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Chemistry

Luminophore formación en diversas conformaciones de albúmina sérica bovina mediante la Unión de Gold(III)

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58141
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

Summary

Los protocolos para el estudio de la Unión de cationes oro (Au(III)) a diversas conformaciones de albúmina de suero bovino (BSA), así como para caracterizar la conformacional dependiente única BSA-Au de la fluorescencia se presentan.

Abstract

El propósito de los protocolos presentados es estudiar el proceso de unión de Au(III) a BSA, produciendo fluorescencia roja inducida por el cambio de conformación (λem = 640 nm) de complejos BSA-Au(III). El método ajusta el pH para mostrar que la aparición de la fluorescencia roja se correlaciona con las transiciones inducidas por el pH de equilibrio de las conformaciones de BSA. Complejos de BSA-Au(III) fluorescentes rojo sólo pueden ser formadas con un ajuste del pH o por encima de 9.7, que corresponde a la conformación de la "Forma" de BSA. Se describe el protocolo para ajustar la BSA a fracción molar de Au y para monitorear el curso del tiempo del proceso de unión de Au(III). El número mínimo de Au(III) por BSA, para producir la fluorescencia roja, es menos de siete. Describimos el protocolo en pasos para ilustrar la presencia de múltiples sitios de unión de Au(III) en BSA. Primero, mediante la adición de cobre (Cu(II)) o níquel (Ni(II)) cationes seguidos de Au(III), este método revela un sitio de Unión para Au(III) que no es el fluoróforo rojo. En segundo lugar, modificando BSA por tiol agentes de recubrimiento, se revela otro sitio de unión de Au(III) de formación nonfluorophore. En tercer lugar, cambiando la conformación de BSA hendiendo y nivelación de los enlaces de disulfuro, se ilustra el posible sitio de Unión Au(III). El protocolo descrito, para controlar la conformaciones de BSA y el enlace de Au(III), puede aplicarse generalmente para estudiar las interacciones de proteínas y cationes del metal.

Introduction

Un compuesto de BSA-Au exhibiendo una radiación ultravioleta (UV)-excitable fluorescencia roja, con notable cambio de stokes, ha sido sintetizado originalmente por Xie et al. 1. la fluorescencia rojo única y estable puede encontrar diversas aplicaciones en campos tales como la detección de2,3,4, imagen5,6,7o nanomedicina8 ,9,10,11,12,13. Este compuesto ha sido estudiado ampliamente por muchos investigadores en el campo de la nano-ciencia en los últimos años14,15,16. El compuesto de Au de BSA ha sido interpretado como Au25 nanoclusters. El objetivo del método presentado es examinar este compuesto detalladamente y entender el origen de la fluorescencia roja. Siguiendo el enfoque presentado, se pueden ilustrar la presencia de múltiples sitios de unión de Au y el origen de la fluorescencia, alternativa a la nucleación del solo-sitio de Au25 nanoclusters. El mismo enfoque se puede emplear para estudiar cómo otras proteínas17,18,19 complexed con Au(III) puede cambiar sus propiedades intrínsecas de la fluorescentes.

La síntesis del compuesto fluorescente rojo Au BSA requiere un control estrecho de las relaciones molares de BSA para Au (BSA:Au) para maximizar la intensidad de la fluorescencia y la ubicación de los picos en la emisión excitación mapa (EEM)20. Puede ser demostrado que existen múltiples sitios de Unión para que Au(III) a atascarse, incluyendo el fragmento de asparagina (o fragmento de Asp, los primeros cuatro residuos del aminoácido en el N-terminal del BSA)21,22. El aminoácidoth 34 de BSA (Cys-34) también se indica para coordinar Au(III) y participar en el mecanismo de la fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) rojo20. Al unirse todos enlaces de disulfuro de la Cys-Cys y tapado todo fluorescencia de tioles, rojo no es producido ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Esto indica la necesidad de disulfuro de la Cys-Cys como el sitio de Unión Au(III) para producir la fluorescencia roja.

Técnicas de química de proteínas no han sido ampliamente utilizadas para el estudio de los complejos BSA-Au(III) en la comunidad de nano-ciencia. Sin embargo, sería útil emplear estas técnicas para comprender ciertos aspectos de estos complejos, así como para obtener una comprensión detallada de los sitios de unión de Au(III) en BSA. Este artículo pretende mostrar algunas de estas técnicas.

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Protocol

1. síntesis del complejo BSA-Au(III)

  1. Disolver 25 mg de BSA en 1 mL de agua grado de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en un frasco de reacción de 5 mL.
    Nota: La solución debe aparecer claro.
  2. Disolver el oro (III) trihidrato de cloruro (ácido chloroauric) a una concentración de 5 mM de agua de calidad HPLC.
    Nota: La solución debe aparecer amarillo. Chloroauric solución de ácido a esta concentración resultará en una BSA al cociente de Au de 1:13.
    1. Alternativamente, preparar una solución de ácido chloroauric con una concentración de dondequiera entre 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) 20 mm (BSA:Au = 1:50) en HPLC grado agua.
      Nota: Diversos cocientes de BSA a oro resultará en los patrones de fluorescencia roja drásticamente diferente del mapa de excitación emisión.
  3. Colocar el frasco de reacción de BSA en un baño de agua de 37 ° C y agitar vigorosamente a 750 rpm usando un agitador magnético.
  4. Inmediatamente después de que comience la agitación, añadir 1 mL de ácido chloroauric a la solución. El color de la solución debe transformar de claro a amarillo.
  5. Removemos la mezcla durante 2 minutos a 37 ° C y a 750 rpm usando un agitador magnético.
  6. En el frasco de reacción, añada 100 μL de 1 M NaOH a la solución para llevar el pH a 12.
    Nota: Inmediatamente después de agrega NaOH, la solución debe oscurecer un poco a un amarillo marrón y luego vuelta a amarillo.
  7. Continúe revolviendo a 750 rpm durante 2 h y a 37 ° C. La solución debe cambiar poco a poco de amarillo a un color amarillo/marrón oscuro. Este cambio de color indica la formación de los BSA-Au(III) fluorescentes rojo complejo.
  8. Permita que la muestra permanezca a temperatura ambiente por 2 días y la solución se oscurece hasta un marrón ámbar y aumentará la intensidad de fluorescencia.
    1. Alternativamente, dejar que la muestra continúe remover a 37 ° C por 12 h más como el color de la solución evoluciona a un color marrón ámbar.

2. síntesis de BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. Disolver 25 mg de BSA en 1 mL de agua de calidad HPLC. La solución debe aparecer claro.
  2. Disolver el cobre (II) cloruro dihidrato en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM. La solución debe aparecer la luz azul.
  3. Añadir 1 mL de la solución acuosa de BSA a un frasco de reacción de 5 mL y colocar en un baño de agua a 37 ° C. Revolver la mezcla a 750 rpm.
  4. Inmediatamente añada 0,5 mL de cobre (II) cloruro dihidrato para el frasco de reacción y mezclar durante 2 minutos. La solución seguirá siendo la luz azul.
  5. Añadir 75 μL de 1 M NaOH para llevar el pH a 12 y deje mezclar durante 2 h. La solución se volverá púrpura.
  6. Disolver el ácido chloroauric en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM.
  7. Agregar 0,5 mL de ácido chloroauric acuosa al frasco de reacción y ajuste el pH a 12 con 1 M NaOH.
  8. Revuelva la mezcla de reacción durante 2 h.
    Nota: La solución debe evolucionar a un color marrón.

3. síntesis de BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. Disolver 25 mg de BSA en 1 mL de agua de calidad HPLC. La solución debe aparecer claro.
  2. Disolver el cloruro de níquel (II) hexahidratado en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM. La solución debe aparecer la luz verde.
  3. Añadir 1 mL de la solución acuosa de BSA a un frasco de reacción de 5 mL y colocar en un baño de agua a 37 oC. Revuelva la mezcla en 750 rpm.
  4. Añadir 0,5 mL de la solución de níquel (II) cloruro hexahidrato al frasco de reacción y mezclar durante 2 minutos.
    Nota: La solución seguirá siendo la luz verde.
  5. Añadir 75 μL de 1 M NaOH para llevar el pH a 12 y deje mezclar durante 2 h.
    Nota: La solución se convertirá en amarillo oscuro.
  6. Disolver el ácido chloroauric en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM.
  7. Agregar 0,5 mL de ácido chloroauric acuosa al frasco de reacción y ajuste el pH a 12.
  8. Revuelva la mezcla de reacción durante 2 h.
    Nota: La solución debe evolucionar a un color marrón.

4. síntesis de [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. 2 mg de N-etilmaleimida (NEM) se disuelven en 1 mL de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4).
  2. Disolver 2 mg de BSA en 1 mL de solución de PBS-NEM.
  3. Transferir la solución a un frasco de reacción de 5 mL y revolver a 20 ° C a 500 rpm durante 1 hora.
  4. Dializan la solución utilizando 12 kDa tubo de diálisis en 500 mL de PBS, agitación a 50 rpm con un agitador magnético durante la noche para quitar NEM no reaccionado.
  5. Disolver el ácido chloroauric en PBS a una concentración de 0,4 mM.
    Nota: La solución será un amarillo tenue.
  6. Transferencia el frasco de reacción en un baño de agua a 37 ° C. Revuelva a 750 rpm.
  7. Inmediatamente añada 1 mL de solución de ácido chloroauric al frasco de reacción y deje que se mezcle durante 2 minutos.
  8. Añadir 75 μL de NaOH M 1 para el frasco de reacción para llevar el pH a 12 y deje mezclar durante 2 h.

5. síntesis de [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. Preparar una solución 2 M urea y 50 mM de bicarbonato de amonio (NH4HCO3, pH 8.0) en agua de calidad HPLC.
  2. Disolver 3,3 mg de BSA en 1 mL de la solución anterior y transferencia a un frasco de reacción de 5 mL.
  3. Hacer una solución de 0.25 M tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) disolviendo 62.5 mg de TCEP en 1 mL de agua HPLC.
  4. Añadir la solución de TCEP al frasco de reacción hasta que la concentración final de TCEP 8 mM.
  5. Incubar la solución en un baño de agua durante 1 h a 50 ° C. Revuelva a 500 rpm con un agitador magnético.
  6. Deje que la solución se enfríe completamente a temperatura ambiente.
  7. Preparar una solución stock de 100 mM NEM disolviendo 12,5 mg de NEM en 1 mL de agua de calidad HPLC.
  8. Añadir la solución de NEM para el frasco de reacción hasta que la concentración final de NEM es de 16 mM.
  9. Deje que la solución de combinar por 2 h a 20 ° C. Revuelva a 500 rpm.
  10. Dializan la solución utilizando un tubo de diálisis 12 kDa, agitando la solución a 50 rpm con un agitador magnético durante la noche en 500 mL de 50 mM NH4HCO3 para remover exceso TCEP, NEM y urea.
  11. Mueva el frasco de reacción en un baño de agua a 37 ° C y agitar a 750 rpm.
  12. Disolver el ácido chloroauric en agua de calidad HPLC a una concentración de 0,66 mM.
  13. Inmediatamente añada 1 mL de solución de ácido chloroauric al frasco de reacción y deje que se mezcle durante 2 minutos.
  14. Añadir 1 M NaOH hasta que el pH de la solución es 12 y dejar la solución para continuar mezclando durante 2 h.

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Representative Results

De la fluorescencia del complejo BSA-Au(III), se ha observado que la conversión de la fluorescencia azul intrínseca de BSA (λem = 400 nm) a fluorescencia roja (λem = 640 nm) se presenta en sobre pH 9.7 a través de un equilibrio transición (figura 1). EEM de BSA-Au(III) en diferentes BSA para relaciones molares de Au se muestra en la figura 2, y estos datos muestran cómo modificar las relaciones molares produce la misma longitud de onda de emisión a longitudes de onda de excitación diferentes. Cu(II), Ni(II) y Au(III) se unen competitivamente a un sitio conocido (fragmento del Asp) en BSA (figura 3). La BSA tapón Cys34 muestra un cambio en patrones de pico EEM con enlace Au(III), y estos resultados muestran cómo alteración de sitios de Unión específicos altera patrones de fluorescencia. La BSA todo-tiol-capped ninguna fluorescencia roja muestra y revela disulfuro Cys-Cys como sitios de enlace posible para producir el fluoróforo rojo (figura 4).

Figure 1
Figura 1. Fluorescencia de BSA-Au(III) y la conformacional inducida por el cambio de azul a rojo (A) la absorción y fluorescencia (λex = 365 nm) de BSA-Au(III). (B) fluorescencia roja los seres emergen en torno a pH 9.7, en que cambia la conformación de BSA. (C) azul decae de fluorescencia como surge la fluorescencia roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Medidas del mapa (EEM) de relación métrica excitación emisión de BSA-Au(III). EEM de BSA-Au(III) complejo sintetizado utilizando el protocolo estándar mientras se ajusta la proporción de BSA al oro. BSA (A) a pH 12, (B) BSA:Au = 1:1, BSA:Au (C) = 1:7, BSA:Au (D) = 1:13, BSA:Au (E) = 1:26, BSA:Au (F) = 1:30, BSA:Au (G) = 1:40, BSA:Au (H) = 1:52. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Complejos de EEM de BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III). Mapas de excitación emisión (excitación: 290-500 nm, emisión: 300-850 nm) de BSA complejado con Cu(II)/Ni(II) a pH 12 (A y B), la BSA complejado con Cu(II)/Ni(II) y luego Au(III) a pH 12 (C y D) y la absorción espectros que comparan BSA, BSA-Au, BSA-Cu(II)/Ni(II) y BSA-Cu(II)/Ni(II)-Au(III) (E y F). Curva 4 se compara con la superposición de las curvas 2 y 3. Esta figura ha sido modificada de Dixon, M. J. & Egusa, S. J. am Chem SOC. 140 2265-2271, (2018). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. EEM de Cys34 capsulados y tioles todas nevadas. EEM (excitación: 300-500 nm, emisión: 300-700 nm) de (A) BSA tapón Cys34 reaccionó con Au a pH 12. En (B), los enlaces de disulfuro Cys-Cys en BSA fueron troceados y entonces todo-tiol-capped-BSA fue reaccionada con Au a pH 12. Esta figura ha sido modificada de Dixon, M. J. & Egusa, S. J. am Chem SOC. 140 2265-2271, (2018). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los compuestos de BSA-Au(III) preparados a pH 12 exhiben fluorescencia roja en una longitud de onda de emisión de λem= 640 nm cuando se excitó con ultravioleta (UV) luz λex= 365 nm (figura 1A). La aparición de fluorescencia roja es un proceso lento y llevará unos días a temperatura ambiente para aumentar a una intensidad máxima. Funcionando la reacción a 37 ° C dará los resultados óptimos, aunque una temperatura más alta puede utilizarse para producir la fluorescencia roja más rápido. Degradación irreversible de la proteína puede ocurrir a temperaturas superiores a 45 ° C23. El ajuste del pH por lo que BSA transforma su edad (pH > 10) conformación21 ("uno-forma") es crítica para fluorescencia roja; finamente se ajustó pH de neutro a básico para determinar el umbral de la aparición de fluorescencia roja (figura 1B, C). De máxima intensidad fluorescente rojo, se debe ajustar el pH por encima de 11. Para fluorescencia roja, el pH puede ajustarse más allá de 11, aunque extremadamente condiciones básicas (pH > 13) pueden desnaturalizar BSA y causar fluorescencia roja a desaparecer.

Variando la relación estequiométrica de BSA y Au puede ilustrar la Unión de la Au a BSA. Los espectros de fluorescencia de los compuestos de BSA-Au(III) varían dependiendo de las relaciones estequiométricas de BSA para Au (figura 2). Como la BSA al cociente de oro se ajusta a 1:26, se observa un máximo en la intensidad de fluorescencia roja en λex= 500 nm. Por otra parte, como la relación BSA:gold se ajusta a fluorescencia roja 1:7, se observa principalmente en λex= 365 nm. Ninguna fluorescencia roja puede ser detectada en una proporción de BSA para Au menos 1:7 o por encima de 1:52. El número mínimo de oro cationes necesaria para producir el rojo fluorescencia es menos de 7 y más de 1, y el número máximo de la pérdida de la fluorescencia roja es mayor que 52 (figura 2B, C). Además, la reducción de las muestras mencionadas pueda ocurrir exceso Sodio borohidruro, aclarar que todas las muestras contienen todavía Au(III) catiónico. Además, la adición de cantidades excesivas de oro más allá de 20 mM puede causar la solución a ser demasiado ácido y desnaturalizar la proteína. Si la desnaturalización de la proteína ocurre debido a la alta acidez, reducir la concentración de BSA y Au relativamente para mediar en este asunto.

Unión competitiva de Au y otros cationes metálicos a BSA puede ilustrar los sitios de Unión en BSA. Es sabido que Cu(II) y Ni(II) se unen a la Asp fragmento en la N-terminal de BSA24,25,26,27. Mediante la adición de Cu(II), una carpeta fuerte para el fragmento de Asp, seguido por la adición de Au(III), los espectros de absorción de BSA-Cu(II)-Au(III) y los espectros de absorción de BSA-Au(III) y BSA-Cu(II) son los mismos - lo que indica que oro y cobre no compiten por el mismo sitio de Unión en el Asp-fragmento (figura 3). Ni(II) se une débilmente al fragmento de Asp y por lo tanto Au(III) compite con Ni(II) oro se añade; se ha observado que los espectros de absorción de BSA-Ni(II) y BSA-Au(III) no se correlaciona con la de BSA-Ni(II)-Au(III) (figura 3F). A través del protocolo anterior, se puede demostrar cómo Au(III) se une en el sitio de Unión conocido de BSA. Esta técnica también requiere el ajuste de pH superior a 11 y la técnica es modificada mediante la adición de dos veces la concentración de BSA pero a medio volumen, por lo tanto esto debe realizarse en BSA baja proporción Au para mantener la conformación de la proteína.

Modificación de residuos de cisteína en BSA puede aclarar más lejos los sitios de unión de Au. Oro es conocido por tener una alta afinidad para el tiol28 y BSA posee un superficie accesible tiol (Cys34)21. Mediante el bloqueo de este tiol, sitios de unión secundaria pueden ser aclados. El bloqueo de esta cisteína se lleva a cabo antes de la adición de Au(III) a la muestra y presenta un patrón de fluorescencia modificada de BSA-Au(III), que indica un camino posible transferencia involucradas en el mecanismo de fluorescencia roja (Figura 4A). Es imprescindible agregar el agente de bloqueante de tiol, en este caso NEM, a un pH neutro. Unirse todos los enlaces de disulfuro y el capsular posterior de su revela grupos de tiol libre ninguna fluorescencia roja (Figura 4B). Estos resultados indican que un enlace de disulfuro se requiere para producir un complejo rojo fluorescente.

Hemos demostrado en varios protocolos, mediante el uso de espectroscópicos y técnicas de la química de proteína, un método para analizar los complejos BSA-Au(III). Técnicas de la química de proteína presentadas no han sido ampliamente utilizadas en la investigación de nanomateriales basados en proteína14. Estas técnicas pueden aplicarse generalmente y ser valioso para entender el proceso de enlace de metal y los sitios de Unión posible en otro, si no todas, proteínas tales como la tripsina, la pepsina, la lisozima y la transferrina17,29. Las proteínas son dinámicos, pero muy precisas "nanomateriales". Comprensión detallada del sitio de unión de metal podría allanar el camino hacia nuevos materiales basados en proteínas con propiedades ópticas controlados con gran número de aplicaciones potenciales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

S.E. reconoce el apoyo del fondo de iniciativa especial Duke Endowment, Wells Fargo fondo, PhRMA Foundation, así como fondos de puesta en marcha de la Universidad de Carolina del norte, Charlotte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA), 96% Sigma-Aldrich A5611
gold (III) chloride trihydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 520918
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% Sigma-Aldrich 459097
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% Sigma-Aldrich 654507
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% Sigma-Aldrich 4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% Sigma-Aldrich C4706
Sodium hydroxide, >98.0% Sigma-Aldrich S8045
Urea, 99.5% Chem-Implex Int'l 30142
Phospate buffered saline (PBS) Corning MT21040CV
Ammonium bicarbonate, 99.5% Sigma-Aldrich 9830

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