Summary
Il protocollo descrive una tecnica per studiare la capacità delle cellule T umane policlonali primarie per formare sinaptiche interfacce utilizzando lipidici planare. Usiamo questa tecnica per dimostrare la capacità di formazione di sinapsi differenziale delle cellule T umane primarie derivata da linfonodi e nel sangue periferico.
Abstract
L'attuale comprensione delle dinamiche e caratteristiche strutturali delle interfacce sinaptiche della T-cellula sono stato in gran parte determinati attraverso l'utilizzo di vetro-supportato bilayer planare e in vitro-derivata T-cellula clona o linee1,2 ,3,4. Come applicano questi risultati a cellule T umane primarie isolate da sangue o linfoide tessuti non è noto, in parte a causa di notevoli difficoltà nell'ottenimento di un numero sufficiente di cellule per analisi5. Qui ci rivolgiamo questo attraverso lo sviluppo di una tecnica sfruttando le diapositive di flusso multicanale per costruire planare lipidici contenenti molecole di adesione e di attivazione. La bassa altezza delle diapositive flusso promuove sedimentazione rapida delle cellule al fine di sincronizzare l'attaccamento cellulare: doppio strato, consentendo ai ricercatori di studiare la dinamica della formazione sinaptica interfaccia e la cinetica del rilascio granuli. Applichiamo questo approccio per analizzare l'interfaccia sinaptica di minor come 104 a 105 primaria crioconservati T cellule isolate da linfonodi (LN) e nel sangue periferico (PB). I risultati rivelano che la tecnica del doppio strato lipidico planare romanzo consente lo studio delle proprietà biofisiche delle cellule T umane primarie derivate dal sangue e dai tessuti nel contesto della salute e nella malattia.
Introduction
Conoscenza scientifica delle caratteristiche strutturali delle sinapsi immunitarie T-cellula e loro collegamento con l'attività funzionale delle cellule T è stata generata principalmente dallo studio di linee cellulari e cloni derivata da PB. A quale grado di questi risultati si riferiscono a cellule T primarie ottenute da sangue o tessuti linfoidi umani rimane poco chiaro, come le interfacce sinaptiche delle cellule di T che risiedono nei tessuti linfoidi e altri non sono stati finora analizzate. Cosa importante, i dati emergenti suggeriscono che le cellule di T di residenti in tessuto e linfoide-organo-derivati possono avere differenze significative nel loro fenotipo e l'attività funzionale rispetto a quelli in PB6,7. Questo ulteriore ha solidificato la necessità di comprendere meglio le caratteristiche dell'interfaccia sinaptica delle cellule T in cellule T umane primarie.
A tal fine, abbiamo sviluppato un approccio di mini-scala romanzo sfruttando lipidici incorporati nelle slitte di flusso multicanale che ci permette di eseguire l'imaging delle interfacce di T-cellula/doppio strato con meno di 10 cellule T primarie5 isolate da PB umano e LN. Questa nuova tecnica consente lo studio delle proprietà biofisiche delle interfacce primarie della T-cellula umane sinaptiche al fine di meglio modellare e capire in vivo interazioni cellula-cellula.
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Protocol
Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki. Consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e campioni di sangue e di linfonodo sono stato acquistati con l'approvazione del Comitato di revisione istituzionale presso l'Università della Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Tutti i soggetti umani erano adulti. I campioni di sangue del cordone sono state gentilmente concesse da travaglio e il parto del reparto di Ostetricia & Ginecologia presso la Thomas Jefferson University. Tutti i campioni sono stati de-identificati.
1. isolamento di CD4+ T cellule per un'analisi di immagine
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Scongelare un'aliquota da 1 mL contenente 10 cellule mononucleari del sangue periferico7 congelati (PBMCs) o cellule mononucleari di linfonodo (LNMCs) da campioni raccolti. In una cappa sterile, è necessario aggiungere le cellule scongelate a 9 mL di RPMI completate con penicillina/streptomicina e glutammina.
- Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di RPMI supplementato contenente 10% FBS (sostanza completa). Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
- Il giorno successivo, purificare CD4+ T cellule immunomagnetica negativa l'ordinamento utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore.
- Per misurare il numero di CD4 appena purificato+ T cellule, mescolare 5 µ l di sospensione cellulare con un volume uguale di una soluzione di blu di trypan. Caricare un emocitometro con un cellulare-trypan blu miscela e contare le cellule vive all'interno delle 5 sezioni dell'emocitometro.
- Prendere la media del numero delle cellule e determinare il numero di cellule in sospensione delle cellule originali: il numero di cellule/1 mL = conteggio medio x 2 x 104. Se il numero totale di cellule isolate è troppo piccolo, è possibile utilizzare le celle come è senza contare.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min e risospendere in un buffer di analisi (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm Na2HPO4, 5mm D-glucosio, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2mm CaCl2e 1% di albumina sierica umana) 105 < /C13 > cellule/50 µ l o meno e mantenere le cellule a 4 ° C (per 1 – 2 h) fino all'uso negli esperimenti.
- Smaltire tutti i rifiuti biologici secondo le pertinenti linee guida istituzionali.
- Se si desidera come una popolazione delle cellule di controllo, preparare le cellule T CD8 attivate da sangue cordonale PBMC, posto 107 cellule in 5 mL di terreno completo in un matraccio di cultura T25 coperto con una miscela di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 a 10 µ g/mL e 1 µ g/mL , rispettivamente.
- Il giorno successivo, rimuovere le cellule del sangue di cordone attivato dalla beuta, lavarli 1x con freschi completare medio ed espandere le cellule in presenza di IL-2 ricombinante (100 U/mL) per 2 settimane.
- Purificare il sangue del cordone ombelicale CD8+ T cellule immunomagnetica negativa l'ordinamento utilizzando il kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Contare le celle e scambiare i media per il tampone, come descritto nei passaggi 1.3-1.6 per LN e PB CD8+ T cellule.
2. i componenti per la preparazione della lipidici planare
- Preparare 3 tipi di liposomi come descritto altrove5: (a) 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glicero-3-fosfocolina) liposomi, (b) 0,4 mM DOPC liposomi 33% in moli cani-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glicero - 3-[(N-(5- ammino-1-carboxypentyl) acido iminodiacetic) succinil] (sale di ammonio)) lipidi, (c) 0,4 mM DOPC liposomi contenenti 4 mol % biotynil-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glicero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotynil) (sale di sodio)).
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Preparare soluzione 5% caseina come descritto in precedenza5.
- Sciogliere 5 g di polvere di caseina in 100 mL di acqua ultrapura e 350 µ l di 10 M di idrossido di sodio. Mescola il tutto su un agitatore magnetico regolare a bassa velocità secondo la scala disponibile, a temperatura ambiente per 2 h e quindi durante la notte a 4 ° C. Regolare il pH a 7.3 e ultracentrifuga la soluzione per 2 h a 100.000 x g a 4 ° C. Filtrare il surnatante con un filtro sterile da 0,22 µm e conservare la soluzione in aliquote a-80 ° C.
Attenzione: la soluzione di idrossido di sodio può causare ustioni chimiche e può indurre cecità permanente al contatto con gli occhi. Utilizzare guanti di gomma, indumenti di sicurezza e protezione degli occhi durante la manipolazione di questo prodotto chimico o le relative soluzioni.
- Sciogliere 5 g di polvere di caseina in 100 mL di acqua ultrapura e 350 µ l di 10 M di idrossido di sodio. Mescola il tutto su un agitatore magnetico regolare a bassa velocità secondo la scala disponibile, a temperatura ambiente per 2 h e quindi durante la notte a 4 ° C. Regolare il pH a 7.3 e ultracentrifuga la soluzione per 2 h a 100.000 x g a 4 ° C. Filtrare il surnatante con un filtro sterile da 0,22 µm e conservare la soluzione in aliquote a-80 ° C.
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Anticorpo anti-CD3 di etichetta con biotina per produrre molecole di anticorpo mono-bionylated con un approccio descritto in precedenza8.
- Preparare una soluzione di biotina-PEO4-NHS in dimetilsolfossido (DMSO) a 0,1 mg/mL. Aggiungere 3,7 µ l della soluzione di biotina-PEO4-NHS a 1 mg di anticorpo in 0,5 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente bicarbonato di sodio 100 mM.
- Incubare la miscela per 2 h a temperatura ambiente. Preparare una soluzione di estere di Alexa Fluor 488 NHS a 10 mg/mL in DMSO. Aggiungere la soluzione di Alexa Fluor 488 NHS estere per l'anticorpo marcato da biotina-PEO4-NHS presso un eccesso molare 10 volte.
- Incubare la miscela per 1 h a temperatura ambiente con agitazione lenta su un agitatore magnetico regolare. Separare il colorante non associato mediante cromatografia di esclusione dimensionale.
- Determinare la concentrazione di anticorpi misurando la densità ottica della soluzione dell'anticorpo a 280 nm (A280). Misurare la densità ottica degli anticorpi con etichettati a 577 nm (un577).
- Determinare il rapporto di tintura-a-anticorpo usando la seguente equazione:
Nota: Trovare ulteriori dettagli nel protocollo del produttore.
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Esprimono una proteina ricombinante di ICAM-1 solubile in un sistema di espressione di Drosophila come descritto in precedenza3,4,9,10.
- Clone, con cDNA encoding, il ectodomain di ICAM-1 in Drosophila espressione vettoriale pMT/V5-His con un promotore inducibile metallotioneina per produrre una proteina ricombinante aggiunta con una sua etichetta6 all'estremità C-terminale.
- Co-transfect cellule S2 con il plasmide contenente risultante di ICAM-1 e un vettore di espressione G418. Selezionare trasfettanti stabili utilizzando supporti di Drosophila di Schneider completati con 10% siero fetale di vitello (FCS) e 0,5 mg/mL di G418 per 3 settimane. Espandere le cellule in medium senza siero insetto e indurre un'espressione della proteina con 0,5 mM di CuSO4 per 3 d.
- Concentrarsi sulla cultura surnatante x 10 e Dializzare contro PBS tramite un concentratore di flusso tangenziale come descritto in precedenza11.
- Applicare il surnatante della cultura concentrata a una colonna contenente Sepharose con un anticorpo monoclonale anti-ICAM-1 in covalenza immobilizzato ed eluire l'ICAM-1 associato con un tampone di glicina 50 mM, pH 3.0. Immediatamente neutralizzare la proteina di ICAM-1 eluita con un tampone di Tris di 2 M, pH 8.0.
- Dializzare il materiale contro PBS, pH 8.0 e aggiungere il materiale dializzato a una colonna contenente Ni-NTA dell'agarosi. Eluire ICAM-1 solubile con imidazolo di 200 mM, pH 8.0. Dializzare il materiale contro un tampone PBS, pH 8.0.
- Etichettare l'ICAM-1 purificata con estere NHS Cy5 secondo le istruzioni del fabbricante.
Nota: Il miglior rapporto finale della tintura--proteina è 1:1.
- Fab di produrre frammenti da un anticorpo anti-CD107a di digestione di papaina e purificare il Fab frammenti mediante cromatografia a scambio ionico come descritto in precedenza3. Etichetta il Fab frammenti con estere di Alexa Fluor 568 NHS secondo le istruzioni del fabbricante.
3. formazione di vetro-supportati planare lipidici
- Preparare una soluzione piranha acida fresca con 140 mL di acido solforico concentrato e 60 mL di perossido di idrogeno 30%. Lavare i vetrini coprioggetti per le diapositive di flusso da li ammollo nella soluzione acida piranha per 30 min. Hold il vetrino coprioggetti con una pinza a forbice in polipropilene.
Attenzione: La soluzione Piranha è un ossidante molto forte. Ricordarsi di indossare occhiali di sicurezza o occhiali di protezione o uno scudo integrale con guanti di gomma spessa in ogni momento mentre si maneggia la soluzione. Funzionano solo con soluzione piranha sotto cappa aspirante. Evitare il riscaldamento, trasporto o scuotendolo in qualsiasi momento durante l'uso, perché potrebbe esplodere. Raccogliere i rifiuti di piranha in una bottiglia di vetro con un buco contenenti piombo. Contattare il Comitato istituzionale di sicurezza circa l'utilizzo corretto dei rifiuti. -
Sciacquare i coprioggetti lavati 7 x con acqua ultrapura trasferendoli in sequenza nel becher contenente acqua fresca. Set lamelle bagnate da parte per lasciare che il restante acqua rotolare fuori il vetro pulito, lasciando il vetro asciutto.
- In alternativa, è possibile utilizzare un puntale attaccato ad una pompa di vuoto per rimuovere accuratamente le gocce d'acqua rimanenti da lamelle.
- Nella cappa sterile, eseguire diluizioni dei vari lipidi per produrre il mix di liposomi per fare strati lipidici. In primo luogo, combinare 37 µ l di liposomi DOPC e 3 µ l di liposomi biotynil-Cap-PE. In secondo luogo, mix 14 µ l di liposomi DOPC e 15 µ l di liposomi di cani-NTA. In terzo luogo, aggiungere 1 µ l della miscela prima a 29 µ l della miscela seconda per fabbricare la miscela finale liposoma.
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Nella cappa sterile, impostare un'area di lavoro con vetrini coprioggetti asciutti nelle vicinanze. Aliquotare 2 µ l della miscela finale liposoma (Vedi punto 3.3) proprio nel centro di un canale di diapositiva autoadesiva. Immediatamente e molto precisamente allineare un coprioggetto pulito e asciutto con la diapositiva e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetto sul lato appiccicoso della diapositiva.
- Se preparare più di una diapositiva, lavorare su una diapositiva alla volta poiché la miscela del liposoma evapora rapidamente. Capovolgere la diapositiva e utilizzare l'anello esterno del forcipe forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del coprivetrino con lo scivolo, assicurandosi che lo slittamento è strettamente collegato alla diapositiva per escludere perdite.
Nota: Non premere contro i canali della diapositiva per evitare la rottura o fessurazione il vetrino coprioggetti. - Capovolgere nuovamente la diapositiva e segnare la posizione del bilayer formata, che assomiglia ad una goccia tra il vetrino coprioggetto e lo scivolo di canale, da disegno 4 punti con un pennarello indelebile intorno il bilayer sul lato slitta esterna dell'Assemblea.
- Se preparare più di una diapositiva, lavorare su una diapositiva alla volta poiché la miscela del liposoma evapora rapidamente. Capovolgere la diapositiva e utilizzare l'anello esterno del forcipe forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del coprivetrino con lo scivolo, assicurandosi che lo slittamento è strettamente collegato alla diapositiva per escludere perdite.
- Prima la prima iniezione di un liquido nel canale, è necessario designare una porta del canale come la porta di entrata e l'altro come la porta di uscita e mantenere questa designazione in tutto l'esperimento.
- Per evitare la formazione di bollicine, inserire l'estremità della punta della pipetta direttamente la porta di entrata del canale. Riempire lentamente i canali della diapositiva con 50 µ l di caldo (temperatura ambiente di almeno) tampone del saggio (Vedi punto 1.5 per la composizione di buffer).
- Preparare una soluzione di cloruro di nickel 0,5 M. Scongelare un'aliquota di 2 mL di soluzione di caseina in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min e integrarla con una soluzione di cloruro di nichel ad una concentrazione finale di 200 µM.
- Lavare il bilayer prima iniezione di 100 µ l della soluzione di caseina nella porta di entrata del canale e quindi immediatamente rimuovendo 100 µ l fuori la porta di uscita sulla diapositiva di pipettaggio. Bloccare il bilayer con la stessa soluzione da iniettare 100 µ l della soluzione caseina la porta di ingresso di ciascun canale e incubando il vetrino per 45 min a temperatura ambiente.
- Disgelare aliquote di Cy5-ICAM-1-His proteine6 e streptavidina. Combinare le proteine nel tampone alla concentrazione finale di 2 µ g/mL. Centrifugare la soluzione per 30 min a 20.000 x g e a 4 ° C per rimuovere qualsiasi aggregazione.
- Rimuovere il resto della soluzione bloccante dalla porta di uscita del canale diapositiva pipettando. Iniettare 100 µ l di soluzione contengono ICAM-1 e streptavidina alla porta di ingresso.
- Incubare il vetrino per 45 min a temperatura ambiente. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione della proteina della porta di uscita. Lavare il bilayer 2 x prima iniezione di 100 µ l di tampone di dosaggio nella porta di entrata del canale e quindi immediatamente rimuovendo 100 µ l fuori la porta di uscita.
- Diluire un anticorpo anti-CD3 Alexa-Fluor-488-etichettati con il tampone di dosaggio a una concentrazione finale di 2 µ g/mL. Iniettare 100 µ l di soluzione di anticorpo alla porta di entrata della diapositiva e incubare per 45 min a temperatura ambiente. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione della proteina della porta di uscita. Lavare il bilayer 2 x con 100 µ l di tampone di dosaggio come descritto al punto 3.11.
4. imaging dell'interazione cellule T con il Bilayer planare
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Preriscaldare la fase e l'obiettivo di un microscopio a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale o confocale fino a quando la temperatura è equilibrata a 37 ° C. Impostare la diapositiva con il bilayer(s) sul piatto riscaldato. Spostare il palco in una posizione appropriata secondo i segni di inchiostro e concentrarsi sul bilayer impiegando la fluorescenza di molecole ICAM-1 Cy-etichettati.
- Utilizzare un obiettivo X 61 per il microscopio confocale, o un obiettivo 100x per il microscopio TIRF, con le impostazioni di filtro appropriato.
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Per granello release formazione immagine di microscopia TIRF, aggiungere Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a frammenti di anticorpo Fab alla sospensione di cellule ad una concentrazione finale di 4 µ g/mL prima di iniettare le cellule nelle porte di entrata.
- Risospendere il CD4 preparato+ T cellule isolate da LN o PB o cavo di alimentazione del sangue e iniettare 50 µ l di sospensione cellulare nella porta di entrata del canale diapositiva contenente il bilayer.
- Scegliere il numero desiderato di campi e registrare le immagini di ogni campo 1 x ogni 2 min per 30 min dopo l'iniezione.
- Sfruttare il campo chiaro, riflessi luce fluorescente canali e (Alexa 488 e Cy5) del microscopio confocale per acquisire le immagini. Utilizzare la modalità TIRF per fluorescenza Alexa-Fluor-488 e Alexa-Fluor-568 e widefield per Cy5 fluorescenza, come pure il campo chiaro imaging, il microscopio di TIRF.
5. image Analysis
- Analizzare le immagini acquisite utilizzando il software appropriato. Osservare la morfologia delle cellule in immagini di luce trasmesse ed Escludi cluster e visibilmente danneggiati o cellule apoptotiche dall'analisi. Includere nell'analisi solo quelle cellule che interagiscono in modo produttivo con la superficie di doppio strato (cioè, Alexa-Fluor-488 fluorescenza (anticorpi anti-CD3) all'interfaccia di accumulo delle cellule).
- Determinare la dimensione della zona di adesione delle cellule a 20 min dopo l'inizio dell'interazione cellula-doppio strato.
Nota: L'area di adesione è l'area scura sviluppato all'interfaccia cellula-doppio strato sulle immagini di microscopia (IRM) riflessione di interferenza. - Osservare eventuali accumuli di fluorescenza di Cy5-ICAM-1 e una formazione di anello di giunzione segregata Cy-ICAM-1 molecole all'interfaccia cellula-doppio strato. Se accumulate ICAM-1 molecole formano un anello di giunzione adesione su almeno due immagini consecutive, designare tali cellule come le cellule in via di sviluppo una periferica d'attivazione supramolecolari cluster (pSMAC)12.
- Valutare la versione di granulo misurando l'intensità della fluorescenza di Alexa-Fluor-568 all'interfaccia cellula T-doppio strato sopra la fluorescenza di fondo fuori l'area di contatto in prossimità della cella. Designare le cellule con un rapporto di Alexa-Fluor-568 segnale--fondo di almeno 1,3 come cellule degranulating.
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Representative Results
In primo luogo, abbiamo confrontato la struttura dell'interfaccia sinaptica formata da attivati CD8 cavo-sangue-derivate+ T cellule esposte a lipidici costruito sia in flusso tradizionale su larga scala sistemi di cellule (Vedi la Tabella materiali particolari)1 ,2,3,4 o nelle diapositive di flusso multicanale. Il bilayer contenuti fluorescenti-etichetta anti-CD3 e ICAM-1 in 50 molecole/µm2 e 300 molecole/µm2, rispettivamente. CD8+ T le cellule derivate dal sangue del cordone ombelicale umano sono state attivate da una stimolazione con piastra-associazione anti-CD3 e anti-CD28 anticorpi13,14. Non c'era differenza tra CD8+ T cellule che sinapsi immunologica classica formata sui lipidici costruiti in cella di flusso o la diapositiva di flusso multicanale (Figura 1). Tutti gli altri esperimenti sono stati eseguiti con lipidici fatta nelle diapositive flusso multicanale.
Successivamente, abbiamo esaminato la capacità di PB - e LN-derivati umani CD4+ T cellule per formare sinaptiche interfacce con i planar lipidici e rilasciare granuli. Abbiamo sfruttato la microscopia TIRF per massimizzare la risoluzione verticale all'interfaccia cellula T-bilayer visualizzare degranulating cellule e per valutare la cinetica del rilascio del granello. Abbiamo osservato 4 gruppi di cellule per entrambi il CD4 LN - e PBMC-derivati+ T cellule: alcune cellule T stabilita mature sinapsi immuni, ma uno ha fatto o non ha rilasciato i granuli, altre cellule T rilasciato i granuli senza una formazione delle sinapsi mature e ancora altre cellule T formano sinapsi né rilasciato i granuli (Figura 2)7. La differenza tra CD4 LN - e PBMC-derivati+ T cellule è diventato evidente quando è stata valutata la cinetica del rilascio del granello. Derivata da PBMC CD4+ T cellule erano in grado di iniziare a rilasciare granuli quasi due volte più velocemente CD4 LN-derivati+ cellule (Figura 3)7. Nel complesso, i dati dimostrano che nonostante un'eterogeneità di CD4 LN - e PBMC-derivati+ T cellule, quest'ultimo contenuta una frazione di T cellule capaci di degranulazione rapida.
Figura 1: confronto tra il sistema di scorrimento del flusso e flusso convenzionale camera. (A), questo pannello mostra il flusso multicanale slide che consente un assemblaggio di 6 vetro-supportati planare lipidici. Ogni doppio strato è collegato alla consegna e le porte di uscita. Meno di 1 x 105 celle sono sufficienti per l'analisi. (B), questo pannello mostra il sistema di alloggiamento di flusso convenzionale permettendo un'Assemblea di 1 vetro-supportati planare doppio strato lipidico. 2 x 106 cellule sono necessari per l'analisi. Visualizza gli altri pannelli (C e D) rappresentante TIRF microscopia e (E e F) confocale con microscopia di riflessione di interferenza immagini (IRM) dell'interfaccia sviluppata da attivato cellule CD8 T cavo-sangue-derivate. Le cellule sono state esposte a un doppio strato lipidico contenente ICAM-1 (300 molecole/µm2) ed anticorpi anti-CD3 (50 molecole/µm2) acquistati (C ed E) in diapositive di flusso o (D e F) in un convenzionale sistema di flusso in condizioni simili. La microscopia TIRF e confocale con IRM immagini sono scattate utilizzando 100 X e 60X obiettivi ingrandimento, rispettivamente. La percentuale di cellule T che forma matura sinapsi il bilayer costruito in una diapositiva di flusso o camera di flusso convenzionale era molto simile, ma varia tra esperimenti dal 75% al 90%. In tutte le immagini, le molecole di Cy-5-labelled ICAM-1 sono mostrati in blu; Gli anticorpi anti-CD3 Alexa-Fluor-488-labeled sono mostrati in verde; Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a anticorpi associati a CD107a sono mostrati in rosso; Immagini IRM sono mostrati in ciano; e le barre di scala sono 10 µm di lunghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Struttura di un'interfaccia di cellula T – doppio strato e il modello del degranulation di linfonodo e periferico del sangue CD4 mononucleari+ T cellule. Cellule derivate da LNMC o PBMC sono state ordinate per separare CD4+ T cellule che sono stati esposti a bilayer contenenti 50 molecole/µm2 degli anticorpi anti-CD3 e 300 molecole/µm2 della proteina ICAM-1. L'interfaccia tra le cellule e il bilayer era imaged da microscopia TIRF. Le barre di scala sono 5 µm. (A) queste immagini rappresentative di una cellula di T - interfaccia doppio strato mostrano la struttura delle cellule T – doppio strato interfacce e reticolo di degranulazione. (B) questi diagrammi mostrano una rappresentazione di PBMC-derivata e LNMC CD4+ T cellule con una struttura diversa delle interfacce sinaptiche e modelli di rilascio del granello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cambiamenti dinamici della struttura di un'interfaccia di cellula T – doppio strato e la cinetica di una degranulazione del linfonodo e periferico del sangue CD4 mononucleari+ T cellule. (A), questo pannello spettacoli dipendente dal tempo cambiamenti di un'interfaccia di cellula T – doppio strato e la comparsa di granuli rilasciati. Le barre di scala sono 5 µm. (B), questo pannello mostra una quantificazione della cinetica di un rilascio di granello di CD4 LN-derivati+ T cellule (circoli chiusi) e derivata da PBMC CD4+ T cellule (cerchi aperti). Ogni singolo cerchio indica il tempo della prima apparizione di un rilascio di granuli rilevabile da singole celle. I mediani e IQR (range interquartile) sono indicati per tutti i grafici a dispersione. Per confrontare le differenze tra i gruppi indicati delle cellule di T sono stati effettuati test di Mann-Whitney. P < 0,05, * * P < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La nuova tecnica descritta qui utilizza simili reagenti necessari per costruire bilayer planare in flusso convenzionale cella5 e può essere applicata con successo per eseguire l'imaging del primario umano delle cellule T – doppio strato interfacce3,4 ,15. La tecnica offre una significativa riduzione nell'uso di molecole fluorescenti e richiede 10-20 volte meno cellule di T rispetto ad un flusso cellulare sistema5, creando la possibilità di analizzare cellule T umane primarie da sangue e altri tessuti.
Il numero di cellule iniettate utilizzato in questo studio ci ha permesso di immagine circa 50 cellule per campo con un obiettivo 60x dell'imaging. Una concentrazione più grande ha provocato l'aggregazione delle cellule, riducendo il numero di cellule per l'analisi. Abbiamo potuto ridurre ulteriormente il numero delle cellule iniettate 10 – 50 x, ma il limite inferiore di numero delle cellule dipende dalla eterogeneità cellulare, al numero di campi di imaging e sul disegno sperimentale. Alcuni ricercatori hanno usato in precedenza bilayer costruito in una camera aperta con un fondo di vetro che ha richiesto un numero simile di cellule per analisi16. Tuttavia, il sistema chiuso descritto qui, con un'altezza di canale di 0,1 - 0,4 mm, consente per sedimentazione rapida delle cellule sincronizzare il collegamento delle cellule e l'analisi della risposta delle cellule T senza il rischio di evaporazione del liquido. Ulteriormente il sistema di appiccicoso scivolo permette la formazione di fino a tre strati lipidici per canale. Così, lo stesso campione di cella potrebbe essere utilizzato per l'analisi del comportamento delle cellule su doppii strati distinti con una composizione diversa degli stimolatori, l'adesione e molecole di costimolazione.
Dovrebbero essere prese alcune precauzioni durante l'Assemblea delle diapositive appiccicosi e lamelle per una formazione di successo doppio strato. In particolare, le lamelle devono essere completamente asciutte, come anche una piccola quantità di liquido lasciato sulla superficie del vetro potrebbe provocare fuoriuscite di liquido durante il bilayer procedura di lavaggio. Cosa importante, è essenziale anche per il coprioggetto associato ai bordi del contatto con l'anello esterno del forcipe forbice in polipropilene per evitare perdite (come descritto al punto 3.4.1). È inoltre importante evitare qualsiasi gorgogliare nelle porte di entrata dei canali. Se tutte le bolle di entrare in un canale, sono quasi impossibili da rimuovere e rovinare il bilayer nel canale. Allo stesso modo, è importante evitare qualsiasi pipettaggio veloce, poiché il flusso turbolento di liquido possono introdurre bolle nel canale e danneggiare il bilayer.
Un rilascio di granuli citolitiche viene rilevato dalla comparsa di CD107a all'interfaccia cellula T-doppio strato. Fab regioni di Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a anticorpi vengono aggiunti alle cellule T CD8 prima del caricamento sul bilayer. Microscopia TIRF sfrutta un'onda evanescente per illuminare l'area di circa 100 nm sopra il bilayer del volume definito come volume evanescente, che permette di aumentare la risoluzione verticale dell'imaging. Fabs anticorpo marcato, che si diffondono molto rapidamente all'interno del volume evanescente a 37 ° C, non generano un segnale fluorescente rilevabile. Durante la fusione della membrana dei lisosomi specializzati contenenti molecole litiche con la membrana cellulare, proteina di membrana di CD107a appare sul T cellule contatto con superficie in località distinte. Per la proteina di CD107s a quel tempo l'associazione con i Fab. Associata alla proteina CD107a, con etichetta fluorescente Fab(s) formare ammassi immobile che generano una brillante fluorescenza rilevabile da microscopia TIRF, indicativa del degranulation delle cellule T.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione R01AI118694 NIH di Michael R. Betts, che include Sub-premio 566950 a Yuri Sykulev. Ringraziamo la Sidney Kimmel Cancer Center bioimmagini ha condiviso risorsa per il loro sostegno eccellente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
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