Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en ex vivo lung cancer modell som härmar steg av tumör progression och hjälper till att isolera en primär tumör, cirkulerande tumörceller och metastatiska lesioner.
Abstract
Det är svårt att isolera tumörceller vid olika tidpunkter av tumör progression. Vi skapade en ex vivo lung modell som kan visa växelverkan av tumörceller med en naturlig matris och kontinuerligt flöde av näringsämnen, samt en modell som visar samspelet mellan tumörceller med normala cellulära komponenter och en naturlig matris. Acellulärt ex vivo lung modellen skapas genom isolera en råtta hjärt-lung blockera och ta bort alla celler med hjälp av decellularization process. Den rätt huvudsakliga luftrör är bundna av och tumörceller är placerade i luftstrupen av en spruta. Cellerna flytta och befolka den vänstra lungan. Lungan placeras sedan i en bioreaktor där lungartären tar emot en ström av media i en sluten krets. Tumören vuxit på den vänstra lungan är den primära tumören. Tumörcellerna som isoleras i cirkulerande media cirkulerande tumörceller och tumörcellerna i den högra lungan är metastatiska lesioner. Den cellulära ex vivo lung modellen skapas genom att hoppa över decellularization processen. Varje modell kan användas för att besvara olika forskningsfrågor.
Introduction
Cancer metastaser är skyldige bakom de flesta dödsfall och utgör den ultimata utmaningen i arbetet med att bekämpa cancer. Det övergripande målet med denna metod är att utforma ett protokoll för en fyrdimensionell (4 D) cellkultur som har en dimension av flöde, förutom den tredimensionell (3-D) celltillväxten. Det föreställer tre distinkta faser i processen metastaser [dvs, den primära tumören, cirkulerande tumörceller (CTCs) och metastatiska lesioner].
Under de senaste tre decennierna gett forskare runt om i världen en oöverträffad rikedom av information för att förstå mekanismerna bakom metastasutvecklingen i olika cancerformer som förbättrat utsikterna till ett botemedel eller progressionsfri överlevnad. Kliniska hanteringen av vissa typer av cancer, såsom bröstcancer, förbättrats avsevärt1; vissa cancerformer, såsom lungcancer, har dock fortfarande en dålig överlevnad2. In vitro och i vivo djurmodeller har varit avgörande för att generera nya insikter i de mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av sjukdomen. Under de senaste åren, cell linje-derived xenograft (CDX) och patientderiverade xenograft (PDX) har varit mer intresse som de bevara många relevanta inslagen i de mänskliga primärtumör3, såsom tillväxt kinetik, histologiska funktioner, beteende egenskaper, och svaret på behandling. Varje modell har dock sina begränsningar att förstå mekanismen av CTC bildandet och metastasering till ett avlägset orgel4,5,6.
Nyligen har utvecklat vi en cancer 4 D ex vivo lung modell genom att använda begreppet orgel reengineering och perfusion-baserade cellkultur. Det härmar mänskliga lung cancertillväxt genom att bilda perfusable tumör knölar som växer över tid med en liknande mänskliga cancer-utsöndras protein produktion7. Den representerar den gene expression signatur som förutspår dålig överlevnad hos cancerpatienter och visar också en terapeutiskt svar av tumörregression vid cisplatin behandling8,9. Lungan modellen ändrades ytterligare så att det kan bilda metastatiska lesioner. CTCs utvecklas från en primärtumör och intravasate till vaskulatur och extravasate i kontralaterala lungan att bilda metastatiska lesioner10. Gen uttryck studier tyder på en distinkt uttryck profil av den primära tumören, CTCs, och de metastatiska lesionerna och uppreglering av en delmängd av de gener som krävs för fenotyp10. Metastaserande processen på grund av förekomsten av biologiska förhållanden ses hos patienter med cancer. Fördelen med denna modell är förekomsten av en naturlig matris och arkitektur och en genomblödning av näringsämnen som leder till bildandet av tumör knölar. Dessutom ger det också en möjlighet att studera effekterna av olika komponenter av tumör närmiljön eller droger på tumör progression över tiden. Denna modell kan användas för att växa en rad cancerceller (lungcancer, bröstcancer, sarkom etc.) i ett laboratorium set-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen för djurförsök godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Houston Methodist Research Institute och utförs i enlighet med alla regler, lagar, riktlinjer och principer.
1. råtta Lung skörd
- Söva en 4 - till 6-vecka-gammal mansperson Sprague-Dawley råtta genom en intraperitoneal (IP) injektion av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) i dess flank. Säkerställa anestesi genom att kontrollera en avsaknad av rörelse när bakbenen tån kläms med pincett.
- Efter 10 min, raka bröstet och buken och torka av huden med en klorhexidin.
- Ta bort huden genom att plocka upp med pincett och öppning av det med en disponibel skalpell. Efter att ha öppnat brösthålan av öppning med skalpell, utföra en bilaterala torakotomi genom att skära den främre sidan av revbenen på vänster och höger sida av diafragma med sax.
Obs: Detta är en icke-survival kirurgi. - Håll bröstkorgen och injicera 2 mL heparin (1 000 enheter/mL) i höger kammare i det pulserande hjärtat med en 27 G nål.
Obs: Detta kommer att förhindra eventuella bildandet av blodproppar i lungan. - Helt ta bort revbenen med sax och placera en 18 G nål i vänster kammare som en vent, tills blodet kommer ut. Sedan injicera 15 mL hepariniserad fosfatbuffrad koksaltlösning (12,5 enheter/mL; hepariniserad PBS) i höger kammare med en 25 G nål.
- Skär den underlägsna och överlägsna vena cava, två stora vener på höger sida av hjärtat, och spola lungorna med ytterligare 10 mL hepariniserad PBS i höger kammare med en 27 G nål.
Obs: Den sämre vena cava visualiseras under botten av hjärtat som en stora fartyg fyllda med rött blod. Likaså är den överlägsna vena cava visualiseras i den övre delen av hjärtat som ett stort kärl. - Skär luftstrupen vid basen av sköldkörteln. Ta försiktigt bort den fallande aortan på nivån av hemiazygos ven och grenar av aorta på bågen.
- Ta ut hjärt-lung blocket från brösthålan och resten av rat kroppen.
- Utföra ventriculotomy genom att skära hälften av höger och vänster ventriklarna och placera en skräddarsydd förfyllda 18 G rostfritt stål nålen kanyl via höger kammare i de viktigaste lungartären (PA).
- Fäst kanylen med en 2-0 sidenslips och noggrant utsätter den höger kammare och atrium.
- Placera en kvinnlig Luer-skottet i vänster hjärtkammare och säkra den med en 2-0 siden slips.
- Spola den hjärt-lung blocket med 20 mL av hepariniserad PBS genom PA kanylen och placera det i en 50 mL tub som innehåller kultur media eller hepariniserad PBS.
Obs: För en cellular-modell, gå till steg 3.1 för att ställa in bioreaktor. För ett acellulärt modell, Fortsätt till steg 2.1 för decellularization.
2. lung Decellularization
-
Beredning av decellularization enheten
- Förbereda varje decellularization kammare/flaska av piercing två hål i hatten på flaskan och knäppa en kvinnlig Luer i hålen (figur 1A och 1B). Säkra den med en svart nylon ring på andra sidan. Likaså, borra ett enda hål i en annan kapsylen för intravenös set kvarstad (figur 1 c).
Obs: Figur 1A och 1B är av de samma kapsyler från två olika sidor. Figur 1 c är av en annan mössa med en enda hål som nämnts ovan i steg 2.1.1. - Bifoga en 0,5-tums röret (i lungartären eller PA slutet) och 6-tums rör (figur 1J) till en kvinnlig Luer från inuti kapsyler (figur 1A och 1B) och bifoga en manlig luerlock i ändarna. Ställa in låset med en 500 mL flaska som decellularization kammare/flaskan.
- Anslut ena änden av två 2 ft rör (som förbinds med en manlig luerlock) till båda ändarna av pump röret (figur 1 H), som är knuten till pumphuvudet (figur 1E och 1F) av en bläckpatron (figur 1 g) med en kvinnlig Luer Lås (figur 1I).
- Anslut andra ändarna av 2 ft rören (från steg 2.1.3) varje en kvinnlig Luer lock huvudet på decellularization kammare/bottle cap (figur 1 L).
- Ställ in en 250 mL hepariniserad PBS flaska (med 200 mL PBS) genom att hänga en inverterad flaska på ett stativ med den proximala änden för en intravenös (figur 1 d) sitter i hatten på flaskan och den distala änden ersätter 2 ft röret anslutet till decellularization c Hamber/flaska i slutet PA (figur 1B). Anslut denna 2 ft tube till Kassera flaskan.
Obs: Flaskorna ställs i kartong, som visas i figur 1 K. Intravenös rören komma ur hängande flaskorna att dosera reagenser i lungan schavotten.
- Förbereda varje decellularization kammare/flaska av piercing två hål i hatten på flaskan och knäppa en kvinnlig Luer i hålen (figur 1A och 1B). Säkra den med en svart nylon ring på andra sidan. Likaså, borra ett enda hål i en annan kapsylen för intravenös set kvarstad (figur 1 c).
-
Lung decellularization process
- Köra hepariniserad PBS på en fysiologisk perfusionstrycket 30 mm Hg (figur 1 K) tills den flyter fritt i decellularization kammare/flaskan och fäst sedan, hjärt-lung blocket till PA slutet genom PA kanylen.
- Håll igång pumpen kontinuerligt, så att eventuella överskott buffertlösning i decellularization kammare/flaskan får kasseras.
- Kör hepariniserad PBS genom PA för 15 min på en perfusionstrycket 30 mm Hg för den första tvätten (figur 1 K).
- Ersätta hepariniserad PBS flaskan med 0,1% sodium dodecyl sulfate (SDS) i avjoniserat vatten och BEGJUTA lungan i 2 h för decellularization.
- Efter decellularization, BEGJUTA avjoniserat Ånghärdad vatten genom lungan ställningen för 15 min.
- Sedan BEGJUTA 1% icke-joniskt rengöringsmedel i avjoniserat vatten i ca 10 min.
- Ersätt decellularization kammare/flaskan med 500 mL Ånghärdad PBS kompletteras med 1 x antibiotika (penicillin-streptomycin amfotericin), hålla hängande lungan intakt med locket inuti flaskan.
- Kassera intravenös ställa, sätta 2 ft röret bifogas behållaren kasta tillbaka till lungartären slutet av decellularization kammaren, och köra pumpen vid 6 mL/min (figur 1 L).
- BEGJUTA lungorna för 72 h och hålla ändra PBS med antibiotika varje 12 h.
Obs: Acellulärt lungan är klar för omedelbar användning. Det kan lagras vid-80 ˚C tills behövs. Om rosa fläckar eller blodproppar kan visualiseras tydligt i lungan loberna, kassera lungan. Det är möjligt att slumpmässigt testa för DNA eller histopatologi. En komplett acellulärt Lunga visas inte celler och 99,9% av DNA kommer att tvättas bort.
Obs: När du arbetar med en cellulär lung modell, hoppa över decellularization. Skördade lungan (steg 1) kan anges direkt i en bioreaktor.
3. bioreaktor Set-up
- Förbereda bioreaktor flaskan och de objekt som krävs för installationen.
- Borra tre hål i en 500 mL flaska cap på lika avstånd och fixa en kvinnlig Luer i alla tre hålen, med svart nylon ringar (figur 2A och 2B).
Obs: I två hål slutar luerlock ansikte utsidan, medan ena änden vetter mot insidan av flaskan. - Skär en 6 i pumpen rör, en 2 i röret, en 6 i röret, en 1.5 ft tube, en 2 fot tub och en 10 ft oxygenator tube per bioreaktor.
- Skär en 18 G rostfritt stål nålen och, igen, Anslut ändarna med biokompatibel slangar för en trakeal kanyl.
- Wrap oxygenator röret, med Luer lock-kontakter i ändarna, på en magnetventil trådnät med Autoklavera band (figur 2 c).
- Autoklav ovan nämnda poster och hålla dem i UV-ljus i 10 min.
- Borra tre hål i en 500 mL flaska cap på lika avstånd och fixa en kvinnlig Luer i alla tre hålen, med svart nylon ringar (figur 2A och 2B).
- Ställa in pumpen släpper regelbundna cell kultur inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) med rätt avstånd mellan facken att enkelt passa en 500 mL flaska.
- Spray 70% etanol på pumpen kassetten och ansluta pumpen röret med Luer lock honkontakter i båda ändarna till pumpen.
- Ställ in den oxygenator lindade runt den magnetventil trådnät inuti cellen kultur inkubatorn genom att ansluta ena änden (utflödet) av oxygenator till pumpen röret och den andra ändan med 1.5 ft röret i bioreaktor.
- Ställa in bioreaktor flaskan i en biosäkerhet skåp med aseptiska förhållanden.
- Bifoga en 3-vägs Avstängningskranen (gul) till chefen för en av de kvinnliga Luers att styra flödet genom PA.
- Anslut en enkelriktad Avstängningskranen (blå) till en annan kvinnlig Luer lock skiljevägg för cell sådd genom luftstrupen (figur 2F).
- Ansluta 2 i slangen på utsidan (vit) och 6 i slang på insidan av flaskan för att cirkulera media ut. Passar en manlig luerlock till en 2 ft röret och bifoga en kvinnlig Luer lug stil Tee att tillhandahålla hjälpmedel för att lägga till eller ta bort något.
- Fäst en enkelriktad Avstängningskranen på en av öppningarna i trevägs kontakten (kvinnliga Luer lug stil Tee).
- Bifoga en manlig luerlock och en kvinnlig luerlock till 2 ft rör.
- Tillsätt 200 mL RPMI1640 med 10% FBS och 1% antibiotika cellodlingsmedium (varierar per cell krav) och överför bioreaktor till inkubatorn. Anslut oxygenator röret till de två öppna ändarna (enkelriktad Avstängningskranen och t-koppling) för att göra det en slutna bioreaktor.
- Pre köra pumpen vid 6 mL/min inuti cellen kultur inkubatorn med cell kultur media att fylla oxygenator och rör, så att inga luftbubblor finns i slangen.
- När rören är fyllda med media, Stäng Avstängningskranen och avlägsna bioreaktor flaskan från inkubatorn genom att koppla bort oxygenatorer från båda ändarna av bioreaktor flaskan.
- Lagt bioreaktor flaskan i biosäkerhet skåp, passera kultur media genom Avstängningskranen och tillmäter avstängningskranen genom den manliga luerfattningen PA kanylen av lung scaffolden (acellulärt eller cellulära).
Obs: Här är det möjligt att använda acellulärt modellen (efter decellularization processen) eller ett nyskördade hjärt-lung-block (dvs.den cellular-modellen, som det behåller de infödda råtta cellerna). - Passera kultur media genom en enkelriktad Avstängningskranen ta bort eventuell luft och knyta luftrör kanylen genom en silkestråd till luftstrupen.
- Se till att undvika någon vrida PA och luftstrupen. Stäng flasklocket bioreaktor med lungan schavotten släpper igen, aseptiskt överföra bioreaktor till inkubatorn och starta pumpen i en 6 mL/min hastighet.
- Kör Odlingsmedier för 10-15 min att se till att alla lober få uppblåst och lungan ser i god form (figur 2 g).
4. metastaser modell och Cell seedning
Obs: Gå vidare till cell sådd med ovanstående lung modell för en primär tumör tillväxt studie. Ändra lung scaffolden (acellulärt eller cellulära) följande för metastaserande modellen.
- Ta ut bioreaktor med lung ställningen från inkubatorn och lägga den i biosäkerhet skåp.
- Använd en spruta för Luer lock att passera 5 mL kultur media genom luftstrupen och öppna bioreaktor locket med hängande lung byggnadsställning (figur 2F).
- I detta steg krävs ytterligare en person att hjälpa till en förändring i lungan till en metastaserande modell.
- Få siden 2-0 redo och använda kantiga pincett för att göra en genom luftstrupen på bifurkation peka.
- Knyta luftstrupen ska den högra lungan på bifurkation peka och kontrollera det fria flödet av media genom luftstrupen till den vänstra lungan genom passerar kultur media.
Obs: När luftstrupen är bunden vid den bifurkation punkten, celler seedade genom luftstrupen kommer automatiskt att fröet till de vänster loberna. Det kan testas innan sådd cellerna genom att skjuta kultur media genom luftstrupen. I metastaserande modellen, kommer att media flytta till vänster loberna endast, som kommer att blåsa, och inte till de högra lober10. - Ställa en 20 mL Luer lås spruta ovanpå luftrör kanylen och lägga till ATCC lungcancerceller (A549, H1299) i 50 mL RPMI1640 komplett kultur media (figur 2F).
- Utföra cellen sådd i biosäkerhet skåp. Tillsätt 15 mL av celler i sprutan och låta det passera lungan loberna av gravitationen. Tillsätt resten av cellerna innan eventuella luftbubblor passerar.
- I acellulärt lung sådd, samla perfunderade media droppar ner i bioreaktor flaskan och låta det passera luftstrupen igen 3 x.
Obs: Perfunderade media ibland har cancercellerna seedade. Således, för effektiv sådd, sätta tillbaka media igen i luftstrupen genom sprutan. - När seedade, ta bort sprutan, vänta 15 min, lägga till färsk media och återgå bioreaktor till en inkubator. Ta bort eventuella luftbubblor i slangen.
- Starta pumpen för att BEGJUTA media på 6 mL/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungan skördas från råtta underhåller intakt vaskulatur och alveolerna11 (figur 3A och 3B). Vid decellularization bevaras extracellulär matrix komponenter i ett acellulärt lunga, såsom kollagen, Fibronektin och elastin,11 (figur 3 c, 3D, 3Eoch 3F). Decellularization leder till en fullständig borttagning av de infödda råtta cellerna som finns i lungorna, vilket kan observeras av hematoxylin och eosin (H & E) färgning visar avsaknad av celler och DNA analys11 visar en minskning i DNA belopp ( Figur 3D och 3 G). Ex vivo 4 D lung modellen kan användas att växa något slags vidhäftande celler12. Lungcancer, lungcancer fibroblast, bröstcancer och sarkom celler odlades av sådd genom luftstrupen11,12,13. Metastas modellen möjliggör insamling av primärtumör vävnad och CTCs metastatiska lesioner vid olika tidpunkter av lobektomi10. H & E färgningen av vävnader visade intakt vaskulatur och alveolerna i både cellulära och acellulära modellen (figur 3 H och 3I). Acellulärt 4 D lung modellen är en add-on modell att studera samspelet mellan olika komponenter i närmiljön. Cellulära 4 D lung modellen ger en intakt lung närmiljön med immunceller14. Immunceller kan läggas till denna modell genom kärlsystemet att studera deras effekt på tumörtillväxt och samspelet med tumörceller. Reproducerbarhet och kvalitet av modellen kan bedömas genom att köra modellen i två exemplar och analysera vävnader och celler av H & E och immunhistokemi med cell-specifika markörer. Figur 4 visar en schematisk bild som representerar stora stegen för att skapa den ex vivo 4 D lung modellen.
Figur 1: krävs objekt på decellularization enheten för lung schavotten. (A och B) 500 mL kapsyler borras och Luer honkontakter ställs in med slangen till skapa decellularization flaskorna. (C) en annan kapsylen behöver bara ett hål att ställa in (D) intravenös för reagens flöden via lungartären av lung schavotten. Pumpen ställs in med (F), en pump, (E) en pumphuvudet och (G), en patron. (H) Pump slangar med kvinnliga Luer-kontakter i varje slutet, (jag) kopplingar och (J) rör med hanluer kontakterna i båda ändar är skyldiga att inrätta (K) decellularization enheten. (L), lungan ställningar tvättas för 3-5 d i slutna system med 1 x antibiotika-antimycotic PBS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bioreaktor set-up för en ex vivo 4 D lung cellkultur. (A och B) bioreaktor kapsyler (500 mL) borras och tre Luer lock honkontakter infogas och fast med en svart nylon ring. (C) 10 ft av oxygenator tube är virad runt ett trådnät solenoid med manlig Luer integrerad låsringar i båda ändarna. (D) ett lungartären kanyl och (E), en trakeal kanyl upprättas med en 18 G nål och pump röret. (F), A 20 mL spruta sätts till enkelriktad luftstrupen kontakten till utsäde cellerna i epitelial loppet av lung schavotten. (G) den slutna bioreaktor är inställd inuti cellen kultur inkubatorn för perfusion och tumörtillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa bilder av ex vivo 4 D lung modell för metastas. (A) ett intakt hjärt-lung-block skördas från 4 - 6 vecka-gamla råtta. (B) histopatologi visar alveolerna och pneumocytes. (C) Decellularization leder till fullständig borttagning av lungceller. (D) histopatologi visar en intakt basalmembran med acellulärt lungor. (E och F) Movat's pentachrome och elastin fläcken avslöjar förekomsten av kollagen och fibrin elastin med intakt vaskulatur och luftrör. (G), DNA analys visar en minskning i DNA-innehåll av mer än 99%. (H), cellulär lungan kan användas direkt i bioreaktor för cellodling och (jag) en histologisk analys visar förekomsten av tumörtillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk bild som visar stora steg i skapandet av den ex vivo 4 D lung modellen. I steg 1 skördas en hjärt-lung blockera från en råtta. Enligt studien kravet, i steg 2, lungorna kan antingen användas direkt som en cellular-modell eller kan vara decellularized för att ta bort alla infödda celler. Nästa steg handlar om att sätta upp lungan modellen i bioreaktor och cell sådd. Slutligen, bioreaktorer ställs in i inkubatorn för cellkulturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo 4 D lungan ger möjlighet att studera tumörtillväxt och metastas i ett laboratorium set-up. En infödd lung matris är ett komplext system som ger stöd till normal vävnad och underhåller cell-cell interaktioner, cell-matrix interaktioner, celldifferentiering och vävnad organisation. Det ger en möjlighet att lägga till någon tumör mikromiljö komponenter för att studera deras effekter på tumörtillväxt och samspelet med andra celler.
Lungan skörden är den kritiska steget för ex vivo 4 D lung modell. En försening i då heparin injektionen efter bröstkorg öppnandet kan leda till en blodpropp i lungorna, vilket kan påverka det fria flödet av reagenser under decellularization. En ordentlig spolning med hepariniserad PBS förrän en färglös vätska kommer från ventilen är viktigt, särskilt med den cellular-modellen. Noga med att skära av den överlägsna vena cava är viktigt att undvika skada till PA. Under decellularization är det mycket viktigt att undvika luftbubblor som flyttar till lung schavotten. Förekomsten av luftbubblor kan sakta ner eller stoppa flödet av reagenser och bidrar till en felaktig decellularization. Bubblor kan tas bort genom att suga ut bubblor med hjälp av en 10-20 mL-spruta. Det är mycket viktigt att se till att PA kanylen inte är vridna. Under bioreaktor set-up, kan någon vrida i slangen resultera i ett popup-fönster på kontakterna och resultera i en enda röra inuti inkubatorn. För att undvika vridning i kanylen, kanyl/nålar kan kapas och kopplas med biokompatibel slangar, som ger den flexibilitet som behövs för att rotera kanylen utan att störa anslutningarna. Läckage av kultur media släpper inkubatorn kräva ytterligare en professionell rengöring. När du skapar metastaser modellen, krävs noggrann suturering på webbplatsen luftstrupen bifurkation. Någon punktering av lungorna eller luftstrupen kan leda till läckage av celler och inkonsekventa resultat.
De acellulära och cellulära ex vivo 4 D lung modellerna har flera fördelar jämfört med konventionella 3D cellkulturer att bättre förstå cancer progression, eftersom de ger möjlighet att studera de stora biologiska steg i metastaser med en ytterligare dimensionen av flöde. Båda modellerna efterlikna biologi tumörtillväxt och metastas och ge möjlighet att samla tumörceller i olika faser av tillväxt av cancer att bättre förstå gen underskrifter, svaret på behandlingar och utvecklingen av resistens. Men det är en lung matris, har den potential att växa en rad etablerade cellinjer och primära celler. Begränsningen av ex vivo 4 D-modellen är kravet på > 10 miljoner celler sådd för att studera metastaser. Celler med en låg proliferativ potential kan ta längre tid att Visa metastaserande lesionen. Denna modell kräver dessutom mer aseptiska förhållanden när cellerna är seedade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Min s. Kim fick bidragsstöd från den andra John W. Kirklin forskning Scholarship, American Association for bröst operation, Graham Foundation, Houston Methodist specialitet läkare forskargrupp Grant, och Michael M. och Joann H. kon Research Award. Vi tackar Ann Saikin för språket redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dowley rat | Harlan | 206M | Male |
| Chlorhexidine swab | Prevantics, NY, USA | NDC 10819-1080-1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA | NDC 25021-400-10 | |
| 18-gauge needle | McMaster Carr, USA | 75165A249 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, San Angelo, TX, USA | A305H | |
| Masterflex L/S pump | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07554-80 | |
| Masterflex L/S pump head | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-05 | |
| Masterflex L/S pump cartridge | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-70 | |
| Tygon Tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 14171211 | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-16 | |
| Female luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-34 | 75165A249 |
| Male luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45513-04 | |
| black nylon ring | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-45509-04 | |
| Intravenous set | CareFusion | 41134E | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | CAS151-21-3 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Silicone oxygenator | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | ABW00011 | Saint-GoBain- |
| Wire mesh | 1164610105 | Lowes | New York Wire |
| Female luer Lug Style TEE | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-56 | |
| Male luer integral lock ring to 200series Barb | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45518-08 | |
| Female luer thread style coupler | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-22 | |
| Clave connector | ICU Medical | 11956 | |
| Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock | smith Medical | MX9341L | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-13 | for cannula |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A.
- Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- Bissell, M. J., Hines, W. C. Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression. Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture. PloS One. 7 (9), e45308 (2012).
- Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).
- Mishra, D. K., et al. Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).
- Mishra, D. K., et al. Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis. The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules. The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).
- Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model. Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).
- Mishra, D. K., et al. Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model. The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).
- Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model. BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).
