Summary
Hier presenteren we een protocol voor een ex vivo long kanker model dat bootst de stappen van de progressie van de tumor en helpt bij het isoleren van een primaire tumor, circulerende tumorcellen, en metastatische laesies.
Abstract
Het is moeilijk om te isoleren van de tumorcellen op verschillende tijdstippen van de progressie van de tumor. Wij een ex vivo Long model dat de interactie van tumorcellen met een natuurlijke matrix en de voortdurende stroom van voedingsstoffen kan tonen, evenals een model waarin de interactie van tumorcellen met normale cellulaire componenten en een natuurlijke matrix hebt gemaakt. De Long Acellulair ex vivo model wordt gemaakt door het isoleren van een rat hart-Long blok en het verwijderen van alle cellen met behulp van het decellularization-proces. Het recht belangrijkste bronchiën is afgebonden en tumorcellen worden geplaatst in de luchtpijp door een spuit. De cellen verplaatsen en vullen van de linker long. De Long wordt dan geplaatst in een bioreactor waar de longslagader een voortdurende stroom van media in een gesloten circuit ontvangt. De tumor gegroeid op de linker long is de primaire tumor. De tumorcellen die zijn geïsoleerd in de circulerende media zijn circulerende tumorcellen en de tumorcellen in de juiste Long zijn metastatische laesies. De cellulaire ex vivo Long model wordt gemaakt door het overslaan van het decellularization-proces. Elk model kan worden gebruikt om verschillende onderzoeksvragen te beantwoorden.
Introduction
Uitzaaiing van kanker is de beklaagde achter de meeste kanker sterfgevallen en de ultieme uitdaging in de poging om kanker te bestrijden. Het algemene doel van deze methode is het ontwerpen van een protocol voor een vier-dimensionale (4-D) van de celcultuur die een dimensie van flow, naast de drie-dimensionale (3-D) celgroei heeft. Het vertegenwoordigt de drie fasen van het proces van de metastase [dat wil zeggen, de primaire tumor, circulerende tumorcellen (CTCs), en metastatische laesies].
In de afgelopen drie decennia leverde wetenschappers over de hele wereld een ongeëvenaarde rijkdom aan informatie om te begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de metastatische progressie in verschillende vormen van kanker die het vooruitzicht van een genezen of progressie-vrije overleving verbeterd. De klinische behandeling van bepaalde kankers, zoals borstkanker, verbeterd aanzienlijk1; echter, sommige kankers, zoals longkanker, nog een arme overleving2. In vitro en in vivo diermodellen geweest instrumentaal bij het genereren van nieuwe inzichten in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de ziekte. In de afgelopen jaren, cel lijn afkomstige xenografts (CDX) en patiënt afkomstige xenografts (PDX) geweest van meer belang als zij veel relevante functies van de primaire tumor van menselijk3, zoals groei kinetiek, histologisch functies, gedrags behouden kenmerken, en de respons op therapie. Elk model heeft echter zijn beperkingen te begrijpen van het mechanisme van CTC vorming en uitzaaiing naar een verre orgel4,5,6.
Onlangs, we een 4-D ex vivo -model van het long-kanker ontwikkeld door gebruik te maken van het concept van orgel reengineering en perfusie gebaseerde celkweek. Het bootst de menselijke long kanker groei door de vorming van perfusable tumor knobbeltjes die in de tijd met een soortgelijke mens kanker groeien-uitgescheiden eiwitten productie7. Het vertegenwoordigt de gen expressie handtekening die voorspelt arme overleving bij patiënten met kanker en toont ook een therapeutische respons door tumor regressie op cisplatine behandeling8,9. Het Long-model is verder bewerkt zodat het metastatische laesies kan vormen. De CTCs groeien van een primaire tumor en intravasate tot de therapieën en extravasate in de contralaterale Long metastatische laesies10vormen. Gen expressie studies suggereren een afzonderlijke expressie-profiel van de primaire tumor, de CTCs, en de metastatische laesies en de opregulatie van de subset van genen die nodig zijn voor het fenotype10. Dit metastatische proces optreedt als gevolg van de aanwezigheid van biologische omstandigheden gezien bij patiënten met kanker. Het voordeel van dit model is de aanwezigheid van een natuurlijke matrix en het platform, en een perfusie van voedingsstoffen die tot de vorming van tumor knobbeltjes leidt. Daarnaast biedt het ook de mogelijkheid aan het bestuderen van de effecten van verschillende componenten van de communicatie van de tumor of drugs op tumor progressie na verloop van tijd. Dit model kan worden gebruikt om te groeien van een cellenbereik kanker (longkanker, borstkanker, Sarcoom enz.) in een laboratorium-opstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protocollen voor dierproeven werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Houston Methodist Research Institute en overeenkomstig alle voorschriften, wetten, richtlijnen en beleid.
1. rat Lung oogst
- Anesthetize een 4 - tot 6-week-oude mannelijke Sprague-Dawley ratten door een intraperitoneale injectie (IP) van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) in de flank. Anesthesie zorgen door te controleren voor een gebrek aan beweging, wanneer de hind-limb teen is geknepen met een tang.
- Na 10 min, scheren van de borst en de buik en veeg de huid met een doekje chloorhexidine.
- Verwijder de huid door het oppakken van met een tang en door gebeuren het met een disposable scalpel. Na het openen van de borstholte gebeuren met scalpel door te snijden, voeren een bilaterale Thoracotomie door het snijden van de voorste van de ribbenkast aan de linkerkant en de rechterkant van het middenrif met een schaar.
Opmerking: Dit is een niet-survival-operatie. - De ribbenkast omhoog houden en injecteren van 2 mL van heparine (1.000 eenheden/mL) in het rechterventrikel van het kloppend hart met behulp van een naald 27 G.
Opmerking: Dit zal verhinderen de vorming van bloedstolsels in de longen. - Volledig verwijderen van de ribbenkast met een schaar en een naald 18 G in het linkerventrikel plaatsen als een vent, totdat het bloed komt. Vervolgens 15 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing EDTA (12,5 eenheden/mL; EDTA PBS) te injecteren in het rechterventrikel met behulp van een naald van 25 G.
- Snijd de minderwaardig en superieure vena cava, twee grote aderen op de rechterkant van het hart, en spoelen van de longen met een extra 10 mL van de EDTA PBS in de rechter ventrikel met behulp van een naald 27 G.
Opmerking: De vena cava inferior is gevisualiseerd onder de bodem van het hart als een groot vat gevuld met rood bloed. Ook is de superieure vena cava gevisualiseerd in het bovenste gedeelte van het hart als een groot schip. - Snijd de luchtpijp aan de voet van de schildklier. Verwijder voorzichtig de aflopende aorta op het niveau van de hemiazygos ader en de takken van de aorta in de boog.
- Haal het hart-longen-blok van de borstholte en de rest van het lichaam van de rat.
- Uitvoeren van ventriculotomy door het snijden van de helft van de rechter en linker ventrikels en plaats een op maat gemaakte ingevulde 18 G roestvrij stalen naald canule via de rechterventrikel in de belangrijkste longslagader (PA).
- De canule met een 2-0 zijden stropdas veilig en zorgvuldig blootstellen het rechterventrikel en atrium.
- Plaats een vrouwelijke Luer schot in het linkerventrikel en veilig met een 2-0 zijden stropdas.
- Spoel het hart-Long blok met 20 mL van de EDTA PBS via de canule PA en plaatst u deze in een tube van 50 mL bevattende voedingsbodems of PBS EDTA.
Opmerking: Voor een cellulaire model, ga naar stap 3.1 de bioreactor instellen. Voor een Acellulair model, gaat u verder met stap 2.1 voor de decellularization.
2. Long Decellularization
-
Voorbereiding van de decellularization-eenheid
- Bereiden elke decellularization kamer/fles door piercing twee gaten in de fles dop en een vrouwelijke Luer breuk in de gaten (figuur 1A en 1B). Veilig met een zwart nylon ring aan de andere kant. Evenzo, boor een één gat in een andere fles dop voor de intraveneuze instellen bevestiging (Figuur 1 c).
Opmerking: Figuur 1A en 1B zijn van de dezelfde kroonkurken van twee verschillende kanten. Figuur 1 c is van een verschillende dop met een enkel gat zoals hierboven vermeld in stap 2.1.1. - Een 0,5-inch buis (aan de longslagader of PA einde) en 6-inch buizen (figuur 1J) koppelen aan een vrouwelijke Luer uit binnen de doppen (figuur 1A en 1B) en bevestig een mannelijke Luer-lock aan de uiteinden. Stel het slot met een 500 mL fles als de decellularization kamer/fles.
- Sluit het ene uiteinde van twee buizen van 2 ft (die zijn verbonden met een mannelijke Luer-lock) aan beide uiteinden van de pomp-buis (Figuur 1 H), die is gekoppeld aan het hoofd van de pomp (figuur 1E en 1F) door een patroon (figuur 1G) met een vrouwelijke Luer vergrendelen (figuur 1I).
- Sluit de andere uiteinden van de 2 ft buizen (uit stap 2.1.3) elke aan een vrouwelijke Luer lock hoofd op de decellularization kamer/fles dop (Figuur 1 L).
- Instellen van een 250 mL EDTA PBS fles (met 200 mL PBS) door ophanging van een omgekeerde fles op een stand met het proximale einde van een intraveneuze set (Figuur 1 d) ingevoegd in de fles dop en het distale uiteinde ter vervanging van de 2 ft buis verbonden met de decellularization-c Hamber/fles PA eind (figuur 1B). Deze buis 2 ft verbinden met de fles negeren.
Opmerking: De flessen worden ingesteld in karton, zoals aangegeven in Figuur 1 K. De intraveneuze buizen komen uit de hangende flessen af te zien van reagentia in de Long-steiger.
- Bereiden elke decellularization kamer/fles door piercing twee gaten in de fles dop en een vrouwelijke Luer breuk in de gaten (figuur 1A en 1B). Veilig met een zwart nylon ring aan de andere kant. Evenzo, boor een één gat in een andere fles dop voor de intraveneuze instellen bevestiging (Figuur 1 c).
-
Long decellularization proces
- De heparinized PBS uitgevoerd bij een druk van de fysiologische perfusie van 30 mm Hg (Figuur 1 K) totdat het stroomt vrij in de decellularization kamer/fles en koppelt vervolgens, het hart-longen-blok aan het einde van de PA via de canule PA.
- Houd lopend de pomp voortdurend, zodat alle overtollige bufferoplossing binnen de decellularization kamer/fles wordt weggegooid.
- De heparinized PBS doorlopen de PA gedurende 15 minuten bij een druk van de perfusie van 30 mm Hg voor de eerste wasbeurt (Figuur 1 K).
- Vervang de heparinized PBS fles met 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) in gedeïoniseerd water en perfuse van de Long voor 2 h voor de decellularization.
- Perfuse na de decellularization, gedeïoniseerd gesteriliseerde met autoclaaf water via de longen steiger voor 15 min.
- Vervolgens, perfuse 1% niet-ionogene wasmiddel in gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.
- Vervang de decellularization kamer/fles met 500 mL gesteriliseerde met autoclaaf PBS aangevuld met 1 x antibiotica (penicilline-streptomycine Amfotericine), de Long opknoping met het GLB intact te houden in de fles.
- Gooi de intraveneuze ingesteld, zet de 2 ft-buis gekoppeld aan de teruggooi container terug naar de longslagader einde van de decellularization kamer, en draaien van de pomp op 6 mL/min (Figuur 1 L).
- Perfuse van de longen voor 72 h en blijven veranderen de PBS met antibiotica elke 12 h.
Opmerking: De Acellulair Long is klaar voor direct gebruik. Het kan worden achtergelaten bij-80 ˚C totdat het nodig is. Als roze vlekken of bloedstolsels kunnen duidelijk worden gevisualiseerd in de lobben van de Long, gooi de Long. Het is mogelijk om willekeurig test voor DNA of histopathologisch onderzoek. Een volledige Acellulair Long zal niet tonen cellen en 99,9% van het DNA zal worden afgewassen.
Opmerking: Wanneer u werkt met een cellulaire Long-model, slaat u de decellularization. De geoogste Long (stap 1) kan direct worden ingesteld in de bioreactor.
3. bioreactor Set-up
- Bereiden de bioreactor fles en vereiste artikelen voor de set-up.
- Drie boorgaten in een 500 mL fles dop op een gelijke afstand en monteren van een vrouwelijke Luer in alle drie gaten, met behulp van zwarte nylon ringen (figuur 2A en 2B).
Opmerking: In twee gaten, de Luer-lock eindigt gezicht buiten, terwijl één uiteinde moet opnemen tegen de binnenkant van de fles. - Snijd een 6 in pomp buis, een 2 in buis, een 6 in de buis, een 1.5 ft buis, een buis 2 ft, en 10 ft oxygenator per bioreactor.
- Knip een naald 18 G roestvrij staal en, nogmaals, Verbind de einden met biocompatibel buizen voor een tracheale canule.
- Wikkel de oxygenator buis, met Luer lock-connectors aan de uiteinden, op een solenoïde gaas met autoclaaf tapes (figuur 2C).
- Autoclaaf de bovengenoemde items en bewaar ze op UV licht voor 10 min.
- Drie boorgaten in een 500 mL fles dop op een gelijke afstand en monteren van een vrouwelijke Luer in alle drie gaten, met behulp van zwarte nylon ringen (figuur 2A en 2B).
- De pomp binnen de reguliere cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) instellen met de juiste afstand tussen de platen gemakkelijk aan een fles van 500 mL.
- 70% ethanol spray op de cartridge pomp en de pomp buis verbindt met vrouwelijke Luer lock connectoren aan beide uiteinden aan de pomp.
- De oxygenator gewikkeld rond de solenoïde gaas binnen de cel cultuur incubator door het ene uiteinde (de uitstroom) van de oxygenator verbinden met de buis van de pomp en het andere uiteinde met de 1.5 ft buis in de bioreactor instellen.
- Stel de bioreactor fles in een bioveiligheid kast met aseptische condities.
- Hechten van een 3-weg afsluiter (geel) aan het hoofd van een van de vrouwelijke Luers om de stroom door de PA.
- Een one-way afsluiter (blauw) verbinden met een andere vrouwelijke Luer lock schot voor cel zaaien via de luchtpijp (figuur 2F).
- Verbinding 2 in buis aan de buitenkant (wit) en 6 in de buis aan de binnenkant van de fles te laten circuleren van de media uit. Past een mannelijke Luer-lock aan een buis 2 ft en hechten een vrouwelijke Luer lug stijl Tee om toegankelijkheid als wilt toevoegen of verwijderen om het even wat.
- Sluit een one-way afsluiter aan op een van de openingen van de drie-weg-connector (vrouwelijke Luer lug stijl Tee).
- Een mannelijke Luer-lock en een vrouwelijke Luer-lock aan 2 ft buizen te koppelen.
- Voeg 200 mL RPMI1640 met 10% FBS en 1% antibiotica cel kweekmedium (varieert per cel vereiste) en de bioreactor overbrengen in de incubator. Sluit de oxygenator buis aan de twee open uiteinden (one-way afsluiter en Tee-connector) om er een kringloopsysteem bioreactor.
- Vooraf de pomp worden uitgevoerd op 6 mL/min binnen de cel cultuur incubator met cel voedingsbodems te vullen de oxygenator en buizen, zodat er geen luchtbellen in de slangen bestaan.
- Zodra de buizen zijn gevuld met media, sluit de afsluiter en de bioreactor fles uit de incubator verwijderen door het loskoppelen van de oxygenators van beide uiteinden van de bioreactor fles.
- Zet de bioreactor fles in het biosafety kabinet, doorgeven van cultuur media via de afsluiter en de canule PA van de Long-steiger (Acellulair of met celstructuur) hechten aan de afsluiter door de mannelijke Luer-connector.
Nota: Hier is het mogelijk om te gebruiken het Acellulair model (naar aanleiding van het decellularization-proces) of een vers geoogste hart-longen-blok (dat wil zeggen, de cellulaire model, als het behoudt de oorspronkelijke rat cellen). - Het doorgeven van cultuur media via een one-way afsluiter te verwijderen alle lucht en koppelen van de trachea canule door een zijden draad naar de luchtpijp.
- Zorg ervoor om een torsie van de PA en de luchtpijp te voorkomen. Dicht de bioreactor fles dop met de Long steigerwerk binnen en, nogmaals, aseptisch de bioreactor overbrengen in de incubator en start de pomp bij een snelheid van 6 mL/min.
- Uitvoeren van voedingsbodems voor 10-15 min moet ervoor zorgen alle lobben krijgen opgeblazen en de Long ziet er in goede vorm (Figuur 2 g).
4. metastase Model en cel zaaien
Opmerking: Ga naar cel zaaien met het bovenstaande Long model voor een primaire tumor groei studie. Het wijzigen van de Long-steiger (Acellulair of met celstructuur) als volgt voor de metastatische model.
- Neem uit de bioreactor met de steiger van de longen uit de incubator en zet het in de bioveiligheid kabinet.
- Gebruik een Luer lock spuit doorgeven van 5 mL cultuur media via de luchtpijp en het GLB bioreactor openen met de opknoping Long steiger (figuur 2F).
- Bij deze stap is één meer persoon vereist om te helpen bij de wijziging van de longen bij een metastatische model.
- Zijde 2-0 klaar en hoekige pincet gebruik te maken van een pass through-de luchtpijp op de bifurcatie punt te krijgen.
- Bind de luchtpijp naar de juiste Long op het punt van de bifurcatie en controleren van de vrije stroom van media via de luchtpijp naar de linker long door het passeren van de voedingsbodems.
Opmerking: Zodra de luchtpijp is vastgebonden op het punt van de bifurcatie, ontpit via de luchtpijp cellen automatisch omgeleid naar zaad aan de linker kwab. Het kan worden getest vóór het zaaien van de cellen door duwen voedingsbodems via de luchtpijp. In de gemetastaseerde model, zal de media aan de linker kwab alleen, die zal opblazen, en niet aan de juiste lobben10verplaatsen. - Stel een 20 mL Luer lock spuit op de top van de trachea canule en ATCC Long kankercellen (A549, H1299) in 50 mL RPMI1640 volledige voedingsbodems (figuur 2F) toevoegen.
- De cel zaaien in het kabinet biosafety uitvoeren Voeg toe 15 mL van cellen in de spuit en laat het passeren van de Long lobben door de zwaartekracht. Voeg de rest van de cellen voordat alle luchtbellen passeren.
- In Acellulair Long zaaien, verzamelen de perfused media druipen beneden in de bioreactor fles en laat het passeren van de luchtpijp weer 3 x.
Opmerking: De perfused media heeft soms de kankercellen zaadjes. Daarom, voor de efficiënte zaaien, weer terug de media in de luchtpijp via de spuit. - Eenmaal uitgezaaid, verwijderen van de spuit, 15 min wachten, toevoegen van nieuwe media en de bioreactor terugkeren naar een incubator. Verwijder alle luchtbellen in de slangen.
- Start de pomp om te perfuse de media op 6 mL/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Long geoogst van rat onderhoudt de intact therapieën en longblaasjes11 (figuur 3A en 3B). Op decellularization, worden de componenten van de extracellulaire matrix van een Acellulair Long, zoals collageen, fibronectine en elastine,11 (Figuur 3 c, 3D, 3Een 3F) bewaard. De decellularization leidt tot een volledige verwijdering van de inheemse rat cellen aanwezig zijn in de longen, die kunnen worden waargenomen door de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring weergegeven: de afwezigheid van cellen en DNA analyse11 een vermindering in DNA bedrag ( tonen Figuur 3D en 3 G). Model 4-D Long ex vivo kan worden gebruikt om te groeien van elk soort Adherente cellen12. Longkanker, longkanker fibroblast, borstkanker en Sarcoom cellen zijn geteeld door het zaaien via de luchtpijp11,12,13. De metastase model staat voor de collectie van primaire tumor weefsel, CTCs en metastatische laesies op verschillende tijdstippen door Lobectomie10. De H & E kleuring van de weefsels toonde intact therapieën en de longblaasjes in zowel de cellulaire en Acellulair model (Figuur 3 H en 3I). De Acellulair 4-D Long-model is een model van de add-on te bestuderen de interactie tussen de verschillende componenten van de communicatie. Het cellulaire 4-D Long-objectmodel biedt een intact Long communicatie met immune cellen14. Immune cellen kunnen worden toegevoegd aan dit model door de therapieën om hun effect op de tumorgroei en de interactie met tumorcellen te studeren. Reproduceerbaarheid en de kwaliteit van het model kunnen worden geëvalueerd door het model in duplo uitgevoerd en het analyseren van de weefsels/cellen door H & E en immunohistochemistry via cel-specifieke markeringen. Figuur 4 toont een schema waarmee de grote stappen betrokken bij het creëren van de ex vivo 4-D Long model.
Figuur 1: items vereist voor de eenheid van de decellularization van de Long-steiger. (A en B) 500 mL fles caps worden geboord en maken de decellularization flessen met tubing vrouwelijke Luer-aansluitingen zijn ingesteld. (C) een andere fles dop moet slechts één gat instellen (D) de intraveneuze instellen voor reagens stroomt door de longslagader van de Long-steiger. De pomp is ingesteld met (F) een pomp, (E) het hoofd van een pomp en (G) een cartridge. (H) pomp buizen met vrouwelijke Luer connectoren aan elk eind, verbindingslijnen (ik) en (J) buizen met mannelijke Luer connectoren aan beide uiteinden zijn verplicht om in te stellen (K) de eenheid van de decellularization. (L) de Long steigers zijn voor 3-5 d in een kringloopsysteem met 1 x antibiotica-antimycotic PBS gewassen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Bioreactor set-up voor een ex vivo 4-D Long celkweek. (A en B) Bioreactor doppen (500 mL) worden geboord en drie vrouwelijke Luer lock-connectors zijn ingevoegd en vastgesteld met een zwart nylon ring. (C) 10 ft van oxygenator buis is gewikkeld rond een gaas magneetventiel met mannelijke Luer integraal lock ringen aan beide uiteinden. (D) een longslagader canule en (E) een tracheale canule zijn opgesteld op basis van een 18 G naald en pomp buis. (F) A 20 mL spuit is ingesteld op de one-way luchtpijp connector om het zaad van de cellen in de epitheliale ruimte van de Long-steiger. (G) de bioreactor kringloopsysteem is ingesteld binnen de cel cultuur incubator voor perfusie en tumorgroei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Representatieve beelden van de ex vivo 4-D Long model voor metastase. (A) een intact hart-longen-blok wordt geoogst van 4 - tot 6-week-oude rat. (B) histopathologisch onderzoek toont de longblaasjes en de pneumocytes. (C) Decellularization leidt tot de volledige verwijdering van de longkanker cellen. (D) histopathologisch onderzoek toont een intact kelder membraan met Acellulair longen. (E en F) Movat van pentachrome en elastine vlek blijkt de aanwezigheid van fibrine, collageen en elastine met intact therapieën en bronchiën. (G) DNA analyse blijkt een vermindering in DNA gehalte van meer dan 99%. (H) de cellulaire Long rechtstreeks in de bioreactor kan worden gebruikt voor de celcultuur en (ik) een histologische analyse toont de aanwezigheid van tumorgroei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: schematische diagram waarop de grote stappen in het creëren van model 4-D Long ex vivo . Een hart-longen-blok is in stap 1 geoogst van een rat. Volgens de studie eis, in stap 2, de longen ofwel rechtstreeks als een cellulaire model kunnen worden gebruikt of kunnen worden decellularized als u wilt verwijderen van de oorspronkelijke cellen. De volgende stap impliceert opzetten van de longen model in de bioreactor en cel zaaien. Ten slotte zijn bioreactoren ingesteld in de incubator voor de cultuur van de cel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 4-D ex vivo Long biedt de mogelijkheid te bestuderen van tumorgroei en uitzaaiing in een laboratorium-opstelling. Een native Long-matrix is een complex systeem dat biedt ondersteuning aan normale weefsel en cel-cel interacties, cel-matrix interacties, celdifferentiatie en weefsel organisatie onderhoudt. Het biedt een kans om de eventuele tumor communicatie-onderdelen om te bestuderen van de gevolgen daarvan voor de tumorgroei en de interactie met andere cellen toe te voegen.
De oogst van de Long is de kritische stap voor de 4-D Long ex vivo model. Een vertraging bij het beheer van de heparine injectie na de thoracale opening kan resulteren in een bloedstolsel in de longen, die invloed kunnen hebben op het vrije verkeer van de reagentia tijdens de decellularization. Een goede spoelen met EDTA PBS tot een kleurloze vloeistof uit de vent komt is belangrijk, vooral met de cellulaire model. Voorzichtig snijden van de superieure vena cava is belangrijk te voorkomen dat schade aan de PA. Tijdens het proces van de decellularization is het zeer belangrijk om te voorkomen dat luchtbellen naar het schavot longkanker. De aanwezigheid van de luchtbellen kan vertragen of stoppen van de stroom van reagentia en bijdragen tot een onjuiste decellularization. Bellen kunnen worden verwijderd door te zuigen uit de bubbels met behulp van een 10-20 mL spuit. Het is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de canule PA niet is gedraaid. Tijdens de bioreactor opbouw, kan eventuele torsie in de buis resulteren in een pop-up op de connectors en resulteren in een grote puinhoop in de incubator. Voorkom draaien in de canule, de canule/naalden kan worden gesneden en opnieuw tot stand met behulp van biocompatibel buis, die de flexibiliteit die nodig zijn biedt voor het draaien van de canule zonder verstoring van de verbindingen. Lekkages van voedingsbodems binnen de incubator wellicht verder een professionele reiniging. Tijdens het maken van het model van metastase, is zorgvuldig wordt vereist op de luchtpijp bifurcatie site. Een punctie van de longen of luchtpijp kan leiden tot het uitlekken van cellen en inconsistente resultaten.
De 4-D Long Acellulair en cellulaire ex vivo modellen hebben verschillende voordelen ten opzichte van conventionele 3D celculturen progressie van kanker, beter te begrijpen, aangezien zij de mogelijkheid te bestuderen van de biologische hoofdstappen in metastase met een extra bieden dimensie van stroom. Beide modellen nabootsen van de biologie van tumorgroei en uitzaaiing en gelegenheid bieden om het verzamelen van tumorcellen in verschillende fasen van kanker groei beter te begrijpen de gene handtekeningen, de reactie op de behandelingen, en de ontwikkeling van resistentie. Hoewel er een matrix van Long, heeft het de potentie om te groeien van een aantal bestaande cellijnen en primaire cellen. De beperking van de ex vivo 4-D model is de eis van > 10 miljoen cellen zaaien om te bestuderen van de metastase. Cellen met een lage proliferatieve potentieel kunnen langer duren om te laten zien de metastatische laesie. Bovendien is dit model vereist meer aseptische condities zodra de cellen worden overgeënt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Min P. Kim kreeg financiële steun van de tweede John W. Kirklin onderzoek beurs, Amerikaanse Vereniging voor de ductus chirurgie, Graham Foundation, Houston Methodist Specialty arts onderzoeksgroep Grant, en Michael M. en Joann H. Cone Research Award. Wij danken Ann Saikin voor het bewerken van de taal van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dowley rat | Harlan | 206M | Male |
| Chlorhexidine swab | Prevantics, NY, USA | NDC 10819-1080-1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA | NDC 25021-400-10 | |
| 18-gauge needle | McMaster Carr, USA | 75165A249 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, San Angelo, TX, USA | A305H | |
| Masterflex L/S pump | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07554-80 | |
| Masterflex L/S pump head | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-05 | |
| Masterflex L/S pump cartridge | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-70 | |
| Tygon Tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 14171211 | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-16 | |
| Female luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-34 | 75165A249 |
| Male luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45513-04 | |
| black nylon ring | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-45509-04 | |
| Intravenous set | CareFusion | 41134E | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | CAS151-21-3 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Silicone oxygenator | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | ABW00011 | Saint-GoBain- |
| Wire mesh | 1164610105 | Lowes | New York Wire |
| Female luer Lug Style TEE | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-56 | |
| Male luer integral lock ring to 200series Barb | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45518-08 | |
| Female luer thread style coupler | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-22 | |
| Clave connector | ICU Medical | 11956 | |
| Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock | smith Medical | MX9341L | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-13 | for cannula |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A.
- Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- Bissell, M. J., Hines, W. C. Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression. Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture. PloS One. 7 (9), e45308 (2012).
- Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).
- Mishra, D. K., et al. Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).
- Mishra, D. K., et al. Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis. The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules. The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).
- Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model. Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).
- Mishra, D. K., et al. Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model. The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).
- Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model. BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).
