Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine ex Vivo Lunge Krebs Modell, die imitiert die Schritte der Tumorprogression und hilft, um einen Primärtumor zu isolieren, zirkulierende Tumorzellen und metastatischen Läsionen.
Abstract
Es ist schwierig, Tumorzellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Tumorprogression zu isolieren. Wir haben eine ex Vivo Lunge Modell, die das Zusammenspiel von Tumorzellen mit einer natürlichen Matrix und kontinuierlicher Strom an Nährstoffen zeigen kann, sowie ein Modell, das die Interaktion von Tumorzellen mit normalen zellulären Komponenten und eine natürliche Matrix zeigt. Die azellulären ex Vivo Lunge Modell wird durch eine Ratte Herz-Lungen-Block zu isolieren und entfernen alle Zellen, die mit dem Decellularization-Verfahren erstellt. Die rechten Bronchus abgebunden und Tumorzellen werden durch eine Spritze in der Luftröhre platziert. Die Zellen bewegen und die linke Lunge zu füllen. Die Lunge befindet sich dann in einem Bioreaktor, der Lungenarterie einen kontinuierlichen Fluss von Medien in einem geschlossenen Kreislauf erhält. Der Tumor auf die linke Lunge angebaut ist der Primärtumor. Die Tumorzellen, die in den zirkulierenden Medien isoliert werden Tumorzellen im Umlauf sind und die Tumorzellen in der rechten Lunge sind metastatischen Läsionen. Das zelluläre ex Vivo Lunge Modell entsteht durch das Auslassen des Decellularization-Prozesses. Jedes Modell kann verwendet werden, um verschiedene Forschungsfragen zu beantworten.
Introduction
Krebsmetastasen ist der Schuldige hinter den meisten krebsbedingte Todesfälle und stellt die ultimative Herausforderung bei den Bemühungen zur Bekämpfung von Krebs. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Protokoll für eine vierdimensionale (4D) Zellkultur zu entwerfen, die eine Dimension des Flusses, neben dem dreidimensionalen (3D) Zelle Wachstum hat. Es steht für die drei Phasen des Prozesses Metastasen [d.h., der Primärtumor, zirkulierende Tumorzellen (CTC) und metastatischen Läsionen].
In den letzten drei Jahrzehnten brachte Wissenschaftler auf der ganzen Welt eine unvergleichliche Fülle von Informationen zu verstehen, die Mechanismen der metastatischen Progression bei verschiedenen Krebsarten, die die Aussicht auf eine Heilung oder progressionsfreie Überleben verbessert. Deutlich verbessert die klinische Behandlung von einigen Krebsarten wie Brustkrebs,1; Einige Krebsarten wie Lungenkrebs, haben jedoch noch eine schlechte überleben2. In Vitro und in Vivo Tiermodellen haben maßgeblich bei der Schaffung von neuen Erkenntnisse über die Mechanismen, die die Entwicklung der Krankheit zugrunde liegen. In den letzten Jahren Zell-Linie abgeleitet Xenotransplantate (CDX) und Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDX) wurden von größerem Interesse, da sie viele relevanten Merkmale des menschlichen Primärtumor3, z. B. Wachstum Kinetik, histologischen Merkmale, Verhalten bewahren Merkmale und das Ansprechen auf die Therapie. Jedoch hat jedes Modell seine Grenzen zum Verständnis des Mechanismus der CTC-Bildung und Metastasen in entfernten Organ4,5,6.
Vor kurzem haben wir ein 4-D- ex Vivo Lunge Krebs Modell durch die Verwendung von des Konzepts der Orgel reengineering und Perfusions-basierte Zellkultur entwickelt. Es ahmt die menschliche Lunge-Krebs-Wachstum durch die Bildung von perfusable Tumor Knötchen, die im Laufe der Zeit, mit einem ähnlichen menschlichen Krebs abgesondert wachsen Protein Produktion7. Es repräsentiert die Gen-Ausdruck-Signatur, die prognostiziert schlechte Überlebensrate bei Patienten mit Krebs und zeigt auch eine therapeutische Antwort von Tumor-Regression auf Cisplatin Behandlung8,9. Die Lunge-Modell wurde weiter modifiziert, so dass es metastatische Läsionen bilden kann. Die CTCs entwickeln sich aus einem Primärtumor und Intravasate in das Gefäßsystem und Leber in die kontralaterale Lunge metastatischen Läsionen10zu bilden. Genexpressionsstudien empfehlen eine ausgeprägte Expressionsprofil des Primärtumors, CTCs, und die metastatischen Läsionen und die Hochregulation der Teilmenge von Genen, die für den Phänotyp10erforderlich. Dieser metastatischen Prozess erfolgt aufgrund des Vorhandenseins von biologischen Bedingungen bei Patienten mit Krebs gesehen. Der Vorteil dieses Modells ist das Vorhandensein einer natürlichen Matrix und Architektur und eine Perfusion der Nährstoffe, die zur Bildung von Knötchen Tumor führt. Darüber hinaus gibt es auch Gelegenheit, die Auswirkungen der verschiedenen Komponenten des Tumors Mikroumgebung oder Drogen auf Tumorprogression im Laufe der Zeit zu studieren. Dieses Modell kann verwendet werden, um einen Zellbereich Krebs (Lungenkrebs, Brustkrebs, Sarkom etc.) in einem Labor zu wachsen.
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Protocol
Die Protokolle für Tierversuche wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Houston Methodist Research Institute genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit allen Vorschriften, Gesetze, Richtlinien und Richtlinien.
1. Rat Lunge Ernte
- Ein 4 bis 6 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley Ratten durch eine intraperitoneale (IP) Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) in seine Flanke zu betäuben. Narkose durch die Suche nach einer Abwesenheit von Bewegung bei die hinteren Gliedmaßen Zehe mit Zange gequetscht ist zu gewährleisten.
- Rasieren Sie nach 10 min, Brust und Bauch und wischen Sie die Haut mit einem Chlorhexidin-Tupfer.
- Abziehen Sie die Haut, indem Sie es sich mit der Pinzette und mit einem Einweg Skalpell einritzen. Führen Sie nach der Eröffnung der Brusthöhle durch Eingrabung mit Skalpell eine bilaterale Thorakotomie von der vorderen Seite des Brustkorbes auf der linken und der rechten Seite der Membran mit einer Schere schneiden.
Hinweis: Dies ist eine Operation nicht überleben. - Halten Sie den Brustkorb und Spritzen Sie 2 mL Heparin (1.000 Einheiten/mL) in die Rechte Herzkammer des schlagenden Herzens mit Hilfe einer Nadel 27 G.
Hinweis: Dies wird Bildung von Blutgerinnseln in der Lunge verhindern. - Vollständig zu entfernen Sie den Brustkorb mit einer Schere und platzieren Sie eine 18 G-Nadel in der linken Herzkammer wie ein Schlot, bis Blut herauskommt. Dann Spritzen Sie 15 mL heparinisierten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (12,5 Einheiten/mL; heparinisierten PBS) in die Rechte Herzkammer mit einer 25 G Nadel.
- Schneiden Sie der minderwertigen und überlegenen Vena Cava, zwei große Venen auf der rechten Seite des Herzens, und spülen Sie die Lunge mit einer zusätzlichen 10 mL heparinisierten PBS in der rechten Herzkammer mit einer 27 G Nadel.
Hinweis: Die minderwertige Vena Cava ist unter dem Boden des Herzens als eines großen Schiffes visualisiert mit rotem Blut gefüllt. Ebenso ist die überlegene Vena Cava im oberen Teil des Herzens als eines großen Schiffes visualisiert. - Schneiden Sie die Luftröhre, an der Basis der Schilddrüse. Entfernen Sie vorsichtig die absteigende Aorta auf der Ebene der Truncus Vene und Äste der Aorta am Arch.
- Nehmen Sie die Herz-Lungen-Block aus der Brusthöhle und dem Rest des Körpers Ratte.
- Führen Sie Ventriculotomy durch Schneiden, die Hälfte der rechten und linken Ventrikel und legen Sie eine maßgeschneiderte vorgefüllten 18 G Edelstahl-Nadel Kanüle durch den rechten Ventrikel in den wichtigsten Pulmonalarterie (PA).
- Sichern Sie die Kanüle mit einer 2: 0-Seidenkrawatte und setzen Sie sorgfältig den rechten Ventrikel und Atrium.
- Legen Sie ein weiblicher Luer-SCHOTT in der linken Herzkammer und sichern Sie es mit einer 2: 0-Seidenkrawatte.
- Spülen Sie die Herz-Lungen-Block mit 20 mL heparinisierten PBS durch die PA-Kanüle und legen Sie sie in ein 50 mL-Tube mit Nährmedien oder heparinisierten PBS.
Hinweis: Gehen Sie zu Schritt 3.1 Einrichten des Bioreaktors, für ein Handy-Modell. Fahren Sie bei einem azellulären Modell mit Schritt 2.1 für die Decellularization.
2. Lunge Decellularization
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Vorbereitung des Referats decellularization
- Bereiten Sie jede Decellularization Kammer/Flasche durch piercing zwei Löcher in die Kronkorken und schnappte ein weiblichen Luer in die Löcher (Abb. 1A und 1 b). Sichern Sie ihn mit einem schwarzen Nylon-Ring auf der anderen Seite. In ähnlicher Weise, Bohren Sie ein einziges Loch in ein anderes Kronkorken für die intravenöse Set Anlage (Abbildung 1).
Hinweis: Abbildung 1A und 1 b sind von der gleichen Kronkorken von zwei verschiedenen Seiten. Abbildung 1 ist eine andere Kappe mit einem Loch im Schritt 2.1.1 dargelegten. - Legen ein 0,5 Zoll Rohr (in der Lungenarterie oder PA-Ende) und 6-Zoll-Rohre (Abbildung 1J) auf einen weiblichen Luer von innen die Kronkorken (Abbildung 1A und 1 b) und befestigen Sie einen männlichen Luer-Lock an den Enden. Legen Sie die Sperre mit einer 500 mL Flasche, als der Decellularization Kammer/Flasche.
- Schließen Sie ein Ende der zwei Röhren von 2 ft (verbunden mit einem männlichen Luer-Lock) an beiden Enden der Pumpenrohr (Abbildung 1 H), die auf den Pumpenkopf (Abbildung 1E und 1F) mit einer Patrone (Abbildung 1) mit einem weiblichen Luer befestigt wird Sperre (Abbildung 1I).
- Verbinden Sie die anderen Enden der 2 ft Röhren (von Schritt 2.1.3) jeweils zu einem weiblichen Luer Lock Kopf auf die Decellularization Kammer/Kronkorken (Abbildung 1 L).
- Richten Sie ein 250 mL heparinisierten PBS Flasche (mit 200 mL PBS) durch den Strang einer umgekehrten Flasche auf einem Ständer mit dem proximalen Ende des Fahrgast-/intravenöse (Abbildung 1), eingefügt in die Kronkorken und dem distalen Ende, verbunden mit der Decellularization c 2 ft-Rohr zu ersetzen Hamber/Flasche PA Ende (Abbildung 1 b). Schließen Sie diese 2 ft Schlauch bis zur Flasche entsorgen.
Hinweis: Die Flaschen werden im Karton, festgelegt, wie in Abbildung 1 Kdargestellt. Die intravenöse Rohre kommen aus den hängenden Flaschen Reagenzien in der Lunge Gerüst zu verzichten.
- Bereiten Sie jede Decellularization Kammer/Flasche durch piercing zwei Löcher in die Kronkorken und schnappte ein weiblichen Luer in die Löcher (Abb. 1A und 1 b). Sichern Sie ihn mit einem schwarzen Nylon-Ring auf der anderen Seite. In ähnlicher Weise, Bohren Sie ein einziges Loch in ein anderes Kronkorken für die intravenöse Set Anlage (Abbildung 1).
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Lung Decellularization Prozess
- Laufen Sie die heparinisierten PBS bei einem physiologischen Durchblutung Druck von 30 mm Hg (Abbildung 1 K), bis es frei in der Decellularization Kammer/Flasche fließt und dann befestigen Sie die Herz-Lungen-Block bis zum PA-Ende durch die PA-Kanüle.
- Zu halten, läuft die Pumpe ständig, so dass überschüssige Pufferlösung in der Decellularization Kammer/Flasche verworfen wird.
- PA für 15 min bei einem Perfusionsdruck von 30 mm Hg für den ersten Waschgang (Abbildung 1 K) durchlaufen Sie heparinisierten PBS.
- Ersetzen Sie die heparinisierten PBS-Flasche mit 0,1 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in entionisiertem Wasser und Durchspülen der Lungenkrebs für 2 h für die Decellularization.
- Perfundieren Sie nach der Decellularization deionisiertes autoklaviert Wasser durch die Lunge Gerüst für 15 Minuten.
- Dann perfundieren Sie 1 % nicht-ionische Waschmittel in entionisiertem Wasser für 10 Minuten.
- Ersetzen Sie die Decellularization Kammer/Flasche mit 500 mL autoklaviert PBS mit 1 X Antibiotika (Penicillin-Streptomycin Amphotericin) ergänzt die hängenden Lunge in der Flasche mit dem Deckel intakt zu halten.
- Entsorgen Sie die intravenöse richten, habe das 2 ft Rohr befestigt an den Entsorgung Container zurück zur Lungenarterie Ende der Decellularization Kammer, und führen Sie die Pumpe mit 6 mL/min (Abbildung 1 L).
- Durchspülen Sie der Lunge für 72 h und wechseln Sie die PBS mit Antibiotika alle 12 h.
Hinweis: Die azelluläre Lunge ist sofort einsatzbereit. Es kann bei-80 ° c bis benötigt gespeichert werden. Wenn Rosa Flecken oder Blutgerinnseln deutlich in die Lungenlappen visualisiert werden können, entsorgen Sie die Lunge. Es ist möglich, nach dem Zufallsprinzip für DNA oder Histopathologie zu testen. Eine komplette azelluläre Lunge wird nicht angezeigt, dass Zellen und 99,9 % der DNA abgewaschen.
Hinweis: Beim Arbeiten mit einem zellulären Lunge Modell überspringen der Decellularization. Die geerntete Lunge (Schritt 1) kann direkt im Bioreaktor eingestellt werden.
(3) Bioreaktor-Set-up
- Bereiten Sie die Bioreaktor-Flasche und die Elemente für den Aufbau benötigt.
- Drei Bohrungen in einem 500 mL-Flasche in gleicher Entfernung und einer weiblichen Luer in alle drei Löcher, mit schwarzem Nylon Ringe (Abb. 2A und 2 b) zu beheben.
Hinweis: In beiden Löchern endet die Luer-Lock Gesicht außen, während ein Ende das Innere der Flasche zeigt. - Schneiden Sie eine 6 im Pumpenrohr, eine 2 im Rohr, eine 6 im Rohr, ein Schlauch 1,5 ft, eine 2 ft Rohr und eine 10 ft Oxygenator pro Bioreaktor.
- Schneiden ein 18 G Edelstahl-Nadel und wieder, verbinden Sie die Enden mit biokompatiblen Rohre für eine Trachealkanüle Kanüle.
- Wickeln Sie das Rohr Oxygenator mit Luer Lock Konnektoren an den Enden auf einem Magnetventil Drahtgeflecht mit Autoklav Bänder (Abbildung 2).
- Autoklaven der oben genannten Elemente und halten Sie sie im UV Licht für 10 min.
- Drei Bohrungen in einem 500 mL-Flasche in gleicher Entfernung und einer weiblichen Luer in alle drei Löcher, mit schwarzem Nylon Ringe (Abb. 2A und 2 b) zu beheben.
- Richten Sie die Pumpe in die regelmäßige Zelle Kultur brutmaschine (37 ° C, 5 % CO2) mit richtigen Abstand zwischen den Fächern, eine 500 mL Flasche passt.
- Die Pumpe Patrone Sprühen Sie 70 % Äthanol auf und schließen Sie die Pumpe Schlauch mit Luer Lock Buchsen an beiden Enden an der Pumpe.
- Richten Sie die Oxygenator umwickelt das Magnetventil Drahtgeflecht in die Zelle Kultur brutmaschine indem das Pumpenrohr und das andere Ende mit dem 1,5 ft Rohr im Bioreaktor ein Ende (Abfluss) der Oxygenator anschließen.
- Richten Sie die Bioreaktor-Flasche in eine biologische Kabinett mit aseptischen Bedingungen.
- Befestigen Sie ein 3-Wege-Hahn (gelb) auf den Kopf eines weiblichen Luer Steuerung durch PA.
- Schließen Sie ein One-Way-Absperrhahn (blau) an einen anderen weiblichen Luer Lock SCHOTT für Zelle Aussaat durch die Luftröhre (Abb. 2F).
- 2 im Schlauch auf der Außenseite zu verbinden (weiß) und 6 im Schlauch auf der Innenseite der Flasche zu die Medien, zu zirkulieren. Passen Sie einen männlichen Luer Lock zu einem Schlauch 2 ft und befestigen Sie einen weiblichen Luer Lug Stil Tee bieten Zugang zum Hinzufügen oder entfernen alles.
- Legen Sie ein One-Way-Absperrhahn auf eine Öffnung des Dreiwege Steckers (weiblichen Luer Lug Stil Tee).
- 2 ft Röhren einen männlichen Luer Lock und einem weiblichen Luer Lock zuordnen.
- Fügen Sie 200 mL RPMI1640 mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika Zellkulturmedium (variiert je nach Anforderung der Zelle) und übertragen Sie des Bioreaktors in den Inkubator zu. Schließen Sie die Oxygenator Schlauch an die beiden offenen Enden (One-Way-Absperrhahn und Tee Connector) einen geschlossene Bioreaktor zu machen.
- Pre-laufen Sie die Pumpe mit 6 mL/min in die Zelle Kultur brutmaschine mit Zellkulturmedien Oxygenator und Röhren, füllen, damit keine Luftblasen im Schlauch vorhanden.
- Nachdem die Rohre mit Medien befüllt sind, schließen Sie den Absperrhahn und entfernen Sie die Bioreaktor-Flasche aus dem Inkubator durch Trennen der Oxygenatoren von beiden Enden der Bioreaktor-Flasche.
- Setzte die Bioreaktor-Flasche in der Biosicherheit Kabinett, Nährmedien durch den Absperrhahn übergeben, und der Hahn durch den Luer-Anschluss-Stecker PA Kanüle von der Lunge Gerüst (azellulärer oder zellulären) zuordnen.
Hinweis: Hier ist es möglich, die azellulären Modell (nach dem Decellularization-Verfahren) oder eine frisch geerntete Herz-Lungen-Block zu verwenden (d. h., die zellulären Modell, wie es behält die native rattenzellen). - Übergeben Sie Kultur Medien durch ein One-Way-Absperrhahn Luft zu entfernen und binden die trachealen Kanüle durch einen Seidenfaden zur Trachea.
- Achten Sie darauf, um zu vermeiden, Verdrehung der PA und der Trachea. Nahe der Bioreaktor-Flaschenverschluss mit der Lunge Gerüst im Inneren wieder aseptisch des Bioreaktors in den Inkubator zu übertragen und starten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 6 mL/min.
- Führen Sie Kulturmedien für 10-15 min um sicherzustellen, dass alle Lappen bekommen aufgeblasen und die Lunge sieht in guter Form (Abbildung 2).
(4) Metastasen Modell und Cell Seeding
Hinweis: Fahren Sie auf die Zelle mit dem oben genannten Lunge Modell für einen Primärtumor WACHSTUMSSTUDIE Aussaat. Ändern Sie die Lunge Gerüst (azellulärer oder zellulären) wie folgt für die metastatische Modell.
- Nehmen Sie den Bioreaktor mit der Lunge Gerüst aus dem Inkubator und steckte es in die Biosicherheit Kabinett.
- Verwenden Sie eine Luer-Lock-Spritze 5 mL Kultur Medien über die Luftröhre und öffnen Sie die Bioreaktor-Kappe mit den hängenden Lunge Gerüst (Abb. 2F).
- In diesem Schritt muss eine weitere Person in der Modifikation von der Lunge zu einem metastasierendem Modell helfen.
- Bekommen Sie Seide 2-0 bereit und eckige Zange verwenden, um einen Pass durch die Luftröhre am Gabelung Punkt zu machen.
- Binden Sie die Luftröhre gonna die Rechte Lunge an der Bifurkation Stelle und überprüfen Sie den freien Fluss der Medien durch die Luftröhre, die linke Lunge vorbei Nährmedien.
Hinweis: Sobald die Luftröhre an der Bifurkation Stelle gebunden ist, werden Zellen ausgesät durch die Luftröhre automatisch zu säen, die linken Lappen weitergeleitet. Es kann vor der Aussaat der Zellen durch Druck Kultur Medien durch die Luftröhre getestet werden. Im metastasierten Modell bewegt sich die Medien auf den linken Lappen, die aufgeblasen werden, und nicht auf den rechten Lappen10. - Eine 20 mL Luer Lock Spritze auf die Trachealkanüle Kanüle und fügen Sie ATCC Lungenkrebszellen (A549, H1299) in 50 mL RPMI1640 komplette Nährmedien (Abb. 2F).
- Führen Sie die Zelle, die Aussaat in der Biosicherheit Kabinett. 15 mL von Zellen in der Spritze und lassen Sie es durchlaufen die Lungenlappen durch die Schwerkraft. Fügen Sie den Rest der Zellen, bevor eventuelle Luftblasen durchlaufen.
- In azellulärer Lunge Aussaat, tropfte in den Bioreaktor Flasche PERFUNDIERTEN Medien sammeln Sie und lassen Sie es durchlaufen die Luftröhre wieder 3 X.
Hinweis: Die PERFUNDIERTEN Medien hat manchmal die Krebszellen ausgesät. Daher für die effiziente Saat, setzen Sie wieder die Medien wieder in der Luftröhre durch die Spritze. - Einmal ausgesät, ziehen Sie die Spritze, 15 min. warten frische Medien hinzufügen und des Bioreaktors Inkubator wieder zurückzukehren. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen im Schlauch.
- Starten der Pumpe, damit die Medien mit 6 mL/min durchspülen.
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Representative Results
Die Lunge von Ratte geerntet unterhält die intakte Gefäßsystem Alveolen11 (Abb. 3A und 3 b). Auf Decellularization sind die extrazelluläre Matrix Komponenten eine azelluläre Lunge, wie Kollagen, Fibronektin und Elastin,11 (Abbildung 3, 3D, 3Eund 3F) erhalten. Die Decellularization führt zu eine vollständige Entfernung der einheimischen rattenzellen in der Lunge, die durch Hämatoxylin und Eosin (H & E) zu beobachten ist Färbung zeigt das Fehlen von Zellen und durch DNA-Analyse11 zeigt eine Reduktion in DNA-Menge ( 3D Abbildung und 3 G). Der ex-Vivo 4-D Lunge Modell kann verwendet werden, um jede Art von adhärenten Zellen12wachsen. Lung Fibroblast, Lungenkrebs, Brustkrebs und Sarkom Zellen wurden durch Aussaat durch die Luftröhre11,12,13angebaut. Metastasen-Modell ermöglicht die Sammlung von primären Tumorgewebe, CTCs und metastatischen Läsionen in unterschiedlichen Zeitabständen durch Lobektomie10. Die H & E Färbung der Gewebe zeigte intaktes Gefäßsystem und Alveolen in das zelluläre und azellulärer Modell (Abbildung 3 H und 3I). Die azellulären 4-D Lunge Modell ist ein Add-on, das Zusammenspiel der verschiedenen Komponenten von der Mikroumgebung zu studieren. Das zelluläre 4-D-Lunge-Modell bietet eine intakte Lunge Mikroumgebung mit Immunzellen14. Immunzellen können dieses Modell durch das Gefäßsystem, ihre Wirkung auf das Tumorwachstum und die Interaktion mit Tumorzellen zu studieren hinzugefügt werden. Reproduzierbarkeit und Qualität des Modells können durch Ausführen des Modells in zweifacher Ausfertigung und analysieren die Gewebezellen von H & E und Immunohistochemistry mittels zellspezifische Marker bewertet werden. Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung, die die wichtigsten Schritte beim Erstellen der ex Vivo 4-D Lunge Modell darstellt.
Abbildung 1: erforderliche Teile für die Decellularization Einheit der Lunge Gerüst. (A und B) 500 mL Flasche Kappen sind gebohrt und Luer-Anschluss-Buchsen sind eingerichtet mit Schlauch Decellularization Flaschen zu erstellen. (C) eine weitere Flasche braucht nur ein Loch (D) die intravenöse set für Reagenz fließt durch die Lungenarterie Lunge Gerüst einrichten. Die Pumpe ist mit (F) eine Pumpe (E) ein Pumpenkopf und (G) eine Patrone eingerichtet. (H) Pumpe Schlauch mit Luer-Anschluss-Buchsen an jedem Ende, (ich) Anschlüsse und (J) Rohre mit männlichen Luer Steckern an beiden Enden erforderlich sind, um (K) das Decellularization-Gerät einrichten. (L) der Lunge Gerüste sind für 3-5 d in einem geschlossenen System mit 1 X Antibiotika-antimykotikums PBS gewaschen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Bioreaktor Set-up für eine ex Vivo 4-D Lunge Zellkultur. (A und B) Bioreaktor Kronkorken (500 mL) gebohrt und drei weiblichen Luer Lock Konnektoren sind eingelegt und fixiert mit einem schwarzen Nylon-Ring. (C) 10 ft Oxygenator Rohr wird um ein Drahtgeflecht Magnetventil mit männlichen Luer integraler Sicherungsringe an beiden Enden gewickelt. (D) eine Lungenarterie Kanüle und (E) eine Trachealkanüle Kanüle werden mit einem 18 G Nadel und Pumpe Rohr zubereitet. (F) A 20 mL Spritze soll mit dem One-Way-Luftröhre Anschluss die Zellen epithelialen innerhalb der Lunge Gerüst zu säen. (G) ist der geschlossene Bioreaktor in die Zelle Kultur brutmaschine für Durchblutung und Tumorwachstum eingerichtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder des ex-Vivo 4-D Lunge Modells für Metastasierung. (A) ein intaktes Herz-Lungen-Block von 4 bis 6 Wochen alte Ratte geerntet wird. (B) Histopathologie zeigt die Alveolen und Pneumozyten. (C) Decellularization führt zu die vollständige Entfernung der Lungenzellen. (D) Histopathologie zeigt eine intakte Basalmembran mit azellulärer Lungen. (E und F) Movats Pentachrome und Elastin Fleck zeigt die Anwesenheit von Kollagen, Fibrin und Elastin mit intakten Gefäßsystem und Bronchus. (G), DNA-Analyse zeigt einen Rückgang in der DNA-Gehalt von mehr als 99 %. (H) der zellulären Lunge kann direkt im Bioreaktor für die Zellkultur verwendet werden und (ich) eine histologische Analyse zeigt die Anwesenheit des Tumorwachstums. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Schematische Darstellung zeigt die wichtigsten Schritte bei der Erstellung von ex-Vivo 4-D Lunge Modell. In Schritt 1 wird ein Herz-Lungen-Block von einer Ratte geerntet. Wie pro die Anforderung der Studie, in Schritt 2 die Lunge können entweder direkt als zelluläre Modell verwendet werden oder können decellularized werden, um keine native Zellen zu entfernen. Der nächste Schritt beinhaltet die Einrichtung der Lunge-Modell in den Bioreaktor und Zelle zu säen. Zu guter Letzt werden Bioreaktoren im Brutschrank für die Zellkultur eingerichtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die ex-Vivo 4-D Lunge bietet die Möglichkeit, Tumorwachstum und Metastasierung in einem Labor zu untersuchen. Eine native Lunge-Matrix ist ein komplexes System, das unterstützt normalgewebe und Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Matrix Interaktionen, Zelldifferenzierung und Gewebe Organisation unterhält. Es bietet Gelegenheit, fügen Sie jeder Tumor Mikroumgebung Komponenten, um ihre Auswirkungen auf das Tumorwachstum und die Interaktion mit anderen Zellen zu studieren.
Die Lunge-Ernte ist der entscheidende Schritt für das 4-D Lunge ex Vivo Modell. Eine Verzögerung bei der Verwaltung der Heparin-Injektion nach der thorakalen Eröffnung führen ein Blutgerinnsel in der Lunge, die den freien Fluss der Reagenzien während der Decellularization beeinträchtigen können. Eine richtige Spülung mit heparinisierten PBS, bis eine farblose Flüssigkeit aus dem Schlot kommt ist wichtig, vor allem mit dem zellulären Modell. Das sorgfältige schneiden die überlegene Vena Cava ist wichtig zur Vermeidung von Schäden an der PA. Während des Decellularization Prozesses ist es sehr wichtig, Umzug in die Lunge Gerüst Luftblasen zu vermeiden. Das Vorhandensein von Luftblasen möglicherweise verlangsamen oder stoppen Sie die Strömung von Reagenzien und dazu beitragen, eine falsche Decellularization. Luftblasen können entfernt werden, durch das Saugen sich die Bläschen mit einer 10-20 mL-Spritze. Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die PA-Kanüle nicht verdreht ist. Während des Setup Bioreaktor kann jedes drehen im Schlauch in einem Popup-Fenster an den Steckern und führen ein völliges Durcheinander in die brutmaschine. Um zu vermeiden, drehen in die Kanüle, Kanülen/Nadeln kann geschnitten werden und wieder mit biokompatiblen Schläuche, sorgt für die erforderliche Flexibilität, um die Kanüle zu drehen, ohne die Verbindungen zu stören. Undichtigkeiten von Kulturmedien in die brutmaschine kann zusätzliche verlangen eine professionelle Reinigung. Während der Erstellung der Metastasierung-Modell, ist die sorgfältige Nähen an der Luftröhre Bifurkation Stelle erforderlich. Eine Punktion der Lunge oder Luftröhre kann führen, um das Austreten von Zellen und inkonsistente Ergebnisse.
Die azellulären und zellulären ex Vivo 4-D Lunge Modelle haben mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen 3D Zellkulturen Tumorprogression, besser zu verstehen, da sie die Möglichkeit bieten, die wichtigsten biologischen Schritte in Metastasen mit zusätzlicher studieren Dimension der Strömung. Beide Modelle bieten die Möglichkeit, die Tumorzellen in verschiedenen Phasen der Krebswachstum, besser zu verstehen, die Gen-Signaturen, die Reaktion auf die Behandlungen und die Entwicklung von Resistenzen zu sammeln und die Biologie des Tumorwachstum und Metastasierung nachahmen. Obwohl es eine Lunge Matrix ist, hat es das Potenzial, eine Reihe von etablierten Zelllinien und Primärzellen wachsen. Die Begrenzung der ex Vivo 4-D-Modell ist die Anforderung von > 10 Millionen Zellen Aussaat um die Metastasen zu untersuchen. Die metastatische Läsion zeigen können Zellen mit einem niedrigen proliferative Potential länger dauern. Darüber hinaus erfordert dieses Modell mehr aseptische Bedingungen, sobald die Zellen ausgesät werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Min. P. Kim erhalten Zuschüsse aus der zweiten John W. Kirklin Forschungsstipendium, American Association for Brust-Chirurgie, Graham Foundation, Houston Methodist Spezialität Arzt Forschungsgruppe Grant, und Michael M. und Joann H. Kegel-Forschungspreis. Wir danken Ann Saikin für die Sprache Bearbeitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dowley rat | Harlan | 206M | Male |
| Chlorhexidine swab | Prevantics, NY, USA | NDC 10819-1080-1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA | NDC 25021-400-10 | |
| 18-gauge needle | McMaster Carr, USA | 75165A249 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, San Angelo, TX, USA | A305H | |
| Masterflex L/S pump | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07554-80 | |
| Masterflex L/S pump head | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-05 | |
| Masterflex L/S pump cartridge | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-70 | |
| Tygon Tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 14171211 | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-16 | |
| Female luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-34 | 75165A249 |
| Male luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45513-04 | |
| black nylon ring | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-45509-04 | |
| Intravenous set | CareFusion | 41134E | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | CAS151-21-3 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Silicone oxygenator | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | ABW00011 | Saint-GoBain- |
| Wire mesh | 1164610105 | Lowes | New York Wire |
| Female luer Lug Style TEE | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-56 | |
| Male luer integral lock ring to 200series Barb | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45518-08 | |
| Female luer thread style coupler | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-22 | |
| Clave connector | ICU Medical | 11956 | |
| Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock | smith Medical | MX9341L | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-13 | for cannula |
References
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