Summary
Protokollet beskriver en teknik för att studera primära polyklonala mänskliga T cellernas förmåga att bilda synaptic gränssnitt använder planar lipid lipidmonolager. Vi använder denna teknik för att Visa differentiell synaps bildas förmåga mänskliga primära T-celler som härrör från lymfkörtlar och perifert blod.
Abstract
Aktuell kunskap om dynamiken och strukturella funktioner av T-cell synaptic gränssnitt har varit till stor del bestäms genom användning av glas-stödda planar lipidmonolager och in vitro--härledda T-cell kloner eller linjer1,2 ,3,4. Hur dessa fynd gäller för de primära mänskliga T cellerna isolerade från blod eller lymfoida vävnader är inte känd, delvis på grund av betydande svårigheter att få ett tillräckligt antal celler för analys5. Här kan vi bemöta detta genom utveckling av en teknik som utnyttjar flerkanaliga flöde diabilder för att bygga planar lipid lipidmonolager innehållande aktivering och vidhäftning molekyler. Den låga höjden flöde bilder främjar snabb cell sedimentering för att synkronisera cell: lipidens fastsättning, vilket innebär att forskare att studera dynamiken i synaptic gränssnitt bildandet och kinetik av granulat release. Vi tillämpar detta synsätt för att analysera synaptic gränssnittet för så få som 104 105 primära frysförvarade T celler isolerade från lymfkörtlar (LN) och perifert blod (PB). Resultaten visar att romanen planar lipid lipidens tekniken möjliggör studiet av biofysiska egenskaper av primära humant T-celler som härrör från blod och vävnader i samband med hälsa och sjukdom.
Introduction
Vetenskapliga kunskapen om strukturella drag hos T-cell immun synapser och deras koppling till den funktionella aktiviteten av T-celler har genererats främst från studien av cellinjer och kloner härledda från PB. Till vilken grad dessa fynd avser primära T-celler som erhållits från oklar blod eller mänskliga lymfoida vävnader, eftersom de synaptiska gränssnitt av T-celler som är bosatta i lymfoida och andra vävnader inte har analyserats hittills. Ännu viktigare, tyder framväxande data på att vävnaden boförälder och lymfoida organ-härledda T-celler kan ha betydande skillnader i deras fenotyp och funktionell aktivitet jämfört med dem i PB6,7. Detta stelnat ytterligare behovet av att bättre förstå funktionerna i T-cell synaptic gränssnittet i primära humant T-celler.
För detta ändamål har vi utvecklat en ny mini skala strategi att utnyttja lipid lipidmonolager inbyggt flerkanaligt flöde bilder gör det möjligt för oss att utföra avbildning av T-cell/lipidens gränssnitt med mindre än 105 primära T celler isolerade från mänskliga PB och LN. Denna nya teknik gör studien av primära humant T-cell synaptic gränssnitt för att bättre modell och förstå i vivo cell-cell interaktioner biofysiska egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Skriftligt informerat samtycke erhållits från alla deltagare, och prover av blod och lymfkörtel förvärvades med godkännande av den institutionella Review Board vid University of Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Alla försökspersoner var vuxna. Sladden blodprov var vänligen tillhandahållen av arbetskraft och leverans av avdelningen för obstetrik & gynekologi vid Thomas Jefferson University. Alla prover var avidentifierade.
1. isolering av CD4+ T-celler för en bildanalys
-
Tina en 1 mL alikvot innehållande 107 fryst perifera mononukleära blodceller (PBMC) eller lymfkörtel mononukleära celler (LNMCs) från insamlade prover. I en steril huva, tillsätt de upptinade cellerna till 9 mL RPMI kompletteras med penicillin/streptomycin och glutamin.
- Centrifugate cellerna för 10 min vid 300 x g vid 4 ° C, Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 mL kompletterade RPMI innehållande 10% FBS (komplett medium). Inkubera cellerna över natten i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Nästa dag, rena CD4+ T celler av negativa immunmagnetisk sortering använder en kommersiellt tillgänglig kit enligt tillverkarens anvisning.
- Att mäta antalet nyligen renat CD4+ T celler, blanda 5 µL cellsuspension med en lika stor volym av en trypan blå lösning. Läsa in en hemocytometer med en cell-trypan blå blandning och räkna de levande cellerna inuti de 5 delarna av hemocytometer.
- Ta medelvärdet av antalet cell och bestämma antalet celler i den ursprungliga cellsuspensionen: antalet celler/1 mL = den genomsnittliga count x 2 x 104. Om det totala antalet isolerade celler är för liten, använda cellerna som är utan att räkna.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 min och resuspendera dem i en analysbuffert (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glukos, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2och 1% humant serumalbumin) 105 < /C13 > celler/50 µL eller mindre och hålla cellerna vid 4 ° C (för 1 – 2 h) tills den ska användas i experiment.
- Kassera alla biologiskt avfall enligt relevanta anvisningar.
- Om så önskas som en kontroll cell population, förbereda aktiveras CD8 T-celler från navelsträngsblod PBMC, placera 107 celler i komplett medium i en T25 kultur kolv täckt med en blandning av antikroppar mot anti-CD3 och anti-CD28 på 10 µg/mL och 1 µg/mL 5 mL , respektive.
- Nästa dag, ta bort cellerna aktiverade navelsträngsblod från kolven, tvätta dem 1 x med färska slutföra medium och expandera cellerna i närvaro av rekombinant IL-2 (100 U/mL) i 2 veckor.
- Rena de navelsträngsblod CD8+ T celler av negativa immunmagnetisk sortering med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit enligt tillverkarens anvisning. Räkna cellerna och utbyta media att analysbuffert enligt beskrivningen i steg 1,3 – 1,6 för LN och PB CD8+ T celler.
2. komponenter för beredning av de Planar Lipid-lipidmonolager
- Förbered 3 slags liposomer som beskrivs på andra ställen5: a 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) liposomer, (b) 0,4 mM DOPC liposomer innehållande 33 mol % hundar-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic syra) succinyl] (ammoniumsalt)) lipider, (c) 0,4 mM DOPC liposomer innehållande 4 mol % Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotinyl) (natriumsalt)).
-
Bered 5% kasein som tidigare beskrivits5.
- Lös 5 g kaseinpulver i 100 mL ultrarent vatten och tillsätt 350 µL 10 M natriumhydroxid. Rör om allt på en vanlig magnetomrörare med en långsam hastighet enligt tillgängliga skala, i rumstemperatur i 2 h, och sedan under natten vid 4 ° C. Justera pH till 7.3 och ultracentrifugen lösningen för 2 h vid 100 000 x g vid 4 ° C. Filtrera supernatanten med 0,22 µm sterila filter och förvara lösningen i alikvoter vid-80 ° C.
FÖRSIKTIGHET: lösning av natriumhydroxid kan orsaka kemiska brännskador och kan framkalla permanent blindhet vid kontakt med ögonen. Använd gummihandskar, skyddskläder och skyddsglasögon vid hantering av denna kemikalie eller dess lösningar.
- Lös 5 g kaseinpulver i 100 mL ultrarent vatten och tillsätt 350 µL 10 M natriumhydroxid. Rör om allt på en vanlig magnetomrörare med en långsam hastighet enligt tillgängliga skala, i rumstemperatur i 2 h, och sedan under natten vid 4 ° C. Justera pH till 7.3 och ultracentrifugen lösningen för 2 h vid 100 000 x g vid 4 ° C. Filtrera supernatanten med 0,22 µm sterila filter och förvara lösningen i alikvoter vid-80 ° C.
-
Etiketten anti-CD3 antikropp med biotin att producera mono-bionylated antikropp molekyler med en tidigare beskrivna metod8.
- Bered en lösning av Biotin-PEO4-NHS i dimetyl sulfoxid (DMSO) 0,1 mg/ml. Tillsätt 3.7 µL av Biotin-PEO4-NHS lösningen 1 mg av antikropp i 0,5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innehållande 100 mM natriumbikarbonat.
- Inkubera blandningen för 2 h i rumstemperatur. Bered en Alexa Fluor 488 NHS Ester på 10 mg/mL i DMSO. Lägga till Alexa Fluor 488 NHS ester lösningen till antikroppen märkt av Biotin-PEO4-NHS på en 10-faldig molar överskott.
- Inkubera blandningen för 1 h i rumstemperatur under långsam omrörning på en vanlig magnetomrörare. Separata obundna färgämnet använder storlek-utslagning kromatografi.
- Bestämma koncentrationen genom att mäta den optiska densiteten av antikropp lösningen vid 280 nm (en280). Mät den optiska densiteten av märkt antikroppar på 577 nm (en577).
- Fastställa dye-till-antikropp förhållandet med hjälp av följande ekvation:
Obs: Hitta ytterligare detaljer i tillverkarens protokollet.
-
Uttrycka en rekombinant lösligt ICAM-1 protein i en Drosophila uttryck systemet som tidigare beskrivits3,4,9,10.
- Klon, med cDNA kodning, ectodomain av ICAM-1 till Drosophila uttryck vektor pMT/V5-hans med en inducerbara metallotionein arrangören att producera ett rekombinant protein bifogade med ett hans6 tag i C-terminala änden.
- Samtidig transfect S2 celler med den resulterande ICAM-1 innehållande plasmiden och en G418 uttryck vektor. Välj stabil transfectants med hjälp av Schneiders Drosophila Media kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS) och 0,5 mg/mL G418 i 3 veckor. Expandera cellerna i serumfritt insekt medium och framkalla en proteinuttryck med 0,5 mM CuSO4 för 3 d.
- Koncentrera sig på kultur supernatant 10 x och dialyze mot PBS via en tangentiell flöde koncentrator som tidigare beskrivits11.
- Applicera koncentrerad kulturen supernatanten till en kolumn som innehåller Sepharose med antikropp kovalent immobiliserade anti-ICAM-1 och eluera den bundna ICAM-1 med en 50 mM glycin buffert, pH 3,0. Omedelbart neutralisera proteinet eluerade ICAM-1 med en 2 M Tris buffert, pH 8,0.
- Dialyze eluerade materialet mot PBS, pH 8,0 och lägga till det dialyzed materialet i en kolumn som innehåller Ni-NTA agaros. Eluera lösliga ICAM-1 med 200 mM Imidazol, pH 8,0. Dialyze eluerade materialet mot en PBS-bufferten, pH 8,0.
- Märk den rena ICAM-1 med Cy5 NHS ester enligt tillverkarens anvisning.
Obs: Bästa slutliga dye-till-protein förhållandet är 1:1.
- Producera Fab fragment från en anti-CD107a antikropp av papain matsmältning och rena Fab fragment genom jonbyteskromatografi som beskrivs tidigare3. Etiketten Fab fragment med Alexa Fluor 568 NHS ester enligt tillverkarens anvisning.
3. bildandet av glas-stödda Planar Lipid lipidmonolager
- Bered en färsk sura piranha genom att blanda 140 mL koncentrerad svavelsyra och 60 mL 30% väteperoxid. Tvätta glas coverslips för flöde bilderna genom att blötlägga dem i syra piranha lösningen för 30 min. Håll täckglaset med polypropylen scissor-typ pincett.
Varning: Piranha lösningen är ett extremt starka oxidationsmedel. Kom ihåg att Använd skyddsglasögon eller skyddsglasögon eller en heltäckande ansiktsskydd sköld tillsammans med tjocka gummihandskar vid alla tidpunkter under hantering av lösningen. Fungera endast med piranha lösning under ett dragskåp. Undvik värme, transportera eller skaka den när som helst under användning, eftersom det kan explodera. Samla in piranha avfallet i en glasflaska med en bly-innehållande hål. Kontakta utskottet för institutionella säkerhet om korrekt avfall utnyttjande. -
Skölj den tvättade coverslips 7 x med ultrarent vatten genom att överföra dem sekventiellt i bägare som innehåller färskt vatten. Ställ in de våta coverslips undan att låta de återstående vatten rullar av den rena glas, lämnar det torra glaset bakom.
- Alternativt använda en pipettspetsen bifogas en vakuumpump för att försiktigt återstående vattendropparna från coverslips.
- I steril huven, utföra utspädningar av olika lipider att producera Liposom mixen för att göra lipidmonolager. Först, kombinera 37 µL DOPC liposomer och 3 µL av Biotinyl-Cap-PE liposomer. För det andra, blanda 14 µL DOPC liposomer och 15 µL av hundar-NTA liposomer. Tredje, lägga till 1 µL av den första mix till 29 µL av den andra mix att fabricera slutliga Liposom blandningen.
-
I steril huven, konfigurera en arbetsyta med torr coverslips i närheten. Alikvotens 2 µL av slutliga Liposom blandningen (se steg 3.3) just i mitten av en självhäftande glida kanal. Omedelbart och mycket exakt rikta in ett rent och torrt täckglas med bilden och försiktigt ned täckglaset på den klibbiga sidan av bilden.
- Om förbereder mer än en bild, arbeta på en bild i taget eftersom Liposom blandningen avdunstar snabbt. Vänd på bilden och Använd den yttre ringen av polypropylen scissor-typ tången en mild tryck till perifera kontakt av täckglaset med i bilden, och kontrollera att slip är ordentligt anslutet till bilden för att hindra läckage.
Obs: Tryck inte mot kanalerna i bilden att undvika att bryta eller sprickbildning på täckglas. - Vänd bilden igen och markera positionen för den bildade lipidens, som ser ut som en droppe mellan täckglaset och kanal bilden av ritning 4 prickar med en permanent spritpenna runt lipidens på extern bild sida av församlingen.
- Om förbereder mer än en bild, arbeta på en bild i taget eftersom Liposom blandningen avdunstar snabbt. Vänd på bilden och Använd den yttre ringen av polypropylen scissor-typ tången en mild tryck till perifera kontakt av täckglaset med i bilden, och kontrollera att slip är ordentligt anslutet till bilden för att hindra läckage.
- Före den första injektionen av en vätska i kanalen, utse en port av kanalen som införselplats och den andra som Utförselplats och upprätthålla denna beteckning i hela experimentet.
- För att undvika bildar bubblor, infoga slutet av Pipettera spetsen direkt i posten porten av kanalen. Sakta fyller kanalerna för bilden med 50 µL av varm (minst rumstemperatur) analysbuffert (se steg 1,5 för buffert sammansättning).
- Förbered en lösning av 0,5 M nickel(II). Tina en 2 mL alikvot av kasein lösning i ett vattenbad vid 37 ° C i 30 min och komplettera den med en lösning av nickel med en slutlig koncentration på 200 µM.
- Tvätta lipidmonolager genom först Injicera 100 µL av kasein lösningen i posten porten av kanalen och sedan omedelbart ta bort 100 µL av utförselplats på bilden av pipettering. Blockera lipidmonolager med samma lösning genom att injicera 100 µL av kasein lösningen i införselplats för varje kanal och ruvar i bilden för 45 min i rumstemperatur.
- Tina alikvoter av Cy5-ICAM-1-hans6 och streptividin proteiner. Kombinera proteiner i analysbuffert på 2 µg/mL varje slutliga koncentration. Centrifugera lösningen för 30 min vid 20 000 x g och 4 ° C att ta bort alla aggregat.
- Ta bort resten av blockerande lösningen från klotets glida kanal genom pipettering. Injicera 100 µL av lösningen innehållande ICAM-1 och streptividin i posten porten.
- Inkubera i bilden för 45 min i rumstemperatur. Ta bort eventuellt överskott av protein lösningen från Utförselplats. Tvätta lipidens 2 x genom först Injicera 100 µL analysbuffert i posten porten av kanalen och sedan omedelbart ta bort 100 µL av Utförselplats.
- Späd en Alexa-Fluor-488-märkt anti-CD3 antikropp med Analysbuffert till en slutlig koncentration på 2 µg/mL. Injicera 100 µL av antikropp lösningen i posten porten av bilden och inkubera det i 45 min i rumstemperatur. Ta bort eventuellt överskott av protein lösningen från Utförselplats. Tvätta lipidens 2 x med 100 µL analysbuffert som i steg 3.11.
4. avbildning av T celler interaktionen med den Planar lipidens
-
Förvärma scenen och syftet med confocal eller totala inre reflektion fluorescens (Frida) Mikroskop tills temperaturen är utjämnad vid 37 ° C. Ställa in bilden med bilayer(s) på uppvärmd scenen. Flytta scenen till en lämplig position enligt markeringarna bläck och fokusera på den lipidens anställa fluorescens av Cy-märkt ICAM-1 molekyler.
- Använd ett 61 X-objektiv för mikroskopet confocal eller ett 100 X-objektiv för Frida mikroskopet, med lämpliga filterinställningar.
-
För granule släppa imaging av Frida mikroskopi, lägga till Alexa-Fluor-568-märkt anti-CD107a antikropp Fab fragment att cellsuspensionen med en slutlig koncentration på 4 µg/mL innan du injicerar cellerna till posten portar.
- Återsuspendera den beredda CD4+ T celler isolerade från LN eller PB eller sladd blod och injicera införselplats glida kanal som innehåller lipidens 50 µL cellsuspension.
- Välj det önska antalet fält och spela in bilder i varje fält 1 x varje 2 min för 30 min efter injektionen.
- Utnyttja ljusa fält, reflekterat ljus och fluorescerande kanaler (Alexa 488 och Cy5) av confocal Mikroskop till förvärva bilderna. Använd Frida läget för Alexa-Fluor-488 och Alexa-Fluor-568 fluorescens och widefield för Cy5 fluorescens, samt ljusa-området imaging, på Frida mikroskopet.
5. bildanalys
- Analysera förvärvade bilderna med lämplig programvara. Iaktta cellmorfologi i överförda ljusa bilder och Uteslut klustrade och synbart skadad eller apoptotiska celler från analysen. Inkludera i analysen endast i de celler som produktivt samverkar med lipidens ytan (dvs, celler ansamlas Alexa-Fluor-488 fluorescens (anti-CD3 antikroppar) i gränssnittet).
- Bestämma storleken på området cell adhesion på 20 min efter inledningen av cell-lipidens interaktionen.
Obs: Området vidhäftning är det mörka området utvecklats på cell-lipidens gränssnittet på störningar speglar mikroskopi (IRM) bilder. - Observera någon ansamling av Cy5-ICAM-1 fluorescens och ett bildande av ring korsningen av segregerade Cy-ICAM-1 molekyler i cellen-lipidens gränssnittet. Om ackumulerade ICAM-1 molekyler bildas en vidhäftning ring föreningspunkt på minst två på varandra följande bilder, utse sådana celler som celler utvecklar en perifer supramolekylär aktiverande kluster (pSMAC)12.
- Utvärdera den granule utgåvan genom att mäta Alexa-Fluor-568 fluorescensintensiteten på gränssnittet T cell-lipidens över bakgrunden fluorescensen utanför kontaktytan i nära närhet till cellen. Utse celler med ett ratio på Alexa-Fluor-568 signal till bakgrunden minst 1,3 degranulating celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Först, Vi jämförde struktur gränssnittet synaptic bildas av aktiverade sladd-blod-härledda CD8+ T celler utsätts för lipid lipidmonolager byggd antingen i traditionella storskaliga flöde cellsystem (se Tabell av material för detaljer)1 ,2,3,4 eller i flerkanaligt flöde diabilder. Lipidmonolager innehöll lysrör-märkt anti-CD3 och ICAM-1 vid 50 molekyler/µm2 och 300 molekyler/µm2, respektive. CD8+ T celler från mänskliga navelsträngsblod aktiverades av en stimulering med plattan-bundna anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar13,14. Det fanns ingen skillnad mellan CD8+ T celler som bildade klassiskt immunologiska synapser på de lipid lipidmonolager byggdes antingen cellen flöde eller flerkanaliga flöde bilden (figur 1). Alla andra experiment utfördes med lipid lipidmonolager gjort i de flerkanaliga flöde-bilderna.
Därefter undersökte vi möjligheten för PB - och LN-härledda mänskliga CD4+ T cellerna att bilda synaptic gränssnitt med de planar lipid-lipidmonolager och släppa granulat. Vi utnyttjade Frida mikroskopi för att maximera den vertikal upplösningen på T-cell-lipidens gränssnittet att visualiseras degranulating celler och utvärdera kineticsen av granule utgivningen. Vi observerade 4 grupper av celler för båda de LN - och PBMC-härledda CD4+ T celler: vissa T-celler etablerade mogen immun synapser, men antingen gjorde eller inte släppa granulat, andra T-celler släppt granulerna utan ett bildande av mogen synapser, och fortfarande andra T-celler bildas synapser varken släppt den granulat (figur 2)7. Skillnaden mellan LN - och PBMC-härledda CD4+ T celler blev uppenbart när kineticsen av granule utgivningen utvärderades. PBMC-derived CD4+ T celler kunde börja släppa granulat nästan dubbelt så snabbt som LN-derived CD4+ celler (figur 3)7. Sammantaget data visar att trots en heterogenitet av LN - och PBMC-härledda CD4+ T celler, den senare innehöll en bråkdel av T celler kan snabba degranulering.
Figur 1: jämförelse av bild flödessystem och konventionella flöde kammare. (A) denna panel visar flerkanaliga flödet Skjut så att en församling av 6 glas-stödda planar lipid lipidmonolager. Varje lipidens är ansluten till leverans och exit hamnarna. Mindre än 1 x 105 celler räcker för analys. (B) denna panel visar den konventionella flödessystem för kammaren tillåter en församling av 1 glas-stödda planar lipid lipidens. 2 x 106 celler krävs för analysen. De andra panelerna visar (C och D) representant Frida mikroskopi och (E och F) confocal med störningar speglar mikroskopi (IRM) bilder av gränssnittet utvecklats av aktiverat sladd-blod-härledda CD8 T-celler. Cellerna var utsatta för en lipid lipidens innehållande ICAM-1 (300 molekyler/µm2) och anti-CD3 antikroppar (50 molekyler/µm2) förvärvade (C och E) i flödet diabilder eller (D och F) i en konventionell flödessystem under liknande förhållanden. Frida microscopyen och confocal med IRM tas bilder med 100 X och 60 X förstoring mål, respektive. Procent av T-cellerna att bilda mogna synapser på de lipidmonolager som byggdes antingen flöde bild eller konventionella flöde kammare var mycket liknande men varierar mellan experiment från 75% till 90%. I alla bilder visas Cy-5-märkt ICAM-1 molekyler i blått; Alexa-Fluor-488-märkt anti-CD3 antikroppar visas i grönt; Alexa-Fluor-568-märkt anti-CD107a antikroppar bundna till CD107a visas i rött; IRM bilder visas i cyan; och skala barerna är 10 µm i längd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Struktur av en T-cell – lipidens gränssnitt och mönstret av degranulering av lymfkörtel och perifera blod mononukleära CD4+ T celler. LNMC - eller PBMC-härledda celler sorterades till separata CD4 celler+ T som utsattes för de lipidmonolager som innehåller 50 molekyler/µm2 av anti-CD3 antikroppar och 300 molekyler/µm2 av ICAM-1 protein. Gränssnittet mellan cellerna och lipidmonolager fotograferades av Frida mikroskopi. Skala barerna är 5 µm. (A) dessa representativa bilder av en T-cell - lipidens gränssnittet visar strukturen av T-cell – lipidens gränssnitt och degranulering mönster. (B) dessa diagram visar en representation av LNMC - och PBMC-härledda CD4+ T celler med en annan struktur på synaptic gränssnitt och mönster av granule release. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dynamiska förändringar av strukturen i en T-cell – lipidens gränssnitt och kineticsen av en degranulering av lymfkörtel och perifera blod mononukleära CD4+ T celler. (A) denna panel visar tidsberoende förändringar av en T-cell – lipidens gränssnitt och utseendet på utgivna granulat. Skala barerna är 5 µm. (B) denna panel visar en kvantifiering av kineticsen av en granule release av LN-derived CD4+ T celler (slutna cirklar) och PBMC-derived CD4+ T celler (öppna cirklar). Varje enskild cirkel anger tidpunkten för det första utseendemässigt av en detekterbar granule release av enskilda celler. Den median och IQR (interkvartilintervall) visas för alla spridningsdiagram. Mann-Whitney test utfördes för att jämföra skillnaderna mellan de angivna grupperna av T-celler. P < 0,05, ** P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nya teknik som beskrivs här använder liknande reagenser som krävs för att bygga planar lipidmonolager i konventionella flöde cell5 och framgångsrikt kan användas för att utföra avbildning av primära human T cell – lipidens gränssnitt3,4 ,15. Tekniken erbjuder en betydande minskning i den fluorescerande molekyler användningen och kräver 10 – 20 x färre T-celler jämfört med en flöde cell system5, skapa möjlighet att analysera primära humant T-celler från blod och andra vävnader.
Antalet injicerade cellerna som används i denna studie tillät oss att bild ca 50 celler per imaging fältet med ett 60 X-objektiv. En större koncentration resulterade i cell aggregering, minska antalet celler som är lämplig för analys. Vi kan ytterligare minska antalet injicerade cellerna 10 – 50 x, men den nedre gränsen för antalet cell beror på cell heterogenitet, antalet imaging fält och på experimentell design. Vissa utredare har tidigare använt lipidmonolager byggdes en öppen kammare med glas botten som krävs ett liknande antal celler för analys16. Det slutna systemet som beskrivs här, med en kanal höjd 0,1 - 0,4 mm, tillåter dock för snabb cell sedimentering att synkronisera cell fastsättning och analys av T-cell svar utan risk för vätskeavdunstning. Det klibbiga slide-systemet ytterligare tillåter bildandet av upp till tre lipidmonolager per kanal. Således kan samma cell prov användas för analys av cell beteende på olika lipidmonolager med en annan sammansättning av stimulerande, vidhäftning och costimulatory molekyler.
Vissa försiktighetsåtgärder bör tas under montering av klibbiga bilder och coverslips för en framgångsrik lipidens formation. Särskilt coverslips bör vara helt torrt, så även en liten mängd vätska kvar på glasytan kan resultera i läckage under de lipidens tvätt förfarande. Ännu viktigare, är det viktigt att även det bifogade täckglaset vid kanterna av kontakten med den yttre ringen av polypropylen scissor-typ pincett att undvika läckage (enligt beskrivningen i steg 3.4.1). Det är också viktigt att undvika någon bubblande i posten hamnar i kanalerna. Om eventuella bubblor anger en kanal, är de nästan omöjliga att avlägsna och förstöra lipidens i kanalen. Likaså är det viktigt att undvika någon snabb pipettering, eftersom den turbulent flöden av vätska kan införa bubblor i kanalen och skada lipidens.
En release cytolytisk granulat upptäcks genom uppkomsten av CD107a på T-cell-lipidens gränssnittet. Fab regioner av Alexa-Fluor-568-märkt anti-CD107a antikroppar tillsätts CD8 T-celler före lastning på lipidmonolager. Frida mikroskopi utnyttjar en flyktig våg för att belysa området ca 100 nm ovanför lipidens i volym definieras som flyktig volym, gör det möjligt för att öka vertikala upplösningen av imaging. Märkt antikropp Folkesson, som diffus mycket snabbt inom flyktig volym vid 37 ° C, inte generera en detekterbar fluorescerande signal. Under membranet fusion av specialiserade lysosomer som innehåller lytisk molekyler med cellmembranet, CD107a membranprotein visas på T kontaktytan celler på skilda platser. Folkesson få bunden till det CD107s proteinet då. Lysrör-märkt Fab(s) bifogas det CD107a proteinet, och bildar orörlig kluster som genererar en ljusa fluorescens kan upptäckas genom Frida mikroskopi, vägledande av T-cell degranulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01AI118694 NIH bidraget till Michael R. Betts, vilket inkluderar sub award 566950 till Yuri Sykulev. Vi tackar Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging delade resursen för deras utmärkta stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
