Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Published: July 28, 2018 doi: 10.3791/58139
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry
* These authors contributed equally

Summary

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Abstract

Hücreleri temel kronolojik zamanmekansal organizasyonu, bir çok yönünü tepki-difüzyon türü sistemleri tarafından yönetilir. Vitro sulandırma böyle sistemleri sağlar mümkün olmaz onların temel mekanizmaları ayrıntılı çalışmalar için içinde vivo. Burada, hangi hücrenin ortasında hücre bölünmesi septum konumlandırır Escherichia coli, MinCDE sisteminin vitro sulandırma için bir protokol sağlar. Tahlil sadece kendi kendine organizasyon için gereken bileşenleri yani bir membran iki protein zihin ve maden ve enerji ATP şeklinde sağlamak için tasarlanmıştır. Bu nedenle bir açık tepki odası üzerinde desteklenen lipid bilayer kuruldu bir coverslip imal. Açık tasarım odasının lipid bilayer en uygun hazırlanması ve toplu içerik kontrollü manipülasyon sağlar. İki protein, zihin ve benim yanı sıra ATP, sonra membran üzerinde toplu cilt içine eklenir. Görüntüleme TIRF mikroskobu hem ve tasarım destekler confocal, geniş alanlı olarak birçok optik microscopies mümkündür. Protokol bir varyasyon lipid bilayer desenli bir desteğinde PDMS microstructures hücre şeklinde cam yerine üzerinde oluşturulur. Bu bölmeler kenarında toplu çözüm düşürücü tepki daha küçük bir kompartımanda içine alır ve in vivo salınım davranışını taklit izin sınırları sağlar. Birlikte ele alındığında, biz MinCDE sistemi ile ve kayma hapsi, olmadan reconstitute için protokolleri araştırmacılar tam konsantrasyon aralıkları ve diğer faktörler eklenmesi gibi desen oluşumu etkileyen tüm özelliklerini yönetmeniz için izin tarif ya da proteinler ve sistematik olarak nispeten basit deneysel ayarı sistem karmaşıklığı artırmak için.

Introduction

Zamanmekansal desenleri doğada çok hücreli ve hücresel düzeyde, morfogenez düzenlenmiş hücre bölünmesi1,2üzerinden her iki karmaşık görevleri düzenleyen temel alır. Tepki-difüzyon sistemleri bu kalıpları kurulmasında önemli bir rol oynamaktadır, ama hala iyi anlaşılır. Başlıca örneklerinden bir tepki-difüzyon ve en iyi karakterize biyolojik sistemleri defa Escherichia coli MinCDE sistem3,4,5,6,7biridir. MinCDE sistemi gelecek bölümü site olarak hücre ortasına belirlemek için E. coli Kutbunda hücre için hücre Kutbu'ndan olsun. Bu sistem ATPaz zihin, benim ve kayma tepki matris8olarak membran protein aktive ATPaz dayanmaktadır. MinC desen oluşumu mekanizmasının bir parçası değil, ama gerçek fonksiyonel aracı: bir inhibitörü ana divisome protein FtsZ5,6. MinC akla bağlar ve bu nedenle salınım hücre kutuplarda maksimal ve hücrenin ortasında, en az bir saat ortalama olarak protein konsantrasyonu degrade sonuçlanan sadece FtsZ midcell9,10 polimerize izin izler . MinCDE sistem bakteri2, kronolojik zamanmekansal kuruluşta hücre düzenleme ve konumlandırma ve protein kompleksleri11 ve plazmidlerin12 taşınması için anahtarıdır Walker A ATPases daha büyük ailesinin bir parçasıdır bölümü13 kromozom segregasyon ve14. Dolayısıyla, MinCDE tepki-difüzyon sistem sadece bir arketipik tepki-difüzyon sistemini temsil eder, ama aynı zamanda bakteri kronolojik zamanmekansal kuruluşta için önemi nedeniyle dikkat çekti.

Genellikle protein ve gen silme manipülasyon sonucu olarak hücre bölünmesi kusur MinCDE sistemi içinde vivo detaylı fonksiyonel çalışmaları karmaşıktır. Ayrıca, membran kompozisyon veya sitozol in vivo özelliklerinin çok zorlu değişiyor15,16. Sistem ve faktörler etkileyen değişiklikler içinde önemli bir işlevi hücre bölünmesi olarak rahatsız ettiysem cep karmaşık ortamı içinde daha çok yorumlamak zordur. Biz ve diğerleri bu nedenle bir vitro sulandırma yaklaşım, sistemin çekirdek bileşenlerinin azaltarak çevirdiler: zihin, benim, bir enerji kaynağı olarak ATP ve desteklenen lipid bilayer bir reaksiyon matris6,17, olarak 18. bir yaşam hücrenin ayrıntılı Karmaşıklık olmadan kendi kendine organizasyon mekanizmasının soruşturma için bu tabandan tavana bir yaklaşım sağlar. Genellikle bir büyüklük vivo içindebüyük hakkında böyle bir dalga boyu ile de olsa yüzey seyahat proteinler formu6 ve desenler17,19 bu koşullar altında diğer tür dalgalar. Desen oluşumu etkileyen tüm yönleri üzerinde tam denetim bir açık odası kullanımı kolaylaştırır: protein konsantrasyonları6, protein özellikleri20, membran kompozisyon10, arabellek oluşturma ve ATP konsantrasyonu 6yanı sıra ajanlar21 ve diğer divisome proteinler22kalabalık gibi diğer faktörler eklenmesi. Buna karşılık, bir akış hücreli18,19,23 MinCDE sisteminde vitro sulandırma akışı17,23, protein etkisini araştırmak için kullanılabilir Sınırlayıcı koşullar19, membran kompozisyon19 ve tam 3D doğumdan18 protein desenleri, ama tam bir denetim protein/bileşen konsantrasyon ve sıralı bileşen ek çok daha karmaşık işler.

Bu açık odası kullanarak, aynı zamanda hangi tarafından bir nasıl geometrik sınırları etkisi desen oluşumu21, son zamanlarda bir fenomen sonda düzlemsel lipid bilayers destek desenli de incelenen vivo içinde bakteri kullanarak microstructures7kalıplanmış. Ayrıca benim nasıl tanımlanmış mutasyonların araştırmak için bu tahlil etkiler desen oluşumu sistem20çalıştırmaya başladık. Ayrıca, aynı temel tahlil biçimi nasıl desen oluşumu bir azobenzene-çapraz mayın peptid tahlil içine tanıtımı ve TIRF mikroskobu24ile düşsel ışık tarafından kontrol edilebilir araştırmak için istihdam edilmiştir.

Fayans modeli çoğaltmak için oluşumu vivo vitro sistem, doğumdan anahtardı gözlenen, bulduk. Desteklenen lipid bilayer ile kaplı büyük dalga boyu fayans vitro (10 x 30 µm) için ayarlanmış boyutları ile microcompartments, çubuk şeklinde kullanarak sulandırma fayans pole pole salınımlar ve protein degrade oluşumu izin 10,25. Bu tahlil desteklenen lipid bilayers üstündeki açık kalan çubuk şeklinde microcompartments birkaç yüz çoğaltmalarını içerir desenli PDMS substrat üzerine yatırılır. Bu, açık bir odasında tepki ayarlanabilir ve daha sonra arabellek microcompartments, böylece küçük bir birim için tepki hapsetmesi RIM için indirilir. Olsa bile bu bölmeleri bir tarafta bir hava-tampon arabirimi ve bu nedenle bir tam 3D doğumdan membran tarafından temsil etmemektedir, protein dynamics in vivo salınımlarını10,25taklit. Tam 3D hapsi için karşılaştırıldığında, çok benzer gösteren18sonuçlar, açık microstructures tahlil nispeten basit ve kolay işlemek ve özel Havacilik ekipman ile donatılmış değil laboratuvarlar tarafından da gerçekleştirilebilir ve Temiz Oda imkanları.

Burada, MinCDE desen oluşumu için tüm bileşenleri ve kolay erişim denetimi tarafından optik mikroskobu ve minor ile sağlar bir açık odası kullanarak lipid bilayers vitro desteklenen başlamaktan için deneysel bir protokol mevcut değişiklikler, aynı zamanda yüzey-soruşturma teknikleri26için adapte olduğunu. Düzlemsel desteklenen lipid bilayers yanında, biz de ne kadar protein hapsi olabilir göstermek basit desenli desteklenen lipid bilayers PDMS microstructures çubuk şeklinde kullanarak elde. Bu deneyleri MinCDE sistemi için en iyi duruma getirilmiş olsa da ayrıca FtsZ27 veya en az aktin korteks28gibi membran ile benzer bir şekilde etkileşim diğer protein sistemlerine aktarılabilir.

Protocol

1. protein üretim

  1. Protein ifade
    1. E. coli BL21 dönüştürmek (DE3) pLysS ile ilgili plazmid zihin6, EGFP-US29, mRuby3-US24, benim6 veya MinC30ifade için. Plazmid haritalar için tamamlayıcı bilgiler görebilir.
    2. Bir gecede kültür LB ortamda (Örneğin,100 µg/mL ampisilin veya 50 µg/mL sefaloridin) anılan sıraya göre antibiyotik kullanarak bir koloni ile aşılamak ve sallayarak süre için 14-16 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. 500 mL (1: 200 seyreltme) gecede kültür ile ilgili antibiyotik içeren TB orta aşılamak ve 180 rpm'de sallayarak süre kültür 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Protein ifade kültür 600 optik bir yoğunluk ulaştığında 0,5 mM IPTG ekleyerek teşvik nm 0.5-0.7. EGFP-zihin veya mRuby3-zihin, durumunda bir kuluçka 16 ° C ile hücrelerin ötelenmesini ve 14-16 h ve MinC, zihin veya benim durumunda hücrelerin büyümesine, indüksiyon sonra 37 ° C'de 3-4 h için hücrelerin büyümesine.
      Not: İndüksiyon MinC, zihin ya da benim ifade hücre bölünmesi defektlerde; overexpression sonucu olarak hücreler için zehirlidir Bu nedenle, 37 ° C'de kuluçka süresi 4 h altında tutulur önemlidir. Daha fazla protein gerekiyorsa, kültür, ama değil kuluçka süresi miktarını artırın.
    5. İlgili kuluçka süresi 4000 x g 10 dk de Santrifüjü tarafından hücre hasat ve-80 ° c kadar hücre Pelet depolamak sonra daha fazla kullanın.
  2. Protein Saflaştırma
    Not: Proteinler ya prepacked Ni-NTA sütunları bir otomatik protein arıtma sisteminde veya Ni-NTA boncuk yerçekimi akış tezgah arıtma için kullanarak saf.
    1. Prepacked Ni-NTA sayfasında sütun içeren otomatik protein arıtma sistemleri kullanım arabellek A1 (50 mM sodyum fosfat pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole), arabellek B1 (50 mM sodyum fosfat pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole) ve için arabellek C1 (50 mM sodyum fosfat pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole). Ni-NTA kullanarak yerçekimi akış tezgah arıtma boncuk arabellek A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole) kullanın, B2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) tampon ve C2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole) tampon. Ek tüm arabellekleri 10 mM β-mercaptoethanol veya 0.4 mM TCEP (indirgeyici kullanmadan önce tam olarak tris(2-carboxyethyl)phosphine).
    2. 20-30 mL arabelleği A1 veya A2 hücrelerinde resuspend takıma EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü, 100 µg/mL lizozim, ~ 250 U/mL DNaz ve 0.2 mM ile Mg2 +- ADP (Mg2 +- ADP zihin ya da EGFP-zihin arıtma sadece, durumunda bir 100 mm'den ADP stok 100 mM MgCl 2 ile pH 7.5 için ayarlanabilir).
    3. Bir ipucu sonicator kullanarak hücreleri parçalayıcı (% 30 genlik, 2.5 dk, 30 s darbe, 30 s kapalı) bir buz banyosu hücreleri içeren flakon tutarken.
    4. 25.000 x g de 45 dk ve 4 ° c lysate hücre centrifuging tarafından hücre artıkları kaldırmak
    5. Ni-NTA sütun veya Ni-NTA boncuk süpernatant kuluçkaya.
      1. Prepacked Ni-NTA sütunlar için örnek bir otomatik protein arıtma sisteminin örnek pompa kullanarak sütuna yerleştirin.
      2. Tezgah üstü arıtma için 1 h için 4 ° C'de dönen bir shaker bir 50 mL tepki tüp Ni-NTA boncuklar ile örnek kuluçkaya. Sonraki adımlar için Ni-NTA boncuk 25 mL pipet kullanarak boş bir sütunu aktarın.
    6. Arabellek A1 veya A2 en az 5 sütun birimleri ile yıkayın.
    7. Arabellek B1 veya B2 en az 5 sütun birimleri ile yıkayın.
    8. Protein arabellek C1 veya C2 ile elute.
    9. Protein saflık SDS-sayfası üzerinden değerlendirmek.
    10. İsteğe bağlı: Daha fazla protein depolama arabellek (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, % 10 gliserol, 0,1 mM EDTA, 0.4 mM TCEP, (0.2 mM Mg2 +- ADP zihin durumunda)) equilibrated jel filtrasyon sütun uygulayarak arındırmak.
      Not: Jel filtrasyon zihin için toplanan protein fraksiyonu kaldırmak önerilir.
    11. Eğer hiçbir jel-filtrasyon istihdam, Ni-NTA elüsyon arabellek değişimi depolama arabellek (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, % 10 gliserol, 0,1 mM EDTA, 0.4 mM TCEP, (0.2 mM Mg-ADP zihin durumunda)) için bir ağırlık kullanarak akış desalting sütun ( Tablo malzemelerigörmek).
    12. Şok proteinleri aliquots sıvı azot ve-80 ° C'de store kadar daha fazla kullanılmasını kıpırdama.
    13. Protein hisse senedi toplama Bradford tahlil kullanarak ölçmek ve ATPaz tahlil20protein etkinliğini belirlemek.
      Not: protein konsantrasyonu emme 280 kullanarak değerlendirmek değil nm. Nükleotit zihin arıtma sırasında varlığı ve tryptophans benim eksikliği deforme280 konsantrasyon ölçümleri. Bunun yerine protein konsantrasyonları ölçmek için kullanım Bradford veya BCA deneyleri.
  3. Protein etiketleme
    Not: Benim indükler küçük protein flüoresan bir protein füzyonu büyük değişiklikler onun diffusive özellik ve işlev; Bu nedenle, kimyasal protein (sistein pozisyonda 51) etiketleme bitti flüoresan proteinler fusion tercih edilir.
    1. 5-10 µL DMSO (dimetil sülfoksit), maleimide-boya eşlenik 0,125 mg dağıtılması ve 0.5 mL için benim aliquot içinde depolama tampon pH 7.2, yukarıda detaylı olarak hazırlanmış sallayarak altında ekleyin.
    2. Bir gecede 4 ° C'de 2 h veya RT nazik sallayarak veya karıştırma altında 2 h için kuluçkaya.
    3. Ayrı boya ve protein depolama arabellek (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, % 10 gliserol, 0,1 mM EDTA, 0.4 mM TCEP) ile equilibrated sütun desalting bir yerçekimi akışı kullanarak.
    4. Daha fazla ekli olmayan herhangi bir boya kaldırmak için protein depolama arabellek aşırı karşı diyaliz.
    5. Başarılı ilgili boya için en tükenme ölçerek etiketleme doğrulayın ve tahmini etiketleme verimlilik hesaplamak. Etiketleme derecesi tahmin etme üzerinde detaylı bir iletişim kuralı için boya üreticisinin yönergelerine başvurun. SDS-sayfa ile çözümlemek ve toplam kütle kütle spektrometresi örnek homojenliği ve etiketleme başarı hakkında daha fazla yararlı bilgi belirlemek.

2. küçük Unilamellar vezikül (SUV) hazırlık

  1. Nesil multilamellar veziküller
    1. Lipid(s) istenen karışımı ve son SUV hacim için kloroform tutarını hesaplar. Konsantrasyonu lipidler Min arabelleği (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2) 4 mg/mL olması gerekir. Standart bir dk tahlil için 7:3 DOPC:DOPG (mol yüzde) karışımı tavsiye edilir. E. coli polar lipit kullanarak ayıkladığınızda, SLB arabellek (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl) için tüm hazırlık adımları kullanın.
      Not: Bu karışımı ile homojen SLBs nesil çok daha zor olarak E. coli polar lipit özü kullanılmak üzere ilk kez kullananlar için önerilmez.
    2. Bir pozitif deplasmanlı pipet ile cam ipuçlarını kullanarak, kloroform 1,5 mL Cam şişe içinde lipidler karıştırın.
      1. Lipidler hafif azot akış altında yavaş yavaş şişeyi dönüm kuru. Lipidler altında daha güçlü bir azot akışı 10 ile 20 dakika yerleştirin. Bir vakum desiccator kurutulmuş lipid filmde içeren flakon yerleştirin ve en az 1 h için vakum uygulanır.
    3. Karışım homojen opak olana lipidler Min arabelleği vortexing oda sıcaklığında tarafından suyla temasa.
      Not: Küçük unilamellar veziküller multilamellar veziküller gelen nesil için lipitler ya 2.2 içinde açıklandığı gibi kalıptan çekilmiş. ya da sonicated 2.3 içinde açıklandığı gibi. Genel olarak, ekstrüzyon desteklenen lipid bilayers oluşumu ile yardımcı olabilir daha dar bir boyut dağılımı verir.
  2. SUV hazırlık ekstrüzyon tarafından
    1. Lipid toplamları ve multilamellar yapıları yıkmak ve daha fazla dondurma çözdürme için 7-10 döngüleri tarafından lipidler solubilize.
      1. Bir ölçek ile 70 ° c ila 99 ° C sıcak tabakta su ve sıvı azot içeren bir kapsayıcı hazırlamak.
      2. Kaynama azot durana kadar şişe sıvı azot büyük cımbız ile tutun. O zaman çözüm tamamen çözdürülen kadar sıcak su şişe transferi. Lipid karışımı karışımı bağlı olarak göz açık görüntüleninceye kadar bu adımları yineleyin.
    2. Lipid ekstruder montaj ve Min arabellek sistemiyle önceden durulayın. Lipid karışımı arasında 35 ve 41 defa 50 nm gözenek boyutu membran aracılığıyla A'ya. Geçer asla membran geçilen toplamları önlemek için tek sayıda sonuna kadar emin olun.
  3. SUV hazırlık sonication tarafından
    1. Daha iyi lipidler arabellek çözülmeye, 37 ° C ve girdap 20 dakikada 1 dakika için ayarlanmış bir ısı bloğundaki solüsyon içeren cam şişe koymak. Toplam yaklaşık 1 h için kuluçkaya.
    2. Sonicator banyo (çalışmalarında 1.91 M, 80 W) şişede alt şişe gerekli yükseklikte bir kelepçe stand üzerine takılarak bırakın.
    3. Şişeyi çevreleyen çözüm bakliyat tarafından iyice tedirgin sonicator banyoda su yüksekliği ayarlayın ve lipid karışımı yaklaşık 20 dakika için solüsyon içeren temizleyicide. Lipidler netliğini değerlendirmek tarafından başarılı sonication için kontrol edin.
  4. SUV 4 ° C'de için bir hafta kadar depolanabilir veya küçük aliquots (~ 20 µL)-20 ° C arasında dondurulup ve birkaç hafta için depolanan. Şişeleri ya da tüpler, oda sıcaklığında erimek ve çözüm SUV'lar hazırlanması için kullanarak desteklenen lipid bilayers (SLBs) önce temizlenene kadar 2.2.3 veya 5.3 altında açıklandığı gibi yeniden solüsyon içeren temizleyicide. Lütfen dar boyutu dağıtım SUV'lar ekstrüzyon tarafından elde Not çözdürme ve sonication donma ve sonraki sonra kaybolur.

3. Temizleme cam Coverslips

Not: Temizlik ve cam coverslips hydrophilization homojen ve sıvı desteklenen lipid bilayers için önemli bir faktör değil. Cam coverslips 7:2 sülfürik asit oranı % 50 hidrojen peroksit (3.1), veya bir oksijen plazma plazma temizleyici (3.2) ile yapılan bir piranha çözümü kullanılarak temizlenebilir. Her iki yöntem de benzer sonuçlar verir.

  1. Piranha coverslips temizlik
    1. Piranha çözüm için geçerli
      1. Cam coverslips bir ters cam Petri kabına veya inert diğer yüzey dağıtın. Cam Pipet ile her coverslip ortasına konsantre sülfürik asit (% 98) 7 damla ekleyin.
        Dikkat: sülfürik asit kesinlikle asidik ve aşındırıcı. Bir duman dolabında ve uygun koruyucu ekipman sadece çalışın.
      2. İki damla % 50 hidrojen peroksit asit damla ortasına kadar ekleyin.
        Dikkat: hidrojen peroksit gözleri ve cildi aşındırıcı.
      3. Reaksiyon kapak ve en az 45 dakika için kuluçkaya.
        Not: Bekleme süresi en fazla burada deney sonucundan kritik değildir ve birkaç gün kadar uzatılabilir.
    2. Yıkama piranha coverslips temizledim.
      1. Cımbız kullanarak tek tek coverslips kadar almak ve asit Ultrasaf Su ile durulayın. Yıkanmış coverslips non-sopa sahipleri veya benzer bir ulaşım aygıtı ekleyin.
      2. Her coverslip kapsamlı Ultrasaf Su ile durulayın ve basınçlı gaz (azot, hava sadece yağsız Eğer) ile yüzey kuru. Coverslip temizlenmiş yan kalıcı marker ile işaretleyin.
  2. Coverslips plazma temizleme
    1. Coverslips aşırı etanol ve daha sonra aşırı Ultrasaf Su ile durulayın. Coverslips basınçlı gaz ile kuru. Odası 4'te açıklandığı gibi bir araya getirin.
    2. 4'te açıklandığı gibi odası derleme sonra ekli odası coverslips alıp plazmada işlem gaz oksijen ile temizleyici yerleştirin. Temiz coverslips plazma ile (Bu iş % 30 iktidarda 0.3 mbar oksijen basıncı 1 dk. için kullanılmıştır). Şu SLB oluşumu plazma temizleme hydrophilizing etkisi 5'te açıklandığı gibi zamanla yıpranan önce temizlik yapın.
      Not: Zamanlama ve plazma temizlik gücünü fluorescently etiketli membranlar, olarak çok az kullanarak optimize edilmelidir veya aşırı plazma temizleme her ikisi de hareketsiz membranlar veya delikli membranlar yol açabilir.

4. Deniz Ticaret Odası Meclis

  1. Keskin makasla kesilmiş ve kapak ve 0.5 mL tepki tüp konik parçası atın. UV-tutkal tüp üst kenarında uygulamak ve eşit bir pipet ucu kullanarak dağıtmak.
  2. Daha önce temizlenmiş coverslip ters tüp yapıştırıcı. Piranha temizlik rezervasyonun Bu temizlenmiş cam kenarına tutkallayın emin olun. UV-tutkal bir 360 nm lamba veya LED 5 ila 15 dakika altında birden fazla chambers yerleştirerek tedavi.

5. desteklenen Lipid Bilayer (SLB) oluşumu

  1. Ön ısı ısı 37 ° C-blok ve 2 mL tepki tüpler Min veya SLB tampon, oda başına 1 tüp ile kuluçkaya.
  2. Darbe azot herhangi bir toz veya UV curing ve derleme sırasında yerleşmiş olması diğer parçacıklar kaldırmak için toplandı ve tedavi odaları içine. Plazma temiz senin coverslips Piranha çözüm (3.1) ile temizlemiş değil Eğer 3.2 açıklandığı gibi. Chambers ısı blokta yer.
  3. Açık lipidler (4 mg/mL), bir 20 µL aliquot Min arabellek veya SLB arabellek E. coli polar lipit özü, verimli bir çalışma konsantrasyonu 0,53 mg/mL durumunda 130 µL ile oranında seyreltin. Lipidler donduruldu diye, ilk arabellek eklemeden önce bir banyo sonicator tüp tutarak solüsyon içeren temizleyicide sonra tekrar ile tampon solüsyon içeren temizleyicide.
  4. Her odasına 75 µL lipid karışımı ekleyin ve 2 dakika için bir zamanlayıcı ayarlamak (DOPC/DOPG karışımlar için; uzun kuluçka diğer lipid karışımları için gerekli olabilir). E. coli polar lipit özü durumunda CaCl2 100 mM stoktan pipet 3 mM son bir konsantrasyon için odasına. Kuluçka süre boyunca veziküller hidrofilik cam yüzeyde patlama ve tutarlı bir SLB oluşturmak için sigorta.
  5. 60 saniye sonra 150 µL Min arabelleği her odasına ekleyin.
  6. Odaları yıkama: dikkatlice yukarı pipetting ve aşağı birkaç kez, kaldırıp başka bir 200 µL ekleyerek her odası başka bir 120 saniye (3 dakika toplam) Min veya SLB arabelleği ekleyerek 200 µL tarafından yıkadıktan sonra.
    1. Her oda bir kez yıkanmış sonra iş istasyonlarına kadar kullanılan arabellek 2 mL kadar ilk odası iyice yıkayın. SLBs çamaşır odasında hareketleri ölçüde mükemmel ve doğru yıkama yoğunluğunu bulmak biraz tecrübe gerekir.
      Not: Asla tüm sıvı SLB kurutma önlemek için odasından kaldırın.
      Not: çamaşır üzerine, membran özellikleri birçok ek faktöre bağlı olarak değişir: yüzey lipidler türünü ve lipid karışımları, hazırlama yöntemi için SUV, onların göreceli konsantrasyonlarda tedavi ve destek önceki temizlik.

6. kendi kendine organizasyon tahlil

  1. Protein ve ATP çözüm miktarı eksi 200 µL Min arabellek odasına hacmindeki Arabellek ayarlayın, daha sonra zihin, akıl, etiketli eklemek, maden ve istenirse, MinC. Bileşenleri tarafından pipetting karışımı yavaşça. Örnek konsantrasyonları vardır 1 µM zihin (% 30 katkılı EGFP-zihin), 1 µM (%10 ile kimyasal olarak benim etiketli katkılı) maden ve 0,05 µM MinC ama desen oluşturmak konsantrasyonları6,10,20,30 aralığında .
  2. Fayans kendi kendine organizasyon başlatmak için 2.5 mM ATP (100 mM 100 mM MgCl2, pH 7.5 ATP stok) ekleyin.
    Not: Bileşen ekleme (zihin, benim ve ATP) sırasını farklı olabilir ve son model sonucu4etkisi değil.
  3. Fayans kendi kendine organizasyon üzerinde floresan mikroskop gözlemlemek ( Tablo malzemelerigörmek). Fayans kendi kendine organizasyon da TIRF mikroskobu kullanılarak görülebilir. EGFP-zihin görüntüleme için 488 nm Argon lazer veya karşılaştırılabilir diode lazer (Örneğin, 490 nm) kullanın. Görüntüleme mRuby3 zihin için 561 nm diode lazer istihdam etmek en iyisidir.
    Not: yüksek düzeyde önlemek olarak biz ve diğerleri daha uzun süreleri için uyarma17 gözlenen fototoksisite fayans sisteminde, geri dönüşü olmayan protein polimerizasyon için membran üzerinde lider.

7. PDMS microstructures

Not: PDMS (polydimethylsiloxane) microstructures ve mikrosıvısal cihazlar üretimi için kullanılabilir bir polimerdir. Desenli silikon gofret PDMS yapıları döküm için bir kalıp olarak hizmet vermektedir. PDMS yapıları SLB oluşumu için bir destek olarak hizmet ve kurulum tahlil.

  1. Silikon gofret microcompartments ile fotolitografi kullanarak kendiniz de üretmek (detaylı Protokolü31 veya Gruenberger vd için a video Protokolü32için Zieske ve Schwille bakın) veya istenen silikon gofret bir dökümhane sipariş . Burada kullanılan gofret desen için tamamlayıcı bilgiler görebilir.
  2. PDMS microstructures gelen desenli silikon gofret üretimi.
    1. 10 g PDMS tabanının ve PDMS crosslinker 1 g tartmak için plastik bir kap kullanın. Ya mix ve PDMS karışımı degas veya el ile PDMS karıştırın ve vakum altında degas için bir karıştırma aygıtı kullanın.
    2. Pipet Ucu PDMS silikon gofret üzerinde küçük bir miktar yapısı üzerine doğrudan silmek için kullanın.
      Not: silikon gofret çizmemeye değil dikkatli olun.
    3. Hemen bir #1 coverslip PDMS damla üzerine yerleştirin ve hafifçe coverslip silikon gofret üzerine basılacak temiz pipet ucu üst ucundan tut. PDMS ince coverslip ve silikon gofret arasında yaymak.
    4. Gofret coverslips ile bir fırın yerleştirin ve 3-4 saat için PDMS tedavi veya bir 75 ° C'de gece Gofret Fırından çıkarın ve aşağı oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. Bir jilet ile SI gofret coverslip ekli PDMS ile dikkatli bir şekilde çıkarın.
      Not: silikon gofret kirli ya da zarar görmesini önlemek için her zaman microstructures PDMS ve bir coverslip ile kapak. Ancak, PDMS yaş, microstructures, çatlaklar sonuçlanan iki ya da üç haftadan daha eski olan PDMS yapıları dolayısıyla kullanmayın.

8. kendi kendine organizasyon PDMS Microstructures

  1. Kullanım coverslips bir oda olarak eklemek için PDMS microstructures ile 4 altında açıklanan.
  2. Temiz ve 3.2.2 altında açıklandığı gibi temiz bir oksijen plazma yüzey hydrophilize. Değil piranha temiz PDMS yüzeyler yapmak.
  3. Fayans kendi kendine organizasyon tahlil 6 altında açıklandığı gibi ayarlayın.
  4. Tahlil kadar ayarladıktan sonra düzenli fayans desen oluşumu ve floresan mikroskop üzerinde uygun şekilde oluşturulmuş microstructures denetleyin.
  5. Ne zaman normal fayans modelleri (10-30 dakika) oluşmuş, yavaşça yukarı ve aşağı iki kez bileşenleri karıştırmak ve arabellek adım adım pipetting tarafından kaldır pipet. 10 µL pipet kullanarak diğer dikkatlice sökün ve 100 µL pipet kullanarak arabellek büyük toplu.
    Not: Bu adım biraz pratik gerekebilir. Çok fazla arabellek götürülür veya işlemi çok uzun sürüyor, microstructures kurudu; Eğer çok az alınır, proteinler microstructures sınırlı değil, ancak yüzey dalgaları seyahat kurmaya devam.
  6. Hemen odası microstructures arta kalan arabellek kurutma önlemek için bir kapak ile kapatın.
  7. Uzun görüntüleme süreleri için izin vermek için sünger odası içinde nemli bir parçası takın ve kapağı ile kapatın. Sünger coverslip yüzeyi ile değil emin olun.
  8. Önce görüntüleme arabellek yeterince, böylece yüzeyi microstructures fayans desen oluşumu üzerinde durdu indirdi yüzeyi microstructures çekin. Microstructures fayans salınımlarını görüntü. Microstructures kurudu değil veya görüntüleme sırasında kurumasını denetleyin.
    Not: coverslips microcompartments ile her kullanımdan sonra çatlaklar PDMS formu olarak atmak.

9. analiz fayans desen oluşumu

  1. Dalga boyu, dalga hızı ve fayans kendi kendine organizasyon düzlemsel desteklenen lipid bilayers üzerinde dalga profilleri ölçmek. FIJI paketlenmiş eklentileri standart kümesi ile temel analiz33için yeterlidir.
  2. Pole pole salınım microcompartments içinde kymographs ve saat ortalama olarak protein konsantrasyonu profilleri alarak analiz. Temel kymographs zaman serisi bir satırı seçimi Fiji'de boyunca yeniden dilimleme tarafından elde edilebilir.

Representative Results

Bizim protokol sonrası protein saflaştırma Min proteinler yeterli saflık verim. Bir referans olarak, zihin, zihin, benim ve MinC fluorescently etiketli SDS-sayfa görüntüsünü resim 1 sağlar. Fayans kendi kendine organizasyon tahlil desteklenen lipid sigara desenli bilayers üzerinde gerçekleştirmek için yordam tek tek adımları Şekil 2' de açıklanmıştır. Bu iletişim kuralını kullanan, düzenli fayans yüzey dalgaları seyahat odası (Şekil 3) görülebilir. Dalga boyunu biraz odası içinde değişir, ancak genel olarak desen benzer. (Bkz. Şekil 3 c) UV tutkal formunda cama daha farklı özellikleri var gibi membran yüzey gibi odası kenarlarını nicel karşılaştırmalar için kullanılmamalıdır. Seyahat yüzey dalgaları yayılma yönünde (Şekil 3B) boyunca yoğunluk komplo tarafından çözümlenebilir. Floresans yaylalar oldukça hızlı öncü--dan belgili tanımlık sallamak ve keskin firar kenarında azalır unutmayın, maden floresans zihin dalga başından beri hemen hemen doğrusal olarak artar ve onun en büyük zihin sonra firar kenarında eriştiği nerede o belirgin6düşüyor.

Protein kalitesi yanında, desteklenen lipid bilayers kalitesini en MinCDE bir düzenli kendi kendine organizasyon için önemlidir. Bir yandan membran çok aşırı derecede yıkanır veya temel yüzey temizlenir ve böylece güçlü kullanılıyorsa, membran içinde delikler oluşabilir (Şekil 6A, üst). Öte yandan membran düzgün yıkanmış değil veya temel yüzey temizliği/hydrophilized değil, veziküller membran için sopa veya membran akışkanlık tehlikeye girer (Şekil 6A, alt). Düz-se bile değil gibi belirgin gibi membran etiketli lipidler üzerinden doğrudan gözlem zaman, bu sorunların da zihin floresans sinyalini gibi desenleri değil düzenli ve floresan maxima içinde homojen değil ama "delik" içerir tespit edilebilir veya parlak noktalar Şekil 6Aorta masası gösterildiği gibi.

Çubuk şeklinde PDMS microstructures içinde fayans kendi kendine organizasyon için yordamı Şekil 4' te özetlenmiştir. Proteinler ve yağlar yeniden kullanılabilir gibi düzenli olarak yapılmasını planlamıştı, birkaç protokol adımları uygulamanız gerekmez. Sigara desenli yüzeyler üzerinde yüzey temizlenir ve (plazma temizleme tarafından) hydrophilized, desteklenen lipid bilayer PDMS üzerinde oluşturulur ve kendi kendine organizasyon tahlil 200 µL hacmindeki kurmak gibi. Uygun bir membran oluşturmuştur ve fayans membran üzerinde kendi kendini düzenler denetlemek için odaları görüntüsü. Uygun bir membran yüzey dalgaları arasında bireysel microstructures PDMS yüzeyinde düzenli seyahat fayans formlar oluşturulmuştur ve dalgalar serbestçe mümkün olduğunca da microstructures alt kısmında kendi kendine organize zaman tüm hareket membran kaplı yüzey (Şekil 5A). Tamamen kuru olmalıdır arabellek kaldırıldıktan sonra yüzey bölmeleri arasında herhangi bir yayılıyor fayans modelleri (5B rakam), gösterecektir değil. Fayans modelleri hala hareket ediyor, daha fazla arabellek kaldırılması gerekiyor. Proteinler şimdi çubuk şeklinde microcompartments membran kaplı PDMS ve hava üst arabirimde hangi onlar kendi kendine organize edecek (Şekil 5C) tarafından sınırlı. Bu koşullar altında iki protein Şekil 5 diçinde gösterildiği gibi kutup kutup salınım gerçekleştirebilir. Bir kısmını zihin ve benim her zaman membran bağlı olduğu gibi Ayrıca arabellek kaldırma sırasında arabellek çıkarıldıktan sonra konsantrasyonları konsantrasyonları giriş için karşılaştırılabilir değildir. Arabellek kaldırma önce desen konumunu bağlı olarak bu etkisi nedeniyle konsantrasyonları arasındaki bireysel microstructures aynı coverslip üzerinde de değişir. Silikon Gofret üretim veya PDMS kalıplama silikon gofret üzerinden analiz (Şekil 6B) için kullanılamaz eksik microstructures neden olabilir. Ayrıca, arabellek nedeniyle kaldırma microstructures işlemi sırasında kuru ve bu nedenle, daha fazla çözümleme (Şekil 6B) tutulmalıdır. Sonuç olarak microstructures bir odasında sadece bir kısmını istenen pole pole salınımlar gösterir. Microstructures protein dinamiklerini analiz etmek için bir kymograph tüm yapısı (Şekil 5E) üzerinde bir seçim çizerek elde edilebilir. MinCDE salınım pole pole, MinC ve zihin zaman ortalama bir konsantrasyon gradyan yuvası kutuplarda maksimum konsantrasyon ve en az konsantrasyon ile bölme (Şekil 5F) ortasında gösterecektir.

Figure 1
Şekil 1: SDS-sayfa protein purifications nihai ürünler gösteriliyor. O'nun-zihin (33.3 kDa), O'nun-eGFP-US (60.1 kDa), O'nun-mRuby3-US (59.9 kDa), O'nun-MinE (13,9 kDa) ve O'nun MinC (28,3 kDa) sırada gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama üzerinde desteklenen lipid sigara desenli bilayers (adım 1-6) kendi kendine bir organizasyon için protokolün. Kesikli kutuları şu iki seçenekten birini temizlemek için kullanılabilir gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: fayans tahlil tarafından confocal mikroskobu Imaging. A) düzenli Min sarmal, hangi dalga yayılma hızı, yoğunluk arsa ve hız ölçümleri elde edilebilir. Kullanılan konsantrasyonları: 0.6 µM, zihin (% 30 eGFP-MinD) 1.8 O'nun µM madeni (% 30 O'nun-maden-Alexa647) B) örnek normalleştirilmiş yoğunluğu Arsa bölge için işaretlenmiş A'ya C) tüm tahlil odası genel bakış (ölçek çubuğu: 1 mm, olarak aynı protein konsantrasyonları yukarıda). Her iki yönde de hedef desenler görülebilir dönüm spiraller. Büyütülmüş bölgesi nasıl dalga kalıpları UV uyuşmuşhalde farklılık gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: işlem akışı Diyagram tek tek adımları gösteren ve zamanlama çubuk şeklinde microstructures (adım 1-5, 7, 8) içinde kendi kendine organizasyon için protokolün. Gri kutuları nereye ürünleri yeniden kullanılabilir merdivenlerinde protokolü üzerinden desteklenen lipid sigara desenli bilayers gösterir. Daireler tarafından işaretlenmiş oklar nerede protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başladı gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: fayans için temsil edici sonuçlar desen çubuk şeklinde PDMS microcompartments oluşumu. A) fayans kendi kendine organize yüzey dalgaları seyahat oluşturan PDMS yüzeyinde (1 µM MinD (% 30 EGFP-zihin), 2 µM benim ve 2.5 mM ATP). B) sonra arabellek microstructures yüksekliğe indirilir, protein kendi kendine organizasyon düzlemsel yüzey microcompartments arasında durur. C) şematik bir çubuk şeklinde microcompartment. D) fayans pole pole salınımlarını arabellek çıkarıldıktan sonra temsilcisi görüntüler. E) D içinde gösterilen vurgulanan hattı boyunca titreşimler Kymograph). F) görüntü ve profil-serisi D içinde gösterildiği zaman ortalama floresans yoğunluk) açıkça maksimal microcompartment Polonyalılar ve bölme orta, en az protein degrade gösterilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: negatif deneysel sonuçlar örnekleri. A) aşırı yıkanmış membranlar birikir delik, suboptimal. sivilce ürünleri ve lipit kompozisyonları veziküller yapışmasını için kurşun iken. İki merkezi panelleri sorunları ve nasıl onlar Min salınımlarını gözlemleyerek zaman görünür hale gelir bir arada göstermek. Membranlar ile % 0.05 etiketli Atto655-DOPE. (ölçek çubukları: 50 µm) B) üst panel: kurudu microcompartments çok fazla arabellek kaldırma veya arabellek zaman içinde buharlaşır neden olabilir. Alt paneli: eksik bölmeleri Gofret üretim veya PDMS döküm sırasında oluşmuş. (ölçek çubukları: 30 µm) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1: Plazmid harita onun zihin için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 2: Plazmid harita His-EGFP-US için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 3: Plazmid harita His-mRuby3-US için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 4: Plazmid harita benim onun için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 5: Plazmid harita MinC onun için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 6: Microcompartments çubuk şeklinde silikon gofret için CAD dosyası. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Biz bir protokol MinCDE kendi kendine organizasyon üzerinde düzlemsel vitro sulandırma lipid bilayers desteklenen ve lipid içinde 3D yapılar, bilayer kaplı çubuk şeklinde PDMS microstructures örneği kullanarak anlatmıştık. Bu deneyleri değerli verilerini elde etmek için protein ve membran kalite kontrolü için en önemli faktörler bulunmaktadır.

Protein, protein bir kalite için kitle-var doğruladı SDS-sayfa ve kütle spektrometresi kullanılarak. Ayrıca, bu proteinler analitik jel filtrasyon veya dinamik ışık saçılma kullanarak çözünür ve değil toplanmış olduğunu doğrulanması gerekir. Jel filtrasyon proteinler toplanan herhangi bir kısmını kaldırmak için kullanılabilir. Dikkatli pH ayarlama ve eklenen nükleotit kalitesi kritik, Sigara ayarlanacağını veya kısmen bozulmuş nükleotit protein ek olarak hisse senedi veya kendiliğinden organize deneyleri protein etkinlik, bu nedenle kaldırılması ortadan kaldırmak için yeterli kendi kendine organizasyon.

Protein kalite, yanındaki membran kalite en kritik ve uygunsuz membran oluşumu en sık arızalı kendi kendine organizasyon ve artefactual yüzey yapıların kökeni için nedenidir.

Protokolü ilk kez gerçekleştirilirken, sınav-655-uyuşturucu veya dıı gibi etiketli lipidler düşük molar oranlarda (% 0.05) dahil olmak üzere tarafından desteklenen lipid bilayers etiket yararlıdır. Böylece özellikleri ve membran kalitesini doğrudan karar olabilir. Sıkı bağlamak kullanarak, membran akışkanlık tespit edilebilir. Bu yıkanmış Eğer orada da çok fazla veziküller, hiçbir sıvı membran veya hiçbir membran, olacak gibi Ayrıca, bir doğrudan SLB, yıkama kalitesini değerlendirir. Titizlikle membran, yıkamak için açık odası yaklaşım sağlar ve bu nedenle de SLB yüzeye yapışmasını veziküller kaldırmak için. Temizlik ve hydrophilicity destek yüzeyi ve doğru boyut ve SUvs polimerlerin bilayers olan sıvı ve homojen desteklenen lipid elde etmek için en önemli faktörler SUV boyutu ve boyut dağılımı kullanarak kontrol etmek yardımcı olabilir dinamik ışık saçılma. Dar boyutu dağıtımları için onları sonicating yerine veziküller yükseltme öneririz. Temizlik coverslips, Örneğin, tedavi güçlü bazlar, temel deterjanlar veya doğrudan su ile durulama sonra coverslips kullanarak diğer yöntemleri iyi, uygulama ve lipid karışımı bağlı olarak sonuçlar verebilir.

Burada, vitro sulandırma düzlemsel desteklenen lipid bilayers açık odalarında, üzerinde sunulan Protokolü ilk yarısında yüzey optik microscopies, TIRF mikroskobu gibi30, sıkı bağlamak için erişilebilir oluşturma avantajına sahiptir analiz6, tek-parçacık34yanı sıra atomik kuvvet mikroskobu26gibi yüzey araştırma teknikleri izleme. Büyük homojen alan tanımlı konsantrasyonlarda daha iyi istatistikleri sağlar. Ayrıca açık odası yaklaşım tam olarak protein konsantrasyonu ve bir hızlı ve basit ek bileşenlerinin dolayısıyla protein konsantrasyonu tek odası20titre için izin daha fazla kontrol sağlar. Tahlil FtsZ22,35, ZipA22 veya chimeric protein FtsZ-YFP-MTS10,35gibi diğer bakteriyel divisome bileşenler tarafından genişletilebilir.

Diğer gruplar Min sistem vitro, ama kullanımı akış hücre yerine bir açık odası17,18,19başlamaktan için benzer bir yaklaşım almıştır. Akış-hücreleri belirli avantajları, özellikle gerekli18, akış17,19,23 etkisi tamamen kapalı bir 3D çevre veya membran kompozisyon23 MinCDE desenleri olduğunda var araştırdık, ya da koşullar19sınırlama protein altında uyması gereken protein desenler vardır. Yine de, yerel moleküler konsantrasyonları kontrolünü daha zordur. Protein bileşenleri, özellikle zihin, güçlü membran için bağlama karşılaştıkları ilk18,19. Deneyim, proteinler sık non-spesifik bağlama boru, giriş, şırınga ve diğer mikrosıvısal parçalar için sergi. Bu nedenle, yerel protein konsantrasyonları ve giriş konsantrasyonları18 farklı de akışı hücre gibi başkaları tarafından19farklı protein kalıpları arasındaki giriş ve çıkış, zar üzerinde çeşitli sonuçlanan, uzunluğu değişir.

Protokol yarısı burada, çubuk şeklinde microstructures lipid tarafından örtülü bir desenli desteği üzerinde açık odası yaklaşımı yeniden kullanarak vitro rekonstitüsyon sunulan ikinci bilayers sağlar vivo içinde protein davranış basit bir taklit için protein konsantrasyonları üzerinde kesin denetim arabellek kaldırma nedeniyle kayıp olmasına rağmen. Dalga boyu fayans bir büyüklük sırasında olduğundan daha büyük vitro vivo içinde daha çubuk şeklinde microcompartments vardır bir büyüklük daha büyük (10 x 30 µm) bir çubuk şeklinde E. coli daha hakkında da hücre olduğunu unutmayın.

Genel olarak, bu iletişim kuralı protein konsantrasyonu, arabellek oluşturma ve membran özellikleri dahil olmak üzere tüm koşullar hassas kontrol için izin verir. 3D yapılandırılmış destekler kullanımı kayma hapsi, in vivo davranış karmaşık Havacilik ekipman için gerek kalmadan taklit altında incelenecektir tepki sağlar.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Michael Heymann teşekkür ediyoruz ve Frank Siedler üretiminin silikon gofret, çekirdek tesis MPI-B için protein saflaştırma ve Simon Kretschmer yardım ve Leon Harrington el yazması üzerine yorumlar için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24x24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24x24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control. Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).
  2. Lutkenhaus, J. The ParA/MinD family puts things in their place. Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).
  3. Shih, Y. -L., Zheng, M. Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli. Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).
  4. Halatek, J., Frey, E. Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics. Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).
  5. Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320 (5877), 789-792 (2008).
  7. Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures. Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).
  8. Hu, Z., Lutkenhaus, J. Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid. Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).
  9. Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).
  10. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems. Elife. 3, e03949 (2014).
  11. Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).
  12. Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria. Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).
  13. Thanbichler, M., Shapiro, L. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  14. Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation. Elife. 3, e02758 (2014).
  15. Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo. J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).
  16. Renner, L. D., Weibel, D. B. Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).
  17. Ivanov, V., Mizuuchi, K. Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).
  18. Caspi, Y., Dekker, C. Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers. Elife. 5, e19271 (2016).
  19. Vecchiarelli, A. G., et al. Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).
  20. Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence. PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).
  21. Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. Geometry sensing by self-organized protein patterns. Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).
  22. Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves. Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).
  23. Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro. Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).
  24. Glock, P., et al. Optical control of a biological reaction-diffusion system. Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).
  25. Zieske, K., Schwille, P. Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments. Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).
  26. Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator. Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).
  27. Ramirez, D., et al. Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture. PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).
  28. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. Elife. 2, e00116 (2013).
  29. Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. Surface topology assisted alignment of Min protein waves. FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).
  30. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).
  31. Zieske, K., Schwille, P. Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments. Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).
  32. Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560 (2013).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. Protein self-organization: Lessons from the min system. Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).
  35. Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).

Tags

Biyokimya sayı: 137 In vitro sulandırma zihin benim desteklenen lipid bilayer desen oluşumu microstructures kendi kendine organizasyon
<em>Vitro</em> Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P.… More

Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter