
Gjeldende gullstandarden for måling APs iPSC-CMS er oppdateringen klemme innspillinger, som gir en svært detaljert analyse av ulike AP egenskaper og kan selv måle enkelt ion kanal strømninger. I tillegg kan absolutte verdier (f.eks, hvile membranen potensielle) måles. I kontrast, er optisk AP opptak basert på relative endringer av membran potensial. På grunn av den relativt trege iboende kinetics av VSFP, visse AP-egenskaper, for eksempel "overshoot", kan være avstumpet fra målinger, og en meningsfull kvantifisering av rask funksjoner, som AP upstroke hastigheten er ikke mulig. Men i et typisk eksperimentelle set-up, ikke de absolutte verdiene, men forskjeller i verdier (f.eksmellom forskjellige linjer eller før og etter bruk av et stoff) måles. Dette kan bli pålitelig oppnådd med optisk metoden beskrevet i dette manuskriptet for egenskaper som AP varighet (f.eks APD90 eller APD50) eller slå hastighet, med en mye høyere frekvens i forhold til oppdateringen klemme10 . Videre tillater non-invasiv art på denne teknologien flere målinger av samme celle over tid10. Optisk AP innspillinger og patch klemme bør derfor betraktet som tilleggsverktøy og brukes avhengig av eksperimentelle spørsmål som må besvares.
Optisk AP opptak kan oppnås ved uttrykk for en GEVI eller ved bruk av potentiometric fluorescerende farge (f.eks, di-8-ANEPPs)21. De fluoriserende fargestoffer har vanligvis gunstigere fluorescens kinetics, men kan ikke være rettet til en bestemt undertype av cardiomyocytes som de ikke er genetisk-kodet. Et antall GEVIs basert på ulike prinsippene har vært utviklet22. Her, brukes de bånd-baserte GEVI VSFP-CR11 . Den viktigste grunnen til dette valget var ratiometric natur denne indikatoren, som reagerer på mobilnettet depolarization med en økning i rødt og en nedgang i grønne fluorescens hvis grønne fluorescerende protein er glade. Dette er en fordel i feltet for kardiologi fordi slik en ratiometric indikator er mindre utsatt for objekter celle bevegelser på grunn av sammentrekninger av cardiomyocytes enn indikatorer som reagerer på depolarization bare av en endring i deres fluorescens intensitet.
Mens bare resultatene fra eksperimentene målretting ventrikkel-lignende iPSC-CMs med MLC2v enhancer presenteres her, er det også mulig å målrette atrial - eller knutepunktet som CMs bruker forskjellige Undertypespesifikke promoter elementer10. For å beskrive metoden i detalj, dette manuskriptet fokuserer på imaging enkelt iPSC-CMs som har vært sådd på et glass dekkglassvæske, dette gjør analyse av AP egenskapene for enkeltceller og gir det høyeste signal-til-støy-forholdet. Denne teknologien kan imidlertid også avbilding av CMs som er integrert med andre celler i en elektrisk syncytium eller en 3D-struktur. Dette er av spesiell interesse som 3-D celle kultur modeller blir stadig mer brukt og har vist seg å gi egenskaper forskjellig fra 2D-modeller20. Avhengig av tenkelig oppsettet og definisjonen av ROIs, kan optisk signaler analyseres fra større områder av 3D vev eller enkeltceller i vevet. Dessuten flere celler kan avbildes samtidig og analyseres separat, fører til en betydelig økning i ytelse.
Samlet kan metoden presenteres her forbedre anvendelse av iPSC-CMs innen arytmi forskning ved å aktivere den raske optisk phenotyping for iPSC-CMs for arytmi-relaterte fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra tysk Research Foundation (Si 1747/1-1), den andre Kröner-Fresenius-Stiftung og Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
