Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

मल्टीप्लेक्स चिकित्सकीय दवा की निगरानी आइसोटोप द्वारा-कमजोर पड़ने HPLC-ms/गंभीर बीमारियों में एंटीबायोटिक दवाओं के एमएस/

doi: 10.3791/58148 Published: August 30, 2018

Summary

यहाँ हम गहन देखभाल इकाइयों में अक्सर इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं के ठहराव के लिए एक मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटोकॉल वर्तमान, अर्थात् cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, और piperacillin.

Abstract

कई नैदानिक सुविधाओं में एंटीबायोटिक दवाओं के चिकित्सीय दवा की निगरानी के लिए एक बढ़ती मांग है, विशेष रूप से अस्पताल एंटीबायोटिक नेतृत्व कार्यक्रमों के कार्यांवयन के संबंध में ।

वर्तमान कार्य में, हम cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, और piperacillin के ठहराव के लिए एक मल्टीप्लेक्स उच्च-प्रदर्शन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीसीएल-ms/ms) प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, सामांयतः गहन देखभाल इकाइयों में एंटीबायोटिक दवाओं । विधि पहले व्यापक यूरोपीय दवाओं एजेंसी के दिशानिर्देश के अनुसार मांय किया गया था ।

एक तेजी से नमूना सफाई के बाद, analytes 4 मिनट के भीतर एक C8 रिवर्स चरण HPLC स्तंभ पर अलग कर रहे हैं और इसी स्थिर आइसोटोप के साथ quantified-electrospray ionization में आंतरिक मानकों लेबल (ईएसआई +) जन स्पेक्ट्रोमेट्री में कई प्रतिक्रिया समय निगरानी (MRM) । प्रस्तुत विधि वर्दी क्रोमेटोग्राफिक शर्तों के साथ एक सरल इंस्ट्रूमेंटेशन सेटिंग का उपयोग करता है, नैदानिक प्रयोगशालाओं में दैनिक और मजबूत एंटीबायोटिक चिकित्सकीय दवा की निगरानी के लिए अनुमति देता है । अंशांकन वक्र pharmacokinetic एकाग्रता सीमा तक फैला है, जिससे एंटीबायोटिक मात्रा अतिसंवेदनशील बैक्टीरिया और पीक सांद्रता (सीअधिकतम) है कि बोल्स के साथ प्राप्त कर रहे है की ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) के करीब शामिल प्रशासन परहेजों । नमूना सफाई से पहले सीरम कमजोर पड़ने की आवश्यकता के बिना, एक प्रशासित एंटीबायोटिक के लिए वक्र के तहत क्षेत्र में कई माप के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है ।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

हालांकि एंटीबायोटिक दवाओं के अभ्यास में क्रांति ला दिया है, गंभीर जीवाणु संक्रमण रुग्णता और गंभीर बीमारियों में मृत्यु का एक प्रमुख कारण रहता है1। इस संबंध में, एक उपयुक्त विरोधी के त्वरित प्रशासन एक पर्याप्त खुराक में संक्रामक रोग नियंत्रण2के लिए ऊपरवाला महत्व का है.

सबूत के एक बढ़ती शरीर दर्शाता है कि व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के साथ अनुभवजंय उपचार रोगी आबादी की जटिलता के साथ तेजी से समस्याग्रस्त होता जा रहा है । यह गहन देखभाल इकाइयों के लिए विशेष रूप से सच है (आईसीयू), जहां कुंजी pharmacokinetic (PK) पैरामीटर की एक जबरदस्त अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता अक्सर3,4मनाया जाता है । तदनुसार, आईसीयू रोगियों उप चिकित्सकीय स्तर के आसंन जोखिम पर एक अपर्याप्त चिकित्सकीय सफलता5,6के खतरे के साथ कर रहे हैं । तो फिर, रोगियों को अनावश्यक रूप से अधिक उच्च एंटीबायोटिक सांद्रता कि कोई नैदानिक लाभ7के साथ गंभीर प्रतिकूल घटनाओं में परिणाम हो सकता है उजागर कर रहे हैं । दोनों एंटीबायोटिक दुरुपयोग और अपर्याप्त खुराक भी एंटीबायोटिक प्रतिरोध का प्रसार है, जो एक कभी बढ़ती जनता के स्वास्थ्य के लिए खतरा बन रहा है ईंधन है8

एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग में सुधार करने के लिए और उनके effectivenessas लंबे समय के रूप में संभव बनाए रखने के लिए, विश्व स्वास्थ्य संगठन २०१५9में रोगाणुरोधी प्रतिरोध पर एक वैश्विक कार्य योजना शुरू की है । एंटीबायोटिक नेतृत्व कार्यक्रम राष्ट्रीय सार्वजनिक स्वास्थ्य रणनीतियों10में विवेकपूर्ण रोगाणुरोधी उपयोग की एक अनिवार्य आधारशिला का गठन, चिकित्सकों की मदद करने के लिए रोगी की देखभाल की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए11 और, एक ही समय में, काफी एंटीबायोटिक प्रतिरोध को कम करने12. चिकित्सकीय दवा की निगरानी (TDM) के आवेदन के माध्यम से व्यक्तिगत रोगियों में रोगाणुरोधी खुराक13इस संदर्भ में एक महत्वपूर्ण साधन है.

तारीख करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TDM परख glycopeptide एंटीबायोटिक दवाओं और एमिनोग्लीकोसाइड्स के लिए ही उपलब्ध हैं । अंय वर्गों से पदार्थों की ठहराव सामांयतः एक में घर विधि विकास या मांयता है कि बोझिल हो सकता है की आवश्यकता है । हम, इसलिए, विस्तार से वर्तमान में एक मजबूत मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रोटोकॉल परख है कि उनके नैदानिक प्रासंगिक एकाग्रता के भीतर आईसीयू में सबसे अधिक प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है14पर्वतमाला । विधि हाल ही में हमारे जन स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा में स्थापित किया गया था और तब से आईसीयू में रूटीन TDM के लिए आवेदन किया गया है । प्रक्रिया एक समान नमूना सफाई के साथ एक सीधा और सरल विश्लेषणात्मक सेटिंग का उपयोग करता है, जन स्पेक्ट्रोमेट्री क्षमताओं के साथ कई सुविधाओं में एंटीबायोटिक TDM के तेजी से लागू करने के लिए अनुमति देता है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, और मानव सीरम में piperacillin के ठहराव के लिए अनुकूलित किया गया था, आइसोटोप कमजोर पड़ने तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा के साथ संयोजन में) का उपयोग कर एक मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (ms/ आइसोटोप कमजोर पड़ने के लिए-ms/एमएस पद्धति, स्थिर आइसोटोप-लेबल यौगिकों एक विशिष्ट मैट्रिक्स (जैसे, सीरम) के साथ ब्याज का एक नमूना करने के लिए जोड़ रहे हैं. आइसोटोप-लेबल मानकों उनके unlabel्ड समकक्ष से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, अर्थात् ब्याज की analyte, प्राकृतिक अणु के विभिन्न आणविक भार और उनके विखंडन उत्पादों के कारण, एक माता-पिता आयन-बेटी आयन संक्रमण का कार्यकाल. के रूप में आइसोटोप-लेबल यौगिकों एक लगभग समान समग्र भौतिक व्यवहार उनके unlabel्ड समकक्ष की तुलना में है, वे के लिए आदर्श आंतरिक मानक है एमएस/ms, एक उच्च डिग्री के साथ एक लगभग मैट्रिक्स-स्वतंत्र analyte ठहराव की अनुमति सटीकता15. आजकल, कई स्थिर आइसोटोप-लेबल आंतरिक मानकों कि छोटे अणु ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, रोगाणुरोधी के TDM सहित, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.

वर्णित प्रोटोकॉल में एंटीबायोटिक analytes के क्रोमेटोग्राफिक जुदाई एक विश्लेषणात्मक C8 alkyl-श्रृंखला-लंबाई रिवर्स चरण कॉलम (१०० मिमी x २.१ मिमी, 3 µm कण-आकार) के साथ किया जाता है । विधि के विकास के दौरान, सभी analytes के लिए आंतरिक मानक सामान्यीकृत मैट्रिक्स कारक ९४.६% और १०५.४% के बीच था, ≤ ८.३%14के रूपांतर के गुणांक के साथ ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

नोट: यह एक धुएं डाकू में काम जब कार्बनिक विलायक, मेथनॉल जैसे हैंडलिंग की सिफारिश की है । volumetric कुप्पी में सभी बफ़र्स और मोबाइल चरणों को तैयार करें । यदि अंयथा निर्दिष्ट नहीं है, समाधान के कमरे के तापमान पर 1 महीने के लिए तैयार करने के बाद संग्रहित किया जा सकता है ।

1. औजारों और गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों की तैयारी

नोट: स्टॉक और स्पाइक समाधानों की तैयारी के लिए संगत डेटा विश्लेषण पत्रक पूरक फ़ाइलमें दिया गया है । ट्रेसिंग के कारणों के लिए, निर्माता, कैटलॉग संख्या, और संबंधित स्तंभों में प्रत्येक एंटीबायोटिक की एक बहुत संख्या सम्मिलित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कोल्ड स्टोरेज में सभी एंटीबायोटिक दवाओं को भंग और संभव के रूप में कम के रूप में काम कर समय रहते हैं ।

  1. पानी में 25% मेथनॉल के १०० मिलीलीटर तैयार: पूर्ण मेथनॉल के 25 मिलीलीटर के साथ एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी और आसुत जल के साथ १०० मिलीलीटर तक भरें ।
  2. २०० मिमी एसिटिक एसिड की 10 मिलीलीटर पानी में तैयार: HPLC ग्रेड पानी की 9 मिलीलीटर के साथ एक 10 मिलीलीटर volumetric कुप्पी, हिमनदों एसिटिक एसिड (९९.५% शुद्धता, १७.४ मीटर) के ११५ µ एल जोड़ने, और आसुत जल जोड़ने के लिए 10 मिलीलीटर ।
  3. 25% मेथनॉल के 25 मिलीलीटर 20 मिमी एसिटिक एसिड के साथ पानी में तैयार: जलीय २०० मिमी एसिटिक एसिड समाधान की २.५ मिलीलीटर के साथ एक 25 मिलीलीटर volumetric कुप्पी से भरना, निरपेक्ष मेथनॉल के ६.२५ मिलीलीटर जोड़ने, और आसुत पानी के साथ 25 मिलीलीटर तक कुप्पी भरें ।
  4. एक सटीक पैमाने का उपयोग करने के लिए 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में एंटीबायोटिक दवाओं की उचित मात्रा में वजन के रूप में कॉलम प्रारंभिक वजनमें पूरक फ़ाइल में वर्णित है ।
  5. 20 मिमी एसिटिक एसिड सहित 25% मेथनॉल-पानी में fluoroquinolones, ciprofloxacin, और moxifloxacin के स्टॉक समाधान तैयार करें । ऐसा करने के लिए, संबंधित वॉल्यूम में पूरक फ़ाइल स्तंभ "अंतिम खंड" में वर्णित के रूप में भारित मात्रा जोड़ें । तेजी से 2 मिनट के लिए और तीव्र भंवर द्वारा एक अल्ट्रासाउंड स्नान में fluoroquinolone एंटीबायोटिक दवाओं को भंग ।
  6. 25% मेथनॉल-पानी में cefepime, meropenem, linezolid, और piperacillin के स्टॉक समाधान तैयार करें । ऐसा करने के लिए, स्तंभ अंतिम खंड में पूरक फ़ाइल में वर्णित के रूप में भारित मात्रा करने के लिए संगत मात्रा जोड़ें और तेजी से तीव्र भंवर द्वारा एंटीबायोटिक दवाओं को भंग । अंतिम पदार्थ के रूप में meropenem भंग.
  7. पूरक फ़ाइल में स्टॉक समाधान चार्ट की इसी मात्रा में वर्णित के रूप में सभी एंटीबायोटिक दवाओं के शेयर समाधान का मिश्रण करने के लिए दस गुना केंद्रित कील-समाधान उपज ।
  8. स्पाइक दस गुना केंद्रित स्पाइक समाधान की एक मात्रा के साथ दवा मुक्त सीरम के नौ संस्करणों सीरम औजार प्राप्त करने के लिए 0 – 7 और गुणवत्ता नियंत्रण (QC) A – D. उदाहरण के लिए, एक 10-एमएल में सीरम के ४.५ मिलीलीटर के लिए स्पाइक समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ट्यूब और यह 15 मिनट के लिए कोल्ड स्टोरेज में 4 डिग्री सेल्सियस पर ५० rpm पर एक रोलर मिक्सर पर मशीन ।
  9. एक दोहराव पिपेट का उपयोग करने के लिए १०० µ l aliquots के औजार और QCs में १.५ एमएल के ट्यूब ।
  10. छह महीने तक के लिए-८० ° c पर औजारों, गुणवत्ता नियंत्रण, और एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान की दुकान ।
  11. प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए भी एक साफ समाधान तैयार १,००० मिलीग्राम से युक्त एक एंटीबायोटिक के एल/। एक उपयुक्त मंदक के साथ इसी शेयर समाधान पतला (जैसे, ciprofloxacin के लिए, 20 मिमी एसिटिक एसिड सहित 25% मेथनॉल-पानी का उपयोग करें) ।
    नोट: साफ एंटीबायोटिक समाधान साधन के लिए आवश्यक है-ट्यूनिंग ही ।

2. आंतरिक मानकों मिश्रण की तैयारी

नोट: आंतरिक मानकों का नमूना क्लीनअप के दौरान एक नमूने के लिए जोड़े जाते हैं जो ब्याज की analytes की समकक्षों आइसोटोप लेबल हैं । आंतरिक मानकों के रूप में लगभग उनके unlabel्ड समकक्षों के लिए समग्र भौतिक गुण है, वे एक दिए गए नमूने के मैट्रिक्स प्रभाव के लिए क्षतिपूर्ति ।

  1. 10 मिलीलीटर शेक कुप्पी को निरपेक्ष मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़कर पानी में ५०% मेथनॉल की 10 मिलीलीटर तैयार करें और आसुत जल के साथ 10 मिलीलीटर तक इसे भरें ।
  2. 20 एमएम एसिटिक एसिड सहित पानी में ५०% मेथनॉल की 10 मिलीलीटर तैयार करें । ऐसा करने के लिए, एक 10 मिलीलीटर कुप्पी के लिए २०० मिमी एसिटिक एसिड की 1 मिलीलीटर जोड़ें, निरपेक्ष मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और आसुत जल के साथ 10 मिलीलीटर तक इसे भरने ।
  3. आंतरिक मानकों के स्टॉक समाधान उत्पन्न (IS) के साथ १,००० mg/L सीधे निर्माता द्वारा प्रदान की शीशियों में. विखंडित cefepime-13सी12डी3 सल्फेट आसुत जल में, meropenem-डी6, linezolid-डी3, और piperacillin-डी5 में ५०% मेथनॉल-जल समाधान । भंग ciprofloxacin-डी8 में ५०% मेथनॉल-पानी के साथ 20 मिमी एसीटेट और moxifloxacin हाइडरोक्लॉराइड-13सी1डी3 में 20 मिमी एसीटेट के साथ आसुत जल.
  4. एक १.५ मिलीलीटर में शेयर समाधान है मिश्रण ट्यूब एक पंचगुना केंद्रित आंतरिक मानक मिश्रण उपज के लिए । जोड़ें 10 µ l के cefepime-13123, 10 µ l के meropenem-d6, 1 µ l के ciprofloxacin-d8, 2 µ l के moxifloxacin हाइडरोक्लॉराइड-1313, 2 µ l के linezolid-d 3, व 10 µ l के piperacillin-D5 से ९६५ µ l का 25% मेथनॉल-पानी ।
  5. स्टोर आंतरिक मानक स्टॉक समाधान और पंचगुना केंद्रित मिश्रण पर है-८० ° c ।

3. रोगी नमूना भंडारण

नोट: सुनिश्चित करें कि सीरम तेजी से संभव के रूप में प्राप्त की है और है कि जमे हुए नमूनों की ठंडी श्रृंखला बनाए रखा है ।

  1. सीरम संग्रह ट्यूबों में पूरे रक्त ले लीजिए ।
  2. कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए खून का थक्का दें ।
  3. २,००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा रक्त से सीरम अलग ।
  4. एक साफ supernatant ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  5. सीरम की दुकान पर छह महीने के लिए-८० ° c जब तक यह परख है । वैकल्पिक रूप से, नमूनों की दुकान-20 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए ।

4. क्रोमैटोग्राफी के लिए बफर तैयारी

  1. 1 मीटर अमोनियम फॉर्मेट को पानी में तैयार करने के लिए, ६.३०६ ग्राम को HPLC ग्रेड वॉटर के १०० मिलीलीटर में अमोनियम फॉर्मेट का एक १०० मिलीलीटर शेक कुप्पी का प्रयोग कर भंग करें । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
  2. मोबाइल चरण तैयार करें A [10 mM अमोनियम formation in water-फार्मिक एसिड (99.9:0.1 v/v)] । HPLC ग्रेड के पानी की लगभग ५०० मिलीलीटर के साथ एक १,००० मिलीलीटर volumetric कुप्पी भरें, एक फार्म का एसिड और 1 मीटर अमोनियम प्रारूप समाधान के 10 मिलीलीटर के 1 मिलीलीटर जोड़ने, और यह १,००० मिलीलीटर HPLC ग्रेड पानी के साथ भरने के लिए । एक साफ कांच की बोतल के लिए मोबाइल चरण एक हस्तांतरण और HPLC प्रणाली से कनेक्ट । स्टोर मोबाइल एक कमरे के तापमान पर 2 सप्ताह के लिए चरण ।
  3. एक साफ कांच की बोतल में मोबाइल चरण B. Transfer HPLC ग्रेड निरपेक्ष मेथनॉल को तैयार करें और इसे HPLC सिस्टम से कनेक्ट करें ।
  4. सुई धोने विलायक के रूप में निरपेक्ष मेथनॉल का प्रयोग करें और मोबाइल चरण बी युक्त कांच की बोतल के लिए इसी ट्यूब कनेक्ट
  5. सील और मेथनॉल का एक शुद्ध विलायक उत्पन्न-जल-रूप एसिड (7:92.9:0.1, v/v/ आसुत जल के लगभग ५०० मिलीलीटर के साथ एक १,००० मिलीलीटर volumetric कुप्पी, पूर्ण मेथनॉल के ७० मिलीलीटर, फार्मिक एसिड के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और १,००० मिलीलीटर आसुत जल जोड़ें । एक साफ कांच की बोतल के लिए विलायक हस्तांतरण और HPLC प्रणाली के साथ कनेक्ट ।
    नोट: विभिन्न नमूना प्रणालियों दोनों एक मजबूत और एक कमजोर सुई धोने विलायक का उपयोग करें । ऐसी स्थिति में, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार वाश समाधान तैयार करें । उदाहरण के लिए, मेथनॉल के साथ मजबूत धोने-पानी-isopropylic शराब (70:20:10, वी/वी/) और पानी के साथ कमजोर धोने-मेथनॉल (95:5, वी/

5. साधन ट्यूनिंग

नोट: यह चरण सेट-अप विधि के लिए एक विशिष्ट मास स्पेक्ट्रोमीटर पर किया जाता है ।

  1. स्वच्छ १,००० मिलीग्राम/एल analyte और आंतरिक मानक समाधान 1:10 या 1:100 मोबाइल चरण a और B (50:50, v/वी के मिश्रण में), डिटेक्टर संकेत तीव्रता पर निर्भर करता है । धुन समारोह के साथ जन स्पेक्ट्रोमीटर या निंनलिखित माता पिता के लिए एक मैनुअल ट्यूनिंग करना-बेटी आयनों संक्रमण14: cefepime (४८१.० > 167.0/395.7), cefepime-13सी12डी3 (४८५.१ > 167.1/ ४००.०), meropenem (३८४.१ > 114.0/141.0), meropenem-d6 (३९०.१ > 114.0/147.2), ciprofloxacin (३३२.० > 231.0/245.0), ciprofloxacin-डी8 (३४०.१ > 235.1/249.3), moxifloxacin (४०२.० > 261.0/383.9), moxifloxacin-13 C1D3 (४०६.१ > 265.1/388.0), linezolid (३३८.० > 235.0/296.0), linezolid-d3 (३४१.१ > 235.1/297.1), piperacillin (५१८.० > 143.0/358.9), और piperacillin-डी5 (५२३.१ > 142.8/364.1) ।
  2. स्वत: ट्यूनिंग के साथ उपकरणों के लिए, स्वतः धुन समारोह का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से वोल्टेज और डिटेक्टरों के माध्यम से एमएस प्रवेश की सेटिंग्स को समायोजित ।
  3. मैनुअल ट्यूनिंग के साथ उपकरणों के लिए, इष्टतम (आमतौर पर अधिकतम) संकेत तीव्रता प्रत्येक माता पिता और बेटी आयन के लिए डिटेक्टर पर प्राप्त की है जब तक सेटिंग्स (जैसे, टकराव वोल्टेज और टकराव ऊर्जा) समायोजित करें । उदाहरण के लिए, एक मिश्रण टी प्लग, मोबाइल चरण a और B (50:50, v/v/०.५ मिलीलीटर/मिनट में वितरित, और लगातार एक प्रवाह की दर के साथ स्वच्छ एंटीबायोटिक या आंतरिक मानक को अस्वीकार ०.१ मिलीलीटर/

6. HPLC-ms/

नोट: जन स्पेक्ट्रोमीटर की विशेषताएं, HPLC प्रणाली (नमूना सहित), और इसी सॉफ्टवेयर निर्माता पर निर्भर करते हैं । निर्माता की सिफारिशों के अनुसार मास स्पेक्ट्रोमीटर पैरामीटर्स और वाश प्रक्रिया को अनुकूलित करें ।

  1. एक इसी 'एमएस ट्यून फ़ाइल 'में जन स्पेक्ट्रोमीटर मापदंडों स्टोर । सभी analytes के लिए धनात्मक मोड (ईएसआई +) में electrospray ionization का उपयोग करें । इस्तेमाल किया साधन के लिए आयन स्रोत सेटिंग्स अनुकूलन (जैसे, १.५ केवी का एक केशिका वोल्टेज, १२० डिग्री सेल्सियस का एक स्रोत तापमान, ४०० ° c के एक desolvation तापमान, ६०० एल के एक desolvation गैस प्रवाह की दर/एच, ०.१ वी के एक आरएफ लेंस वोल्टेज, और एक निवास के समय ८० ms) ।
  2. एक 'MS फ़ाइल 'में analyte और आंतरिक मानकों ट्यून पैरामीटर (जैसे, केशिका वोल्टेज, टकराव ऊर्जा) निर्दिष्ट करें ।
  3. 'प्रवेश फ़ाइल 'में इस प्रकार के रूप में नमूना शर्तों सेट: 10 ° c ± 5 ° c की एक सीमा के साथ नमूने तापमान; 1x पर धो अनुक्रम पर्ज-धो-एक ६०० µ एल पर्ज मात्रा प्रतिस्थापन के साथ शुद्ध करना ।
  4. में उपर्युक्त 'प्रवेश फ़ाइल ', प्रवाह दर सेट करने के लिए ०.४ या ०.५ मिलीलीटर/मिनट, चलाने के लिए समय 4 मिनट, दबाव उच्च सीमा करने के लिए ३४५ बार, और स्तंभ तापमान 30 ° c ± 5 की एक सीमा के साथ । मोबाइल चरण a और b के विलायक नाम जोड़ें और उन्हें क्रमशः 7% b/93% A पर सेट करें ।
  5. कार्यक्रम क्रोमेटोग्राफिक ढाल में ' प्रवेश 'फ़ाइल इस प्रकार है: 0.00-0.10 मिनट 7% मोबाइल चरण B/93% A के साथ, 0.11-६५% के साथ 0.60 मिनट मोबाइल चरण b/35% एक, 0.61-2.10 मिनट ९५% मोबाइल चरण b/5% a, 2.11 – 4.00 मिनट के साथ 7% मोबाइल फेज़ b/93% a.
    नोट: अतिरिक्त-स्तंभ वॉल्यूम की गणना करें, वाद्य प्लेटफ़ॉर्म के लिए होल्ड-अप वॉल्यूम और analyte अवधारण कारकों की खासियत < 621 > क्रोमैटोग्राफी दिशानिर्देश16में वर्णित करें ।

7. नमूना माप मास्टर फ़ाइल

नोट: के साथ 'नमूना माप मास्टर फ़ाइल ', रोगी नमूने निर्दिष्ट कर रहे हैं, HPLC-ms/ms विश्लेषण शुरू कर दिया है, और डेटा मूल्यांकन किया जाता है । एक कम और उच्च गुणवत्ता नियंत्रण जोड़ी सहित दो अलग टेम्पलेट फ़ाइलें उत्पन्न होती हैं; एक टेंपलेट qc एक जोड़ी और सी, अंय एक qc जोड़ी बी और डी भी शामिल है ।

  1. एक नया 'नमूना माप मास्टर फ़ाइल 'बनाएँ । उपर्युक्त का चयन करें 'एमएस ट्यून फ़ाइल ', 'एमएस फ़ाइल ', और ' प्रवेश फ़ाइल ' (धारा 6), प्रत्येक नमूना लाइन में उन्हें डालने, और 15 µ एल के साथ इंजेक्शन की मात्रा निर्दिष्ट करें ।
  2. आरोही क्रम में, 0 – 7 और गुणवत्ता नियंत्रण (qc) युग्म के लिए "नमूना पाठ" जोड़ें एक या qc जोड़ी बी/
  3. नमूना प्रकार निर्दिष्ट करें । नमूना प्रकार "जांचें और गुणवत्ता नियंत्रण जोड़े के लिए" QC "के लिए मानक" का चयन करें ।
  4. इसी औजार और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रत्येक एंटीबायोटिक पदार्थ की एकाग्रता निर्दिष्ट करें (स्प्रेडशीट देखें, एकाग्रता [µ g/mL] cal 7 – cal 0, QC A/C या B/D,) ।
  5. कार्यक्रम 'डेटा मूल्यांकन ' विधि। उपकरण ट्यूनिंग (खंड 5) के दौरान अनुकूलित किया गया है कि संक्रमण का उपयोग करें । इसी आइसोटोप के साथ प्रत्येक एंटीबायोटिक मिलान-मानक लेबल (जैसे, meropenem-meropenem-D6).

8. नमूना सफाई और HPLC एमएस/

नोट: प्रत्येक नमूना बैच के लिए, एक युग्मित गुणवत्ता नियंत्रण एक कम और उच्च एंटीबायोटिक एकाग्रता के साथ सेट (qc ए सी या qc बी/ विभिंन बैचेस के बीच, युग्मित QC नमूने एक वैकल्पिक अनुक्रम में उपयोग किए जाते है (उदा., दिन 1 पर, 'नमूना माप मास्टर फ़ाइल ' का चयन करें जिसमें qc जोड़ी A/C; दिन 2 पर, qc युग्म B/ सीरम नमूनों की प्रोसेसिंग चित्रा 1में सचित्र है ।

  1. मेथनॉल (10:90, v/v) में वर्षण एजेंट 10% मिथाइल-tert-butyl ईथर तैयार करें (जैसे, एक 25-एमएल volumetric कुप्पी के २.५ मिलीलीटर के साथ-tert-butyl ईथर और यह निरपेक्ष मेथनॉल के साथ 25 मिलीलीटर भरने के लिए) ।
  2. स्तंभ कक्ष में C8 रिवर्स चरण रखें । इसे प्रवाह की दिशा में HPLC और मास स्पेक्ट्रोमीटर से कनेक्ट करें ।
  3. नमूना सूची जनरेट करें । संबंधित 'नमूना माप मास्टर फ़ाइल ' टेम्पलेट खोलें और रोगी नमूने सूची के लिए संसाधित किया जा करने के लिए मतलब जोड़ें. अप करने के लिए 20 रोगी नमूनों के समूह उत्पन्न और इसी गुणवत्ता नियंत्रण जोड़ी के साथ उन्हें पार्श्व ।
  4. गीला-प्रधानमंत्री एचपीसीएल 'प्रवेश ' फ़ाइल नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रणाली: ५०% मोबाइल चरण A/50% B करने के लिए "गीला प्रधानमंत्री" समारोह सेट, और 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर के साथ 2 मिनट के लिए गीला-प्रधानमंत्री/
  5. सिरिंज को रिफ्रेश करें । ऐसा करने के लिए, नियंत्रण सॉफ्टवेयर में ६०० µ एल के 6 स्ट्रोक निष्पादित ।
  6. Equilibrate C8 रिवर्स चरण कॉलम । सॉफ्टवेयर का प्रयोग, 'प्रवेश फ़ाइल ' में प्रवाह पर बारी और यह 7% मोबाइल चरण बी के साथ फ्लश/5 मिनट की एक ंयूनतम के लिए एक प्रवाह दर का उपयोग कर, ०.५ मिलीलीटर/30 डिग्री सेल्सियस के स्तंभ तापमान सत्यापित करें ।
  7. रोगी के नमूनों को गल, एक aliquot की एक-7, और एक गुणवत्ता नियंत्रण जोड़ी (या तो ए/
  8. एक दोहराव पिपेट के साथ, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में १०० µ एल औजार, QC नमूना, या रोगी सीरम के लिए आंतरिक मानक मिश्रण के 25 µ एल जोड़ें, और कुछ सेकंड के लिए ट्यूब भंवर ।
  9. एक benchtop शेखर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण मशीन (जैसे, १,२०० rpm पर) ।
  10. एक दोहराव पिपेट के साथ, नमूना आंतरिक मानक मिश्रण करने के लिए एक वर्षा रिएजेंट के १५० µ एल जोड़ें ।
  11. फिर, भंवर कुछ सेकंड के लिए ट्यूब और एक benchtop शेखर पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए यह मशीन (जैसे, १,२०० rpm पर) ।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक तालिका में २०,००० x g पर निलंबन केंद्रापसारक ।
  13. HPLC ग्रेड एक माइक्रो डालने के साथ एक गिलास शीशी का उपयोग कर पानी के साथ supernatant 1:3 पतला और यह नमूना के लिए संसाधित नमूनों के रूप में लोड ।
  14. मैन्युअल रूप से प्रारंभ करें HPLC-ms/ms विश्लेषण में 'नमूना माप नियंत्रण फ़ाइल '.
    नोट: लंबे समय तक भंडारण के लिए, अच्छी तरह से निर्माता की सिफारिश के अनुसार विश्लेषणात्मक कॉलम फ्लश [उदा., ०.५ मिलीलीटर/मिन मेथनॉल-पानी (50:50, v/v)] चरण पतन को रोकने के लिए ।

Figure 1
चित्र 1: नमूना क्लीनअप का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण. उच्च केंद्रापसारक बल पर प्रोटीन वर्षा एक घने गोली और स्पष्ट supernatant देता है, यह दर्शाता है कि प्रोटीन वर्षण पूरा हो गया था । पूरे प्रसंस्करण समय लगभग 30 मिनट है, नमूना सफाई सहित, क्रोमेटोग्राफिक जुदाई, और एमएस/ms विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

9. गुणवत्ता मूल्यांकन और ठहराव

  1. नमूनों की प्रक्रिया करने के लिए, इसी 'नमूना माप नियंत्रण फ़ाइल 'खोलें, औजार, गुणवत्ता नियंत्रण, और रोगी के नमूनों का चयन करें, और उन्हें 'एंटीबायोटिक्स ठहराव विधि ' के साथ मूल्यांकन.
  2. जांच करें कि क्या एक विशिष्ट analyte के लिए चोटियों ठीक से एकीकृत कर रहे हैं । प्रत्येक औजार, QC, और रोगी के नमूने के लिए चोटियों का निरीक्षण करें, और मैंयुअल रूप से यदि आवश्यक हो तो आधार रेखा पर उंहें पुनः एकीकृत ।
  3. अंशांकन वक्र का अध्ययन करें और जांच करें कि क्या यह निम्नलिखित गुणवत्ता मानदंड को पूरा करता है: a) पूरे अंशांकन सीमा पर रैखिकता, ख) एक अंशांकन गुणांक आर2 > ०.९९५, ग) प्रत्येक अंशांकन मानक का विचलन 15% ± के भीतर ठहराव (LLOQ) की निचली सीमा के अलावा नाममात्र मूल्य, जहां ± 20% की आवश्यकता होती है ।
  4. उपर्युक्त मानदंडों के साथ अनुपालन नहीं एक अंशांकन मानक अस्वीकार करें और अंशांकन वक्र, प्रतिगमन विश्लेषण सहित पुन: मूल्यांकन ।
  5. गुणवत्ता नियंत्रण का अध्ययन और जांच कि विचलन नाममात्र मूल्य का 15% ± के भीतर हैं ।
  6. यदि एक रोगी के नमूने की एकाग्रता उच्चतम औजार की एकाग्रता से अधिक है, आसुत जल के साथ नमूना पतला, 1:5 तक (जैसे, १०० µ एल के सीरम प्लस आसुत जल के ४०० µ एल) नमूना क्लीनअप से पहले । उस विशिष्ट नमूने के लिए 8.8 – 8.14 चरण निष्पादित करें और इसे पुनर्प्रक्रिया ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर, एक ठेठ वर्णलेख चित्रा 2में दिखाया गया है । संयुक्त राज्य अमेरिका Pharmacopeia (खासियत) क्रोमैटोग्राफी दिशा निर्देशों16के अनुसार, वर्तमान प्रणाली में कॉलम मृत मात्रा ~ ०.२२ मिलीलीटर और अतिरिक्त कॉलम मात्रा के साथ निर्धारित किया गया था (इंजेक्टर सहित, टयूबिंग, और connectors) ~ ०.०८ मिलीलीटर के साथ, दे एक पकड़-अप की मात्रा ~ ०.३० मिलीलीटर । सभी analytes के लिए परिकलित अवधारण कारक २.८ (for cefepime) थे-४.२ (for piperacillin) ।

Figure 2
चित्रा 2: सामान्यीकृत संकेत तीव्रता के साथ ठेठ विश्लेषणात्मक वर्णलेख. एंटीबायोटिक्स निम्नलिखित क्रम में eluting हैं: cefepime (हरा), meropenem (भूरा), ciprofloxacin (लाल), moxifloxacin (काला), linezolid (नारंगी), और piperacillin (बैंगनी) । अवधारण समय, जो मिनटों में दिया जाता है, और analyte पीक समानताएं, मोबाइल चरणों, प्रवाह-दर, क्रोमैटोग्राफी टयूबिंग, और विश्लेषणात्मक स्तंभ आयु की सटीक संरचना के आधार पर भिन्न होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3 , 0-7 ("Kalibrator 0"-"Kalibrator 7"), गुणवत्ता नियंत्रण, और रोगी सीरा, कि इंजेक्शन संख्या (#) के साथ संकेत कर रहे हैं सहित प्रसंस्कृत नमूनों के लिए एक नमूना चार्ट सूची में शामिल हैं; नमूना पहचान पाठ (नमूना पाठ); मिलीग्राम/L () में मापा एकाग्रता; नमूना प्रकार जो या तो एक रिक्त, मानक, गुणवत्ता नियंत्रण, या रोगी नमूना (प्रकार) है; mg/L (एसटीडी.) में औजारों की नाममात्र एकाग्रता; विश्लेषणात्मक अवधारण समय (RT); प्रतिक्रिया है कि analyte/पीक क्षेत्र के शिखर क्षेत्र का अनुपात है (प्रतिक्रिया); नाममात्र एकाग्रता मूल्य (% देव) से विचलन; शीशी स्थिति (शीशी); और अधिग्रहण समय (Acq. time) । कुंजी ठहराव के लिए इस्तेमाल किया पैरामीटर प्रतिक्रियाहै, धीरे-analyte एकाग्रता के साथ बढ़ रही है, जोड़ा आइसोटोप की लगातार राशि के कारण-आंतरिक मानक लेबल.

चित्र बी के अंशांकन वक्र से पता चलता है । प्रतीपगमन में, निर्धारण आर2 के गुणांक > ०.९९५ होना चाहिए । निम्न अंशांकन मॉडल इस विधि में वर्णित सभी analytes के लिए उपयोग किया जाता है: वक्र प्रकार = रेखीय; उत्पत्ति = शामिल; भार = 1/ अक्ष परिवर्तन = कोई नहीं । दिए गए उदाहरण में, अंशांकन वक्र और गुणवत्ता नियंत्रण सभी गुणवत्ता मानदंडों को पूरा: r2 > ०.९९५ अंशांकन वक्र के लिए और (LLOQ सहित) और QC नमूनों के विचलन के भीतर ± 15% नाममात्र मूल्य का है ।

मापा जनक-to-बेटी आयन संक्रमण (MRM) चित्रा 3सी में दिए गए हैं, एक ही प्रतिधारण समय में चार चोटियों दिखा: दो ऊपरी चोटियों ब्याज की analyte के लिए मापा जाता है कि दो संक्रमण चित्रण, कम दो चोटियों का प्रतिनिधित्व इसी आइसोटोप के लिए संक्रमण-आंतरिक मानक लेबल । गुणवत्ता आकलन के लिए, संबंधित प्रतिधारण समय windows में analyte चोटियों नेत्रहीन जाँच कर रहे हैं और मैन्युअल रूप से आधारभूत, जब आवश्यक पर पुनः एकीकृत.

न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) रोगाणुरोधी TDM के केंद्रीय घटक है, pharmacokinetic जोखिम है कि एक लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है को परिभाषित pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/केडी) अनुपात13,17. तदनुसार, लक्ष्य एंटीबायोटिक TDM एकाग्रता का स्तर रोगज़नक़ के MIC के संबंध में व्यक्त कर रहे हैं । यह देखते हुए कि बीटा-लस्टम एंटीबायोटिक दवाओं की कार्रवाई समय पर निर्भर है, उनकी प्रभावकारिता है कि mic 4x-5x (फुट > 4-5x mic) से अधिक चिकित्सीय सांद्रता की उपलब्धि के माध्यम से बड़ा है । जब अज्ञात संक्रामक रोगजनकों का सामना करना पड़ रहा है, लक्ष्य गर्त एकाग्रता रेंज के मुक्त (प्रोटीन असीम) piperacillin है, इसलिए, ६४ mg/l, लगभग करने के लिए इसी ९० mg/l कुल piperacillin18.

पहले रोगी (नमूना #11) Pseudomonas aeruginosaजैसे समस्या रोगजनकों के लिए भी पर्याप्त है कि ८३.४ मिलीग्राम/L piperacillin की एक संतोषजनक उच्च सीरम गर्त स्तर है । दूसरा रोगी (नमूना #12) लगभग ०.२ मिलीग्राम/L की एकाग्रता है, जो सबसे कम औजार (LLOQ) के नीचे है । शायद मरीज को बरामद कर लिया है, और piperacillin का प्रशासन बंद कर दिया गया । परिणाम "< ०.५ mg/L" है, इसलिए, अस्पताल सूचना प्रणाली में रिपोर्ट की गई है । तीसरे रोगी (नमूना #13) केवल ५.३ मिलीग्राम/L के एक कम piperacillin गर्त एकाग्रता है कि रोगजनकों के स्पष्ट बहुमत के लिए पर्याप्त नहीं है । प्रभावी रोगाणुरोधी कीमोथेरेपी के लिए, खुराक चिकित्सक द्वारा बढ़ाया जाना चाहिए ।

Figure 3
चित्रा 3: analyte piperacillin के लिए अनुकरणीय गुणवत्ता मूल्यांकन और ठहराव । इन पैनलों मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करते हैं । () यह पैनल नमूना सूची दिखाता है, जिसमें औजार (मानक, नमूने #1-#8), गुणवत्ता नियंत्रण (QC, नमूने #9 और #10), और रोगी सीरा (नमूनों #11-#13) शामिल हैं. औजार 0 analyte के बिना खाली करने के लिए संदर्भित करता है, लेकिन एक आंतरिक मानक के अलावा के साथ । ९९५१ qc बी का प्रतिनिधित्व करता है, ९९५३ qc डी (बी) का प्रतिनिधित्व करता है इस पैनल piperacillin के लिए अंशांकन वक्र से पता चलता है । नाममात्र औजार सांद्रता से प्रतिशत विचलन ऊपरी ग्राफ (y-अक्ष: अवशिष्ट) में दिया जाता है, कम ग्राफ रैखिक अंशांकन रेंज दर्शाया गया है । () यह पैनल piperacillin के लिए मल्टीपल रिएक्शन टाइम मॉनिटरिंग (MRM) और मरीज के सीरम सैंपल #12 के लिए इसी इंटरनल स्टैंडर्ड piperacillin-डी5 को दिखाता है । दो माता पिता को बेटी आयन संक्रमण उनके प्रतिधारण समय और संबंधित संकेत तीव्रता के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक फ़ाइल । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

इस पांडुलिपि में, हम आईसीयू19में अक्सर इस्तेमाल किया एंटीबायोटिक दवाओं के ठहराव के लिए एक सरल और मजबूत मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित विधि के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट, अर्थात् cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid, और piperacillin14. एक स्प्रेडशीट एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान, औजार की तैयारी के लिए पांडुलिपि के साथ जुडा हुआ है, और गुणवत्ता नियंत्रण, ध्यान में एंटीबायोटिक दवाओं की शुद्धता और उनके काउंटरों के आणविक वजन लेने । यह देखते हुए कि एंटीबायोटिक दवाओं की सांद्रता बल्कि उच्च रहे हैं, उनके ठहराव एक विश्लेषणात्मक परिप्रेक्ष्य से कोई विशेष चुनौती होना चाहिए । तदनुसार, हमें विश्वास है कि इस प्रोटोकॉल विभिंन एमएस वाद्य प्लेटफार्मों पर लागू होता है । एक विधि स्थानांतरण के लिए, उपयोगकर्ताओं को अतिरिक्त स्तंभ मात्रा और उनके क्रोमेटोग्राफिक सिस्टम के होल्ड-अप वॉल्यूम यों तो और ढाल प्रारंभ समय तदनुसार16अनुकूलित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । विधि सेट-अप के दौरान, सिस्टम भी ले के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए पर और, यदि आवश्यक हो, एक खाली नमूना उच्चतम औजार और उच्च एंटीबायोटिक सांद्रता के साथ रोगी के नमूनों के बाद इंजेक्ट किया जाना चाहिए । उपयोगकर्ताओं को भी डिटेक्टर संतृप्ति की संभावना है कि तब होता है जब भी कई आयनों एक मिलकर जन स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश पर विचार करना चाहिए । प्रासंगिक डिटेक्टर संतृप्ति छोटे इंजेक्शन की मात्रा, नमूना सफाई के दौरान एक उच्च analyte कमजोर पड़ने, और/या एक लक्ष्य analyte (जैसे, इष्टतम वोल्टेज सेटिंग्स पदावनति) के एक ट्यूनिंग के साथ समाप्त किया जा सकता है ।

अन्य तरीकों के विपरीत, अंशांकन रेंज अतिसंवेदनशील रोगजनकों के MIC के करीब सांद्रता के दोनों एक ठहराव की अनुमति देता है, साथ ही पीक सांद्रता (सीमैक्स) जो एक बोल्स प्रशासन के साथ प्राप्त कर रहे हैं । वयस्कों के लिए उच्चतम सीअधिकतम-मान इस प्रकार के रूप में एफडीए दवा सुरक्षा डाटाबेस पर संबंधित पेशेवर जानकारी पत्रक में रिपोर्ट कर रहे हैं: १६३.९ mg/l के लिए cefepime20, ११२ mg/l के लिए meropenem21, ४.६ mg/l के लिए ciprofloxacin22 , ४.१ mg/l के लिए moxifloxacin23, २१.२ mg/l के लिए linezolid24, और piperacillin25के लिए २९८ mg/l रोगी के रक्त परिसंचरण में एंटीबायोटिक एकाग्रता निगरानी शामिल रोगजनकों की संवेदनशीलता के लिए एक खुराक समायोजन की अनुमति देता है, लेकिन वक्र के तहत pharmacokinetic क्षेत्र भी दिए गए के साथ कई रक्त नमूने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता प्रोटोकॉल.

कई एंटीबायोटिक (विशेष रूप से बीटा-लस्टम meropenem) रासायनिक अस्थिर एक बार भंग कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, इसलिए, शेयर समाधान की तैयारी, औजार, और ठंड की स्थिति के तहत गुणवत्ता नियंत्रण26,27। उस संबंध में, यह भी संभव के रूप में जल्दी के रूप में रोगी के नमूनों फ्रीज करने के लिए आवश्यक है । हालांकि-८० ° c पर सीरम भंडारण की सिफारिश की है26, हमारे स्थिरता प्रयोगों से पता चलता है कि नमूनों को भी 3 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है-20 ° c एंटीबायोटिक सांद्रता की किसी भी महत्वपूर्ण कमी के बिना (यहां तक कि गर्त स्तर पर).

हम रोगी नमूनों की प्रत्येक HPLC-ms/एमएस विश्लेषण से पहले एक सिस्टम उपयुक्तता परीक्षण करने की सलाह देते हैं (उदा., औजार 3 के साथ) । आम तौर पर, एक प्रणाली उपयुक्तता परीक्षण के लिए नियंत्रण रेखा ms/एमएस प्रणाली की पुनरावृत्ति को सत्यापित करने के लिए और अगर यह भी किया जा करने के लिए विश्लेषण के लिए पर्याप्त है देखने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रकार, उदाहरण के लिए, कम संकेत तीव्रता एमएस स्वीप शंकु, जो, तो, एक कार्बनिक विलायक के साथ अपनी सफाई की आवश्यकता के एक संदूषण के कारण होते हैं । MS स्रोत को साफ रखने के लिए, एक डायवर्ट वॉल्व को क्रोमैटोग्राफी कॉलम के बाद पेश किया जा सकता है, इसके लिए मोबाइल फेज के "analyte-फ्री" भाग को कचरे के पास से पहले वे मास स्पेक्ट्रोमीटर तक पहुंचाते हैं । दूसरी ओर, दबाव की एक समग्र वृद्धि समय के साथ कॉलम कॉलेस्ट्रॉल संकेत कर सकते हैं । किसी लागत-प्रभावी स्तंभ फ़िल्टर का स्तंभ दीर्घायु उपयोग बढ़ाने के लिए अनुशंसित है । यदि दबाव अभी भी एक समस्या बनी हुई है, ०.४ मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर भी इस प्रोटोकॉल में क्रोमेटोग्राफिक ढाल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस तकनीक की एक छोटी सी सीमा है कि यह नमूना साफ अप के लिए तीन अलग मैनुअल कदम की आवश्यकता है, लगभग 30 मिनट की कुल बदलाव समय में जिसके परिणामस्वरूप । आइसोटोप जोड़-वर्षण एजेंट के लिए आंतरिक मानकों लेबल कुछ बचा सकता है संसाधन समय । हालांकि, यह केवल उच्च नमूना प्रवाह दरों के लिए और वर्षा एजेंट ठंड में संग्रहित किया जा रहा है के साथ किया जाना चाहिए (जैसे, पर-20 ° c), आंतरिक मानकों भी ऊंचा तापमान पर इन विट्रो में नीचा के रूप में.

वर्णित प्रोटोकॉल मानक १.५ एमएल के ट्यूब में नमूना प्रसंस्करण के लिए विकसित किया गया है । एक उच्च प्रवाह दर एंटीबायोटिक TDM के लिए आवश्यक होना चाहिए, प्रक्रिया बहु-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप पर्याप्त केंद्रापसारक आवेषण या एक निर्वात कई गुना के साथ फिल्टर प्लेट का उपयोग करने के लिए उन्नत किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ Schütze प्रस्तुत विधि और उचित अंशांकन रेंज के बारे में मूल्यवान इनपुट के लिए डॉ प्रर्दशित की स्थापना के साथ उनकी मदद के लिए धंयवाद । लेखक जन स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा के तकनीकी कर्मचारियों को भी स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cefepime hydrochloride Sigma-Aldrich 1097636 USP Reference Standard
meropenem trihydrate Sigma-Aldrich Y0001252 EP Reference Standard
ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
moxifloxacin hydrochloride Sigma-Aldrich SML1581
linezolid Toronto Research Chemicals L466500
piperacillin sodium salt Sigma-Aldrich 93129
cefepime-13C12D3 sulfate Alsachim C1297 Isotope labelled internal standard for cefepime
meropenem-D6 Toronto Research Chemicals M225617 Isotope labelled internal standard for meropenem
ciprofloxacin-D8 Toronto Research Chemicals C482501 Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin
moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride Toronto Research Chemicals M745003 Isotope labelled internal standard for moxifloxacin
linezolid-D3 Toronto Research Chemicals L466502 Isotope labelled internal standard for linezolid
piperacillin-D5 Toronto Research Chemicals P479952 Isotope labelled internal standard for piperacillin
methanol JT Baker 8402
HPLC grade water JT Baker 4218
formic acid Biosolve 6914132
acetic acid Biosolve 1070501
ammonium formate Sigma-Aldrich 70221-25G-F
tert-Butyl methyl ether Merck 101845
Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mm Fortis F08-020503
Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm) Chromsystems 15011
2795 Alliance HPLC system Waters 176000491
Quattro micro API Tandem Quadrupole System Waters 720000338
QuanLynx 4.1 software Waters / Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer
Supplemental File Stock Solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, (3), 259-272 (2016).
  2. Dellinger, R. P., et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Medicine. 39, (2), 165-228 (2013).
  3. Lodise, T. P., Drusano, G. L. Pharmacokinetics and pharmacodynamics: optimal antimicrobial therapy in the intensive care unit. Critical Care Clinics. 27, (1), 1-18 (2011).
  4. Macedo, R. S., Onita, J. H., Wille, M. P., Furtado, G. H. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs in intensive care unit patients. Shock. 39, Suppl 1. 24-28 (2013).
  5. Petersson, J., Giske, C. G., Eliasson, E. Standard dosing of piperacillin and meropenem fail to achieve adequate plasma concentrations in ICU patients. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 60, (10), 1425-1436 (2016).
  6. Abdul-Aziz, M. H., Lipman, J., Mouton, J. W., Hope, W. W., Roberts, J. A. Applying pharmacokinetic/pharmacodynamic principles in critically ill patients: optimizing efficacy and reducing resistance development. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 36, (1), 136-153 (2015).
  7. Imani, S., Buscher, H., Marriott, D., Gentili, S., Sandaradura, I. Too much of a good thing: a retrospective study of beta-lactam concentration-toxicity relationships. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72, (10), 2891-2897 (2017).
  8. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. Pharmacy & Therapeutics. 40, (4), 277-283 (2015).
  9. World Health Organization. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance. Available from: http://www.who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en (2015).
  10. Pulcini, C. Antibiotic stewardship: update and perspectives. Clinical Microbiology and Infection. 23, (11), 791-792 (2017).
  11. Cairns, K. A., et al. The impact of a multidisciplinary antimicrobial stewardship team on the timeliness of antimicrobial therapy in patients with positive blood cultures: a randomized controlled trial. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71, (11), 3276-3283 (2016).
  12. Baur, D., et al. Effect of antibiotic stewardship on the incidence of infection and colonisation with antibiotic-resistant bacteria and Clostridium difficile infection: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infectious Diseases. 17, (9), 990-1001 (2017).
  13. Roberts, J. A., Norris, R., Paterson, D. L., Martin, J. H. Therapeutic drug monitoring of antimicrobials. British Journal of Clinical Pharmacology. 73, (1), 27-36 (2012).
  14. Paal, M., Zoller, M., Schuster, C., Vogeser, M., Schutze, G. Simultaneous quantification of cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid and piperacillin in human serum using an isotope-dilution HPLC-MS/MS method. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 102-110 (2018).
  15. Vogeser, M., Seger, C. Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. Clinical Chemistry. 56, (8), 1234-1244 (2010).
  16. United States Pharmacopeia and National Formulary. Chapter <621>. CHROMATOGRAPHY (USP 37-NF 32 S1). United Book Press, Inc. Baltimore, MD. 6376-6385 (2014).
  17. Wong, G., Sime, F. B., Lipman, J., Roberts, J. A. How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients? BMC Infectious Diseases. 14, 288 (2014).
  18. EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Information on clinical breakpoint tables. Available from: http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/ (2017).
  19. Surveillance der Antibiotika-anwendung und der bakteriellen Resistenzen auf Intensivstationen. SARI information for antibiotic consumption 2016 of all intensive care units participating at SARI. Available from: http://sari.eu-burden.info/auswertung/down/AD-ZEIT.pdf (2016).
  20. Cefepime hydrochloride: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf (2016).
  21. Meropenem: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf (2006).
  22. Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf (2016).
  23. Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf (2010).
  24. Linezolid: Highlights of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf (2011).
  25. Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information. Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf (2017).
  26. Zander, J., et al. Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol. Clinical Chemistry and Laboratory. 54, (2), 265-274 (2016).
  27. Zander, J., et al. Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation. Clinical Chemistry and Laboratory. 53, (5), 781-791 (2015).
मल्टीप्लेक्स चिकित्सकीय दवा की निगरानी आइसोटोप द्वारा-कमजोर पड़ने HPLC-ms/गंभीर बीमारियों में एंटीबायोटिक दवाओं के एमएस/
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schuster, C., Sterz, S., Teupser, D., Brügel, M., Vogeser, M., Paal, M. Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses. J. Vis. Exp. (138), e58148, doi:10.3791/58148 (2018).More

Schuster, C., Sterz, S., Teupser, D., Brügel, M., Vogeser, M., Paal, M. Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses. J. Vis. Exp. (138), e58148, doi:10.3791/58148 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter