Summary
Vi præsenterer her, en protokol for en ex vivo lung cancer model, der efterligner trinene af tumor progression og hjælper med at isolere en primær tumor, cirkulerende tumorceller, og metastatisk læsioner.
Abstract
Det er vanskeligt at isolere tumorceller på forskellige punkter af tumor progression. Vi har oprettet en ex vivo lung model, der kan vise et samspil mellem tumorceller med en naturlig matrix og kontinuerlig af næringsstoffer, såvel som en model, der viser samspillet mellem tumorceller med normal cellulære komponenter og en naturlig matrix. Acellulær ex vivo lung model er skabt ved at isolere en rotte hjerte-lunge blok og fjerne alle celler ved hjælp af decellularization proces. Den højre vigtigste Bronkie er bundet af og tumorceller er placeret i luftrøret af en sprøjte. Cellerne flytte og udfylde den venstre lunge. Lungerne er så placeret i en bioreaktor hvor lungepulsåren modtager en løbende strøm af medier i et lukket kredsløb. Tumor dyrkes på den venstre lunge er den primære tumor. Tumorcellerne, der er isoleret i den cirkulerende medier cirkulerende tumorceller og tumorceller i højre lunge er metastatisk læsioner. Den cellulære ex vivo lung model er skabt ved at springe decellularization processen. Hver model kan bruges til at svare på forskellige spørgsmål.
Introduction
Kræft metastaser er synderen bag de fleste cancer-relaterede dødsfald og er den ultimative udfordring i bestræbelserne på at bekæmpe kræft. Det overordnede mål med denne metode er at designe en protokol for en fire-dimensionelle (4 D) cellekultur, som har en dimension af flow, ud over de tre-dimensionelle (3-D) cellevækst. Det repræsenterer de tre særskilte faser af metastase-processen [dvs, den primære tumor, cirkulerende tumorceller (CTCs), og metastatisk læsioner].
I de seneste tre årtier gav forskere rundt om i verden en enestående rigdom af oplysninger til at forstå de underliggende metastatisk progression i forskellige kræftformer, der forbedrede udsigten til en kur eller progressionsfri overlevelse mekanismer. Den kliniske behandling af visse kræftformer som brystkræft, forbedres væsentligt1; nogle kræftformer, såsom lungekræft, har dog stadig en dårlig overlevelse2. In vitro og i vivo dyremodeller har været medvirkende til at skabe ny indsigt i de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af sygdommen. I de sidste par år, cell line-afledte xenografts (CDX) og patient-afledte xenografts (PDX) har været mere interesse som de bevare mange relevante funktioner af primære menneskelige tumor3, såsom vækst kinetik, histologiske funktioner, adfærdsmæssige egenskaber, og svar på terapi. Hver model har imidlertid sine begrænsninger at forstå mekanismen af CTC dannelse og metastaser til en fjern orgel4,5,6.
For nylig, udviklede vi en 4-D ex vivo lung cancer model ved at benytte begrebet orgel reengineering og perfusion-baserede cellekultur. Det efterligner human lunge kræft vækst ved at danne perfusable tumor knuder, der vokser over tid med en lignende menneskelige kræft-udskilles protein produktion7. Det repræsenterer gen expression underskrift, der forudsiger dårlig overlevelse hos patienter med kræft og viser også en terapeutisk respons af tumorregression ved cisplatin behandling8,9. Lung model blev yderligere ændret, så den kan danne metastatisk læsioner. CTCs udvikle sig fra en primær tumor og intravasate til Vaskulaturen og extravasate i de kontralaterale lunge til at danne metastatisk læsioner10. Gen udtryk undersøgelser tyder på en særskilt udtryk profil af den primære tumor, CTCs, og metastatisk læsioner og opregulering af delmængden af gener kræves for fænotype10. Metastatisk processen opstår på grund af tilstedeværelsen af biologiske betingelser ses hos patienter med kræft. Fordelen ved denne model er tilstedeværelsen af en naturlig matrix og arkitektur, og en perfusion af næringsstoffer, der fører til dannelsen af tumor knuder. Desuden, giver det mulighed for at studere virkningerne af forskellige komponenter af tumor mikromiljø eller narkotika på tumor progression over tid. Denne model kan bruges til at dyrke en vifte af kræftceller (lungekræft, brystkræft, sarkom osv.) i et laboratorium set-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoller for dyreforsøg blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Houston Methodist Research Institute og udføres i overensstemmelse med alle bestemmelser, gældende love, retningslinjer og politikker.
1. rotte lunge høst
- Bedøver en 4 til 6 uge gamle mandlige Sprague-Dawley rotte af en intraperitoneal (IP) injektion af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) i sin flanke. Sikre anæstesi ved at kontrollere for et fravær af bevægelse når hind lemmer tå er klemt med pincet.
- Efter 10 min, barbere brystet og maven og tørre hud med en klorhexidin svaber.
- Fjerne huden ved at samle det op med pincet og incising den med en engangs skalpel. Efter åbning af brysthulen ved incising med skalpel, skal du udføre en bilateral torakotomi ved at skære den forreste side af brystkassen til venstre og højre side af mellemgulvet med saks.
Bemærk: Dette er en ikke-overlevelse kirurgi. - Hold brystkassen og injicere 2 mL af heparin (1.000 enheder/mL) i højre hjertekammer af bankende hjerte ved hjælp af en 27 G nål.
Bemærk: Dette vil forhindre enhver dannelsen af blodpropper i lungen. - Helt fjerne brystkassen med saks og placere en 18 G nåle i den venstre ventrikel som en sikkerhedsventil, indtil blodet kommer ud. Derefter indsprøjtes 15 mL heparinized fosfatbufferet saltopløsning (12,5 enheder/mL; heparinized PBS) i højre ventrikel ved hjælp af en 25 G nål.
- Skære den ringere og overlegen vena cava, to store vener på højre side af hjertet, og tømme lungerne med en yderligere 10 mL af heparinized PBS i højre ventrikel ved hjælp af en 27 G nål.
Bemærk: Den ringere vena cava er visualiseret under bunden af hjertet som en stor fartøj fyldt med røde blod. Ligeledes, den overlegne vena cava er visualiseret i den øverste del af hjertet som et stort skib. - Skar luftrøret i bunden af skjoldbruskkirtlen. Fjern forsigtigt den nedadgående aorta på niveauet for den hemiazygos vene og grene af aorta på buen.
- Tegne en hjerte-lunge blok fra brysthulen og resten af kroppen, rotte.
- Udføre ventriculotomy ved at skære halvdelen af de højre og venstre ventrikler og placere en custom-made forudfyldte 18 G rustfrit stål nål kanyle gennem højre hjertekammer i de vigtigste lungepulsåren (PA).
- Sikre kanylen med en 2-0 silke slips og omhyggeligt udsætte højre hjertekammer og atrium.
- Placer en kvindelig Luer skot i venstre hjertekammer og sikre det med en 2-0 silke slips.
- Skyl hjerte-lunge blok med 20 mL af heparinized PBS gennem PA kanyle og placere det i en 50 mL tube indeholdende kultur medier eller heparinized PBS.
Bemærk: For en cellulær model, gå til trin 3.1 til at sætte oppe bioreaktor. For en acellulær model, Fortsæt til trin 2.1 for decellularization.
2. lunge Decellularization
-
Forberedelse af decellularization enheden
- Forbered hvert decellularization kammer/flaske ved piercing to huller i flaske cap og snapper en kvindelig Luer i huller (figur 1A og 1B). Fastgør det med en sort nylon ring på anden siden. På samme måde, bore et enkelt hul i en anden flaske cap for intravenøs sæt udlæg (figur 1 c).
Bemærk: Figur 1A og 1B er af de samme flaske hætter fra to forskellige sider. Figur 1 c er af en anden kasket med et enkelt hul som anført ovenfor i trin 2.1.1. - Knytte en 0,5-tommer rør (i lungepulsåren eller PA slutningen) og 6-tommer rør (figur 1J) til en kvindelig Luer fra inde flaske hætter (figur 1A og 1B) og vedhæfte en mandlig Luer lock i enderne. Indstille låsen med en 500 mL flaske som decellularization kammer/flaske.
- Tilslut den ene ende af to 2 ft rør, (som er forbundet med en mandlig Luer lock) til enten ender af pumpe røret (figur 1 H), som er knyttet til pumpehoved (figur 1E og 1F) af en patron (figur 1 g) med en kvindelig Luer Lås (figur 1I).
- Tilslut anden ende af 2 ft rør (fra trin 2.1.3) hver en kvindelig Luer lock hovedet på decellularization kammer/flaske cap (figur 1 L).
- Konfigurer en 250 mL heparinized PBS flaske (med 200 mL PBS) ved at hænge en inverteret flaske på et stativ med den proksimale ende af en intravenøs sæt (fig. 1 d) indsat i flaske cap og den distale ende erstatte 2 ft rør forbundet til decellularization c Hamba/flaske enden PA (figur 1B). Tilslut denne 2 ft tube til udsmid flaske.
Bemærk: Flaskerne er fastsat i pap, der er vist i figur 1 K. Intravenøs rør kommer ud af de hængende flasker at fritage reagenser i lunge stillads.
- Forbered hvert decellularization kammer/flaske ved piercing to huller i flaske cap og snapper en kvindelig Luer i huller (figur 1A og 1B). Fastgør det med en sort nylon ring på anden siden. På samme måde, bore et enkelt hul i en anden flaske cap for intravenøs sæt udlæg (figur 1 c).
-
Lunge decellularization proces
- Køre heparinized PBS ved en fysiologisk perfusion Tryk på 30 mm Hg (figur 1 K), indtil det flyder frit i decellularization kammer/flaske, og derefter vedhæfte hjerte-lunge-blok til PA ende gennem PA kanyle.
- Holde kører pumpen konstant, således at eventuelle overskydende stødpudeopløsning inde i decellularization kammer/flasken bliver kasseret.
- Køre heparinized PBS gennem PA for 15 min på en perfusion pres på 30 mm Hg for den første vask (figur 1 K).
- Erstatte heparinized PBS flasken med 0,1% sodium dodecyl sulfat (SDS) i deioniseret vand og perfuse lunge for 2 h til decellularization.
- Efter decellularization, perfuse ionbyttet autoklaveres vand gennem lunge stillads i 15 min.
- Derefter, perfuse 1% nonionisk detergent i ionbyttet vand i 10 min.
- Udskift decellularization kammer/flaske med 500 mL autoklaveres PBS suppleret med 1 x antibiotika (penicillin-streptomycin amphotericin), med hængende lunge intakt med fælles landbrugspolitik inde i flasken.
- Kassér intravenøs sæt, lægge 2 ft røret knyttet til genudsætning beholderen tilbage til lungepulsåren årets decellularization kammer, og køre pumpen ved 6 mL/min. (figur 1 L).
- Perfuse i lungerne i 72 timer og hold skiftende PBS med antibiotika hver 12 timer.
Bemærk: Den acellulær lunge er klar til omgående brug. Det kan opbevares ved-80 ˚C indtil det skal bruges. Hvis lyserøde pletter eller blodpropper kan visualiseres tydeligt i lunge fliger, kassere lungen. Det er muligt at tilfældigt test for DNA eller histopatologi. En komplet acellulær lunge vil ikke vise celler og 99,9% af DNA vil blive vasket.
Bemærk: Når du arbejder med en cellulær lung model, springe decellularization. Den høstede lunge (trin 1) kan sættes direkte i bioreaktor.
3. bioreaktor Set-up
- Forberede bioreaktor flasken og de elementer, der kræves til set-up.
- Bor tre huller i en 500 mL flaske cap på en lige stor afstand og lave en kvindelig Luer i alle tre huller, bruger sort nylon ringe (figur 2A og 2B).
Bemærk: I to huller, Luer-lock slutter ansigt på ydersiden, mens ene ende vender indersiden af flasken. - Skære en 6 i pumpen tube, en 2 i tube, en 6 i tube, en 1.5 ft tube, en 2 ft tube og en 10 ft oxygenator rør pr. bioreaktor.
- Skære en 18 G rustfrit stål nål, og igen, Tilslut ender med biokompatible slangen til en trakeal kanyle.
- Wrap oxygenator rør, med Luer lock stik enden på en magnetventil wire mesh hjælp autoklave bånd (figur 2 c).
- Autoklave ovennævnte elementer og holde dem i UV lys i 10 min.
- Bor tre huller i en 500 mL flaske cap på en lige stor afstand og lave en kvindelig Luer i alle tre huller, bruger sort nylon ringe (figur 2A og 2B).
- Oprette pumpen inde regelmæssig celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) med korrekt afstand mellem bakker nemt passer til en 500 mL flaske.
- Spray 70% ethanol på pumpen patron og forbinde pumpe tube med kvindelige Luer lock stik i begge ender til pumpen.
- Oprette oxygenator svøbt omkring magnetventil trådnet inde celle kultur inkubator ved at forbinde ene ende (udstrømning) af oxygenator pumpe tube og anden enden med 1.5 ft røret i en bioreaktor.
- Oprette bioreaktor flasken i en biosikkerhed kabinet med aseptiske forhold.
- Vedhæfte en 3-vejs stophane (gul) til lederen af en af de kvindelige Luers til at styre flowet gennem PA.
- Tilslut en envejs stophane (blå) til en anden kvindelig Luer lock skot for celle såning gennem luftrøret (figur 2F).
- Tilslut 2 slangen på ydersiden (hvid) og 6 slangen på indersiden af flasken til at cirkulere medier ud. Passer en mandlig Luer lock til en 2 ft tube og vedhæfte en kvindelig Luer lug stil Tee til at yde hjælp til handicappede for at tilføje eller fjerne noget.
- Vedhæfte en envejs stophane til en af åbningerne af tre-vejs-connector (kvindelige Luer lug stil Tee).
- Vedhæfte en mandlig Luer-lock og en kvindelig Luer lock 2 ft rør.
- Der tilsættes 200 mL af RPMI1640 med 10% FBS og 1% antibiotika cellekulturmedium (varierer som pr celle krav) og overføre bioreaktor til rugemaskine. Tilsluttes de to åbne ender (envejs stophane og Tee stik) til at gøre det et lukket kredsløb bioreaktor oxygenator tube.
- Pre køre pumpen på 6 mL/min. inde i celle kultur kuvøse med celle kultur medier til at udfylde oxygenator og rør, således at ingen luftbobler findes i slangen.
- Når rørene er fyldt med medier, lukke hanen og fjerne bioreaktor flaske fra rugemaskinen ved at afbryde forordning fra begge ender af bioreaktor flaske.
- Sætte bioreaktor flaske i biosikkerhed kabinet, passere kultur medier gennem hanen, og tillægger stophane gennem Luer hanstik PA kanylen af lunge skafottet (acellulær eller cellulære).
Bemærk: Her er det muligt at bruge modellen acellulær (efter decellularization processen) eller en friskhøstede hjerte-lunge blok (dvs, den cellulære model, da det bevarer oprindelige rotte celler). - Passere kultur medier gennem en envejs stophane at fjerne luft og binde trakeal kanylen af en silke tråd til luftrøret.
- Sørg for at undgå enhver vrid i PA og luftrør. Tæt bioreaktor flaske cap med lungerne stillads inde igen, aseptisk overføre bioreaktor til rugemaskine og starte pumpen ved en 6 mL/min hastighed.
- Køre Kulturmedier til 10-15 min at gøre sikker på alle lapper få oppustet og lungerne ser i god form (fig. 2 g).
4. metastase Model og celle såning
Bemærk: Fortsæt til celle såning med ovenstående lung model for en primær tumor vækst undersøgelse. Ændre lunge skafottet (acellulær eller cellulære) som følger for metastatisk model.
- Tegne en bioreaktor med lunge stillads fra rugemaskinen, og sætte det i biosikkerhed kabinet.
- Bruge en Luer lock sprøjte til pass 5 mL af kultur medier gennem luftrøret og åbne bioreaktor hætte med hængende lunge stillads (figur 2F).
- På dette trin, er endnu en person skal hjælpe i ændring af lungerne til metastatisk model.
- Få silke 2-0 klar og bruge kantede pincet til at gøre en pass gennem luftrøret på bifurcation punkt.
- Binde luftrøret gonna højre lunge på bifurcation punkt og kontrollere den frie strøm af medier gennem luftrøret til venstre lunge af passerer dyrkningsmedier.
Bemærk: Når luftrøret er bundet på punktet, tvedeling, celler seedede gennem luftrøret vil automatisk blive dirigeret til frø til de venstre lapper. Det kan testes før såning cellerne ved at skubbe kultur medier gennem luftrøret. I modellen metastatisk vil medierne flytte til den venstre kamre kun, som vil puste, og ikke til højre kamre10. - Angive en 20 mL Luer lock sprøjte på toppen af luftrør kanylen og tilføje ATCC lung cancerceller (A549, H1299) i 50 mL af RPMI1640 komplet kultur medier (figur 2F).
- Udføre cellen såning i biosikkerhed kabinet. Der tilsættes 15 mL celler i sprøjten og lade det passere gennem lunge lapper af tyngdekraften. Tilsæt resten af cellerne, før eventuelle luftbobler passerer igennem.
- Acellulær lunge såning, indsamle de perfused medier dryppende ned i bioreaktor flaske og lad det passere gennem luftrøret igen 3 x.
Bemærk: Perfused medierne har undertiden kræftcellerne seedet. Derfor, for effektiv såning, sat tilbage i medierne igen i luftrøret gennem sprøjten. - Når frøet, fjerne sprøjten, vente 15 min, tilføje friske medier og returnere bioreaktor tilbage til en inkubator. Fjern eventuelle luftbobler i slangen.
- Start pumpen for at perfuse medierne på 6 mL/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungen høstet fra rotte fastholder den intakte kar og alveolerne11 (figur 3A og 3B). Ved decellularization bevares de ekstracellulære matrix komponenter af en acellulær lunge, såsom kollagen, fibronektin, og elastin,11 (figur 3 c, 3D, 3Eog 3F). Decellularization fører til en fuldstændig fjernelse af indfødte rotte celler findes i lungerne, som kan observeres ved hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning viser mangel af celler og DNA analyse11 viser en reduktion i DNA beløb ( Figur 3D og 3 G). Ex vivo 4-D lung model kan bruges til at dyrke nogen form for vedhængende celler12. Lungekræft, lungekræft fibroblast, brystkræft og sarkom celler blev dyrket af såning gennem luftrøret11,12,13. Metastase model giver mulighed for samling af primær tumor væv, CTCs og metastatisk læsioner på forskellige tidsintervaller af lobectomy10. H & E farvning af væv viste intakt vaskulatur og alveolerne i den cellulære og acellulær model (figur 3 H og 3I). Modellens acellulær 4-D lunge er en add-on model til at studere samspillet mellem forskellige komponenter i mikromiljø. Den cellulære 4-D lung model giver en intakt lunge mikromiljø med immunceller14. Immunceller kan føjes til denne model gennem Vaskulaturen at studere deres effekt på tumorvækst og interaktion med tumorceller. Reproducerbarhed og kvaliteten af modellen kan vurderes ved at køre modellen i to eksemplarer og analysere væv/celler ved H & E og Immunhistokemi ved hjælp af celle-specifikke markører. Figur 4 viser et skematisk diagram, der repræsenterer de vigtigste trin involveret i oprettelse af ex vivo 4-D lung model.
Figur 1: nødvendige elementer af decellularization enheden af lunge skafottet. (A og B) 500 mL flaske hætter er boret og kvindelige Luer stik er konfigureret med slanger at oprette decellularization flasker. (C) en anden flaske cap behov kun et hul til at sætte oppe (D) intravenøs fastsatte reagens strømme gennem lungepulsåren af lunge stillads. Pumpen er oprette med (F) en pumpe, (E) en pumpehoved og (G) en patron. (H) pumpen slanger med kvindelige Luer stik i hver ende, (jeg) stik og (J) rør med mandlige Luer stik i begge ender er forpligtet til at oprette (K) decellularization enhed. (L) lungen stilladser er vasket for 3-5 d i en lukket loop system med 1 x antibiotika-antimykotikum PBS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bioreaktor set-up for en ex vivo 4-D lunge cellekultur. (A og B) bioreaktor flaske (500 mL) caps er boret og tre kvindelige Luer lock stik er indsat og fast med en sort nylon ring. (C) 10 ft af oxygenator tube er svøbt omkring en wire-mesh magnetventil med mandlige Luer integreret lås ringe i begge ender. (D) A lungepulsåren kanyle og (E) en trakeal kanyle er udarbejdet ved hjælp af en 18 G nåle og pumpe tube. (F) A 20 mL sprøjte er indstillet til envejs luftrøret stik til frø celler i den epitel plads af lunge stillads. (G) lukket kredsløb bioreaktor er sat op inde i celle kultur inkubator for perfusion og tumorvækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentant billeder af ex vivo 4-D lung model for metastase. (A) en intakt hjerte-lunge blok er høstet fra 4 til 6 uge gammel rotte. (B) histopatologi viser alveolerne og pneumocytes. (C) Decellularization fører til fuldstændig fjernelse af Lungeceller. (D) histopatologisk undersøgelse viser en intakt basalmembranen med acellulær lunger. (E og F) Movat's pentachrome og elastin pletten afslører tilstedeværelsen af kollagen, fibrin, og elastin med intakt vaskulatur og bronkier. (G) DNA analyse viser en reduktion i DNA indhold på mere end 99%. (H) den cellulære lunge kan bruges direkte i en bioreaktor for cellekultur og (jeg) en histologisk analyse viser tilstedeværelsen af tumorvækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk diagram viser vigtigste trin i oprettelsen af modellens ex vivo 4-D lunge. I trin 1, er en hjerte-lunge blok høstet fra en rotte. Som pr undersøgelse krav, i trin 2, lungerne kan enten bruges direkte som en cellulær model eller kan være decellularized for at fjerne enhver indfødte celler. Det næste skridt indebærer oprettelse af lunge model i bioreaktor og celle såning. Endelig, bioreaktorer oprettet i inkubator for cellekultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo 4-D lunge giver mulighed for at studere tumorvækst og metastase i et laboratorium set-up. En indfødt lunge matrix er et komplekst system, der yder støtte til normale væv og bevarer celle-celle interaktioner, celle-matrix interaktioner, Celledifferentiering og væv organisation. Det giver mulighed for at tilføje tumor mikromiljø komponenter for at studere deres virkninger på tumorvækst og interaktion med andre celler.
Lunge høst er det afgørende skridt for modellens ex vivo 4-D lunge. En forsinkelse i at administrere heparin injektion efter thorax åbningen kan resultere i en blodprop i lungerne, som kan påvirke den frie strøm af reagenserne under decellularization. En ordentlig gennemskylning med heparinized PBS indtil en farveløs væske kommer fra udluftning er vigtig, især med den cellulære model. Omhyggelig skæring af den overlegne vena cava er vigtigt at undgå enhver skade på PA. Under decellularization processen er det meget vigtigt at undgå luftbobler flytter til lunge stillads. Tilstedeværelsen af luftbobler kan bremse eller stoppe strømmen af reagenser og bidrage til en forkert decellularization. Bobler kan fjernes ved at suge ud boblerne ved hjælp af en 10-20 mL sprøjte. Det er meget vigtigt at sørge for PA kanylen ikke er snoet. Under bioreaktor set-up, kan enhver vrid i slangerne resultere i en pop-up på stikkene og resultere i en komplet rod inde i rugemaskinen. For at undgå vrid i kanylen, kanyle/nåle kan skæres og tilkobles igen ved hjælp af biokompatible slanger, som giver den nødvendige til at rotere kanylen uden at forstyrre forbindelserne fleksibilitet. Enhver lækage af Kulturmedier inde i rugemaskinen kraeve yderligere en professionel rengøring. Mens du opretter metastase model, er omhyggelig suturering påkrævet ved luftrøret bifurcation site. Enhver punktering af lunger og luftrør kan føre til udsivning af celler og inkonsistente resultater.
Acellulær og cellulære ex vivo 4-D lunge modeller har flere fordele sammenlignet med konventionelle 3D cellekulturer til bedre at forstå kræft progression, da de giver mulighed for at studere de vigtigste biologiske trin i metastaser med en ekstra dimension af flow. Begge modeller efterligner biologi tumorvækst og metastaser og give mulighed for at indsamle tumorceller i forskellige faser af kræft vækst til bedre at forstå gen signaturer, svar på behandlinger og udviklingen af resistens over for lægemidler. Selv om det er en matrix, lunge, har det potentiale til at vokse en række etablerede cellelinier og primærelementer. Begrænsning af ex vivo 4-D modellen er kravet om > 10 millioner celler seeding for at studere metastaser. Celler med en lav proliferativ potentiale kan tage længere tid at vise den metastatisk læsion. Desuden, kræver denne model mere aseptiske betingelser når cellerne udsås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Min P. Kim modtaget tilskud fra den anden John W. Kirklin forskning Scholarship, American Association for thorax kirurgi, Graham Research Foundation, Houston Methodist speciale læge Group Grant, og Michael M. og Poul H. kegle Research Award. Vi takker Ann Saikin for sprog redigering af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dowley rat | Harlan | 206M | Male |
| Chlorhexidine swab | Prevantics, NY, USA | NDC 10819-1080-1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA | NDC 25021-400-10 | |
| 18-gauge needle | McMaster Carr, USA | 75165A249 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, San Angelo, TX, USA | A305H | |
| Masterflex L/S pump | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07554-80 | |
| Masterflex L/S pump head | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-05 | |
| Masterflex L/S pump cartridge | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-70 | |
| Tygon Tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 14171211 | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-16 | |
| Female luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-34 | 75165A249 |
| Male luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45513-04 | |
| black nylon ring | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-45509-04 | |
| Intravenous set | CareFusion | 41134E | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | CAS151-21-3 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Silicone oxygenator | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | ABW00011 | Saint-GoBain- |
| Wire mesh | 1164610105 | Lowes | New York Wire |
| Female luer Lug Style TEE | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-56 | |
| Male luer integral lock ring to 200series Barb | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45518-08 | |
| Female luer thread style coupler | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-22 | |
| Clave connector | ICU Medical | 11956 | |
| Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock | smith Medical | MX9341L | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-13 | for cannula |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A.
- Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- Bissell, M. J., Hines, W. C. Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression. Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture. PloS One. 7 (9), e45308 (2012).
- Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).
- Mishra, D. K., et al. Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).
- Mishra, D. K., et al. Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis. The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules. The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).
- Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model. Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).
- Mishra, D. K., et al. Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model. The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).
- Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model. BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).
