Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58149
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Summary

مطلوب للحفاظ على التوازن افيروسيتوسيس، إزالة متجولة للخلايا أبوبتوتيك، ويسر مستقبلات ومسارات الإشارات التي تسمح للاعتراف، والإحاطة، واستيعاب الخلايا أبوبتوتيك. وهنا، نقدم بروتوكول الفحص المجهري الأسفار لتقدير افيروسيتوسيس ونشاط مسارات إشارات افيروسيتيك.

Abstract

دراسة تنظيم افيروسيتوسيس يتطلب وسائل تكون قادرة على دقة قياس امتصاص الخلايا أبوبتوتيك والتحقيق في عمليات إرسال الإشارات والخلوية التي تتحكم في افيروسيتوسيس. هذا التحديد الكمي يمكن أن يكون صعباً للقيام على النحو apoptotic الخلايا غالباً افيروسيتوسيد مجزأة، مما يستوجب الطرق التي يمكن أن تحدد بدقة بين الجزء افيروسيتوسيد من هدف أبوبتوتيك مقابل الخلوية أونينجولفيد المتبقية الشظايا. ويستخدم النهج المبين في هذه الوثيقة نهج التسمية المزدوجة لقياس دقة ديناميات القدرات افيروسيتوسيس وافيروسيتيك من افيروسيتيس مثل الضامة. يسمى سيتوسول الخلية أبوبتوتيك بصبغة خلية تتبع لتمكينها من رصد جميع المواد apoptotic المستمدة من الخلية، بينما بيوتينيليشن سطح الخلية apoptotic يسمح بالتمييز بين المدخلة وغير مستوعبة أبوبتوتيك خلية الكسور. يتم تحديد قدرة افيروسيتيك افيروسيتيس بأخذ الصور الفلورية للخلايا الحية أو ثابتة والتحديد الكمي لمقدار منضم مقابل الأهداف المدخلة، كما ميزت تلطيخ streptavidin. هذا النهج يوفر العديد من المزايا على أساليب مثل التدفق الخلوي، هما ترسيم دقيق من غير افيروسيتوسيد مقابل افيروسيتوسيد أبوبتوتيك خلية الكسور، القدرة على قياس ديناميات افيروسيتيك بالفحص المجهري خلية يعيش، القدرة على إجراء دراسات للإشارات الخلوية في الخلايا معربا عن المتسلسلات المسمى فلوريسسينتلي. جنبا إلى جنب، الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول بمثابة الأساس لنهج مرن تجريبية التي يمكن استخدامها لدقة قياس النشاط افيروسيتيك واستجواب مسارات الإشارات الخلوية النشطة أثناء افيروسيتوسيس.

Introduction

المبرمج، أو موت الخلية المبرمج، هو الغاية-وينظم عملية فسيولوجية التي تحدث في معظم الكائنات الحية متعددة الخلايا، وهو أمر حاسم ل التنمية والتوازن على1. بالإضافة إلى اشتراكها في دوران الخلية الطبيعية والتنمية الجنينية، المبرمج يمكن القضاء على الخلايا المصابة أو التالف من الأنسجة ويمكن أن تسبب استجابة للعدوى، والتهاب، والسرطان، وأيضا بالتدخلات الطبية مثل العلاج بالأشعة أو المنشطات1. الكشف عن الخلايا أبوبتوتيك "أكل-لي" إشارات على سطحها الخلية التي تعترف بها مستقبلات على طائفة من البالعات المهنية وغير المهنية، يشار إليها باسم "افيروسيتيس". مشاركة هذه المستقبلات الحث على الإقبال وتدهور الخلية أبوبتوتيك التي افيروسيتي من خلال عملية تعرف باسم افيروسيتوسيس،من23. فوسفاتيديلسيريني هو الأفضل تتسم أكل-لي إشارة افيروسيتوسيس القيادة. عادة ما تقتصر على النشرة الداخلية من غشاء البلازما، مع المبرمج تفعيل سكرامبلاسي دهن الذي يعطل هذا التفاوت الغشاء، مما يعرض فوسفاتيديلسيريني على سطح الخلية4. ويوجد على سطح بعض الخلايا غير أبوبتوتيك، مثل الضامة الناضجة خارج الخلية فوسفاتيديلسيريني وتنشيط الصفائح الدموية. ومع ذلك، ليست هذه الخلايا افيروسيتوسيد بسبب وجود إشارات "لا يأكلون لي"، مثل CD47، في تلك الخلية السطحية5،6،7. فوسفاتيديلسيريني المكشوفة المسلم من صفيف مستقبلات افيروسيتيك أعرب عن طريق افيروسيتيس. ملزم لهذه المستقبلات إلى فوسفاتيديلسيريني، أما مباشرة أو من خلال المعونة من أوبسونينس، ينشط مسارات الإشارات التي تعزز الإحاطة الخلية apoptotic إلى المنقبضة غشاء زمنياً وصف افيروسومي8، 9 , 10 , 11 , 12-افيروسومي الصمامات تسلسلياً مع اندوسوميس و lysosomes، التي توفر الآلية الجزيئية الضرورية أسيديفي في افيروسومي وتتحلل في أبوبتوتيك الخلية الشحن13،14. مجرد المتدهورة، يتم الاتجار بالمواد المستمدة من الخلايا أبوبتوتيك إلى دخلول إعادة التدوير – عملية مما يحد من الاستجابات المناعية المستضدات المشتقة من الخلايا أبوبتوتيك، والتي قد تسمح لاسترداد المواد الغذائية من خلية أبوبتوتيك13، 15. فشل في نتائج افيروسيتوسيس في إزالة البصر من الخلايا أبوبتوتيك؛ تخضع هذه الخلايا التي لم تتم إزالتها في نهاية المطاف نخر الثانوية. نخرية الخلايا الإفراج عن محتويات سيتوسوليك برو--التهابات ومسببات الأمراض، وأوتوانتيجينس في الوسط خارج الخلية، وهكذا يقود مجموعة من الأمراض المعدية والالتهابات والمناعة الذاتية16،17. معا، المبرمج وافيروسيتوسيس تيسير إزالة خلايا الموت والميت والسماح للحفاظ على التوازن الأنسجة.

يتطلب التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء افيروسيتوسيس الأساليب التي تتيح إجراء تقييم كمي واضح لامتصاص الخلية أبوبتوتيك. هذا التحديد الكمي معقد من حقيقة أنه خلافا لامتصاص أخرى لا ينتج آليات مثل الالتقام والبلعمه،من1819، افيروسيتوسيس في الإحاطة للخلية الهدف سليمة، أدى إلى استيعاب تدريجي خلية أبوبتوتيك افيروسيتي20. البروتوكول الموضحة هنا وصف في المختبر افيروسيتوسيس مقايسة التي توفر ترسيم دقيق المدخلة مقابل عدم استيعاب أجزاء من الخلايا الفردية أبوبتوتيك ويمكن دمجها مع مجموعة متنوعة من خلايا ثابتة و النهج مجهرية تعيش الخلية. فحوصات البلعمه التقليدية إضافة أجسام مضادة محددة الهدف متجولة في نهاية هذه التجربة من أجل تسمية أهدافا غير مستوعبة، حيث أنه لدينا أسلوب يختلف عن طريق الوسم الهدف أبوبتوتيك مع البيوتين مرتبطة تساهميا21 , 22-بينما apoptotic الخلية أجسام مضادة محددة يمكن أن تستخدم في هذا التحليل، النهج بيوتينيليشن الذي يسمح لأي هدف الحاملة للبروتين يكون المسمى ويتجنب المشاكل المحتملة مع الجسم المضاد الثانوي ه إذا أجرى إيمونوستينينج . على وجه التحديد، فإننا مخطط إعداد الخلايا جوركات أبوبتوتيك التي كانت ملطخة المزدوج مع كل خلية تتبع صبغ والبيوتين. خلية تتبع صبغة يسمح للمواد المستمدة من الخلايا apoptotic تعقبها أثناء افيروسيتوسيس، بينما يسمح بيوتينيليشن السطحية للتمييز لاستيعابه من الأجزاء غير مستوعبة من الخلايا أبوبتوتيك افيروسيتوسيد. كما يصف لنا في الثقافة وإعداد خطوط الخلايا J774.2 و THP-1 للاستخدام افيروسيتيس مورين والبشرية، والمشتقة من الوحيدات الضامة M2 كمثال على افيروسيتوسيس الخلايا الأولية والخلايا جوركات لاستخدامها كأهداف افيروسيتيك. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على خطوط الخلية أو الخلايا الأولية، إلى خلايا الهدف تمر بأي شكل من موت الخلية (مثل المبرمج ونخر نيكروبتوسيس)، وإلى يقلد ميكرون الحجم التي تحاكي apoptotic الخلايا عن طريق الطلاء الدهني أخرى أو طلاء مع يغاندس محددة لمستقبلات افيروسيتيك اهتمام.

الطريقة المبينة في هذا البروتوكول له العديد من المزايا التدفق الخلوي على أساس الأساليب استخداماً في الميدان23،24. قبل التصوير مباشرة التفاعل خلية بلعمية-أبوبتوتيك، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات واضحة كل المواد خلية apoptotic التام وغير مستوعبة، يمكن إجراء قياسات كمية افيروسيتوسيس. وعلاوة على ذلك، يحد استخدام fluorophores غير متحسسة للأس الهيدروجيني العوامل المؤثرة الأخرى مثل قمع fluorescence فيتك والتجارة والنقل على درجة الحموضة الليزوزومية أن يفند بعض الأساليب البديلة25. وأخيراً، حين لا يصف بالتفصيل، هذه الأساليب يمكن أن تستخدم باستخدام افيروسيتيس الإعراب عن المتسلسلات المسمى فلوريسسينتلي، أو مع إيمونوستينينج بعد انتهاء التثبيت، للسماح للتحديد الكمي ليشير إلى نشاط الجزيء ورصد العمليات الخلوية أثناء افيروسيتوسيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

واعتمد المجلس أخلاقيات بحوث العلوم الصحية من جامعة أونتاريو الغربية جمع الدم من المتطوعين صحية. وأجرى فينيبونكتوري وفقا للمبادئ التوجيهية "بيان السياسة العامة" ثلاثي-مجلس البحوث البشرية.

1-الثقافة وإعداد خط الخلية الوحيدات THP-1

  1. الثقافة وحيدات THP-1 كثقافة وقف في قوارير T25 عند 37 ° C + 5% أول أكسيد الكربون2. ينبغي أن تزرع الخلايا في 5 مل من روزويل بارك التذكاري معهد 1640 (RPMI 1640) + 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
  2. كل يوم تعليق الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء وسائط النمو التي تهز بلطف قارورة، ثم فورا عد الخلايا التي تحتوي هيموسيتوميتير. ينبغي أن يكون باساجيد الخلايا حالما تصل كثافة الخلية إلى 1 × 106 خلايا/مل:
    1. قبل الحارة RPMI 1640 + 10% FBS في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. نقل 2 × 105 خلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل أو 15 مل أنبوب مخروطي، وخلايا بيليه سينتريفوجينج في 500 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلايا وريسوسبيند بيليه في 1 مل (1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب) أو 5 مل (أنبوب مخروطي 15 مل) من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
    4. إزالة أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 500 غرام x في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 برنامج تلفزيوني دون إزعاج بيليه الخلية.
    5. بيليه ريسوسبيند في 1 مل الطازجة RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. في مكان قارورة T25 جديد 4 مل تحسنت وسائل الإعلام، وهذا إضافة الخلايا ريسوسبينديد من 1.2.5. الثقافة في 37 ° C + 5% CO2 حاضنة حتى تتطلب الخلايا باساجينج (عادة 3 أيام)، أو حتى الخلايا مطلوبة لتجربة.
  3. لتجربة مع THP-1-المستمدة الضامة، إزالة العدد المطلوب من الخلايا من قارورة ولوحة قبل باساجينج:
    1. ضع العدد المطلوب من 18 ملم دائرية زجاج كوفيرسليبس (سمك #1.5) إلى الآبار للوحة 12-جيدا-1 عادة ساترة كل شرط و/أو تيميبوينت. إلى كل خير الكوة 5 × 104 THP 1 وحيدات. وأضاف العدد الخلايا يمكن تغيير لكل بئر، إذا لزم الأمر.
    2. إحضار الحجم الإجمالي لكل منها يحتوي على الخلية جيدا إلى 1 مل باستخدام ربمي + 10% FBS ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 100 نانومتر phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لكل بئر والثقافة لمدة 3 أيام للحث على التفريق بين وحيدات THP-1 داخل الخلايا مثل بلعم.

2-الثقافة وإعداد خط خلية سنخية J774.2

  1. الثقافة J774.2 الخلايا في قوارير T25 عند 37 ° C + 5% أول أكسيد الكربون2. يجب أن تزرع الخلايا في 5 مل من دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم) + 10% FBS وباساجيد بمجرد الثقافة تصل إلى 80-90% كونفلوينسي. لمرور الخلايا:
    1. قم بإزالة جميع وسائل الإعلام من قارورة والارتفاع مرة واحدة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني من قارورة واستبدال مع 5 مل من جديد دميم + 10% FBS.
    3. باستخدام مكشطة خلية، كشط الجزء السفلي لقارورة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام. قوة "الماصة؛" الخلايا عدة مرات لتفريق أي المجاميع الخلية.
    4. تمييع الخلايا 1:5 بإزالة 4 مل تعليق خلية من قارورة والاستعاضة عنه مع 4 مل وسائط جديدة. يمكن تجاهل تعليق خلية المتبقية، المستخدمة لبدء تشغيل ثقافة خلية جديدة في قارورة T25 جديدة، أو المستخدمة لتجربة.
  2. لإعداد للانزيم افيروسيتوسيس استخدام خلايا J774.2:
    1. يوم واحد قبل البدء التجربة، تعليق الخلايا J774.2 إلى 5 مل وسائط جديدة، وفقا للخطوات 2.1.1–2.1.3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وإعداد وحدة التخزين اللازمة للخلايا بتركيز من 5 × 104 خلايا/مل.
    2. ضع العدد اللازم من 18 ملم دائرية زجاج كوفيرسليبس (سمك #1.5) إلى الآبار للوحة 12-جيدا. إلى كل خير الكوة 1 مل من 5 × 104 خلايا/مل تعليق خلية.
    3. الثقافة بين عشية وضحاها للسماح للخلايا للتمسك ساترة والتعافي من باساجينج.

3-ثقافة الضامة M2 البشرية الأولية

  1. جمع 10 مل دم البشري هيبارينيزيد لكل لوحة 12-جيدا من الضامة M2 المطلوبة.
  2. في أنبوب الطرد مركزي 15 مل، طبقة 5 مل دم البشري على رأس 5 مل من الخلية بولي ليمفوليتي دافئة قبل فصل المتوسطة. إعداد أنابيب متعددة إذا كان تجهيز > 5 مل من الدم بدلاً من استخدام أنابيب حجم أكبر.
  3. الطرد المركزي في 300 غ س ل 35 دقيقة، استخدام التسارع المتوسط وعدم انقطاع.
  4. بعناية إزالة الفرقة الغنية وحيدات النوى الخلية العلوي باستخدام بيبيتور البلاستيك ونقلها إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل. إذا تم إعداد أنابيب متعددة في الخطوة 3، 2، يمكن تجميع العصابات في أنبوب واحد 50 مل. إعادة التخزين من أنبوب يصل إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني.
  5. الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 8 دقائق وإزالة المادة طافية. أثناء هذه الخطوة وضع يعقم 18 ملم كوفيرسليبس دائرية قطرها (سمك #1.5) إلى كل من صفيحة 12-جيدا جيدا.
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في 300 ميليلتر من 1640 ربمي خالية من المصل كل العدد المطلوب من الآبار؛ مثلاً، إذا تمت معالجة 10 مل دم تحضير طبق جيدا كامل 12، تعليق خلية بيليه في 3.6 مل من وسائل الإعلام.
  7. إضافة 300 ميليلتر من تعليق خلية لكل ساترة تتضمن أيضا في لوحة 12-جيدا. احتضانها ح 1 في 37 ° C + 5% أول أكسيد الكربون2.
  8. تغسل بلطف ساترة 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون لإزالة أي من الخلايا غير ملتصقة.
  9. أضف 1 مل RPMI 1640 + 10% FBS + 10 نانوغرام/مل المؤتلف البشرية M CSF + خلية ثقافة المضادات الحيوية/فطري. احتضان عند 37 ° C + 5% CO2 لمدة 5 أيام.
  10. استبدال وسائط الإعلام مع RPMI 1640 + 10% FBS + 10 نانوغرام/مليلتر الماشوب البشري م-CSF + 10 نانوغرام/مليلتر الماشوب البشري إيل-4 + خلية ثقافة المضادات الحيوية/فطري. احتضان عند 37 ° C + 5% CO2 لمدة يومين لاستكمال الاستقطاب M2.
  11. وينبغي استخدام الضامة الاستقطاب داخل مدة 3 أيام.

4-إعداد الخلايا جوركات أبوبتوتيك

  1. الثقافة الخلايا جوركات في 5 مل من RPMI 1640 + 10% FBS في 37 ° C + 5% أول أكسيد الكربون2. جوركاتس خط خلية تعليق ويمكن الحفاظ على طريق باساجينج 1:5 في وسائل الإعلام الطازجة، تحسنت قبل كل 3 – 5 أيام.
  2. لإعداد الخلايا أبوبتوتيك، تسمح لثقافة جوركات تنمو بكثافة عالية (4-5 أيام بعد باساجينج). الكوة 1.5 مل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة وبيليه خلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 500 x لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق خلية بيليه في 1 مل متوسطة RPMI 1640 خالية من المصل الذي يحتوي على 1 ميكرومتر ستوروسبوريني.
  4. احتضان ح 16 عند 37 ° C + 5% CO2 تقديم أبوبتوتيك الخلايا.
  5. إذا رغبت في ذلك، تأكيد التعريفي للمبرمج تلطيخ مع "أنيكسين الخامس:"
    1. الكوة 100 ميليلتر من ستوروسبوريني معاملة جوركات خلية ثقافة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 500 x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميليلتر في المتوسط RPMI 1640 خالية من المصل.
    2. أضف 1 ميليلتر من fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مترافق "أنيكسين الخامس" واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    3. إضافة 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل وحدة التخزين بأكملها إلى بئر واحدة من صفيحة 12-كذلك يتضمن ساترة زجاجية دائرية 18 مم (سمك #1.5). تدور إلى أسفل في أجهزة الطرد مركزي مزودة بمحول لوحة في 200 غ س ل 1 دقيقة لإجبار الخلايا على التمسك ساترة. وبدلاً من ذلك، يمكن وضع الخلايا إلى شريحة غرف للتصوير.
    4. صورة باستخدام مجهر الأسفار.

5-التحديد الكمي لامتصاص افيروسيتيك وديناميات استخدام الإنزيم افيروسيتوسيس خلية ثابتة وتلطيخ من الداخل إلى الخارج

  1. إعداد THP-1 أو J774.2 أو M2 الضامة البشرية كما هو موضح في المقاطع 1-3، على التوالي.
  2. إعداد المساء قبل البدء التجربة أبوبتوتيك الخلايا جوركات كما هو موضح في القسم 4.
  3. فورا قبل التجربة، عد الخلايا أبوبتوتيك باستخدام هيموسيتوميتير. نقل العدد الكافي من الخلايا أبوبتوتيك في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل – نحن عادة إضافة الخلايا 5 × 105 /حسنا، توفير نسبة هدف: افيروسيتي 10:1.
  4. بيليه جوركات الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز x 500 لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
  5. أثناء استخدام الطرد المركزي، اليكووت ميليلتر 10 من [دمس] في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. يذوب في [دمس] قدر ضئيل من N-هيدروكسيسوكسينيميدوبيوتين (دائرة الصحة الوطنية--البيوتين). 5-10 بلورات (~0.005 mg) غير كافية.
  6. نقل 500 تعليق خلية/برنامج تلفزيوني apoptotic ميكروليتر إلى [دمس]/دائرة الصحة الوطنية--البيوتين الذي يحتوي على أنبوب. ثم يضعف خلية تتبع صبغة بتركيز الموصى بها الشركة المصنعة في تعليق خلية أبوبتوتيك. جعل معينة لتحديد خلية تتبع صبغة لا تتداخل طيفيا فيتك-ستريبتافيدين (مثل الأحمر أو استعملنا خلية تتبع صبغ).
  7. احتضان تعليق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إضافة وحدة تخزين تساوي RPMI 1640 + 10% FBS واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لإخماد أي صبغة الممتص.
  8. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 500 x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، وإعادة تعليق الخلايا apoptotic الملون في 100 ميليلتر من RPMI 1640 + 10% FBS الواحدة من الضامة جيدا.
  9. إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية apoptotic ملطخة دروبويسي لكل بئر من الضامة. الطرد المركزي 200 غ س ل 1 دقيقة في أجهزة الطرد مركزي مزودة بمحول لوحة لقوة الاتصال بين خلايا أبوبتوتيك والضامة.
  10. احتضان لوحة للفترة الزمنية عند 37 ° C + 5% CO2 في حاضنة استنبات الأنسجة المطلوب. افيروسيتوسيد المواد الضامة، عادة أول يمكن اكتشافها بعد 20-30 دقيقة، وتكتمل بعد 120 – 180 دقيقة.
  11. وفي الوقت المطلوب إزالة نقطة (نقاط) خلايا من الحاضنة. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني لوقف افيروسيتوسيس وإزالة الخلايا أبوبتوتيك غير افيروسيتوسيد.
  12. إضافة streptavidin مترافق FITC في إضعاف 1:1,000 لكل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام. هذا وسوف تسمية البيوتين المكشوفة في أي مادة الخلية أبوبتوتيك غير افيروسيتوسيد.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، نواة الخلية يمكن أن تكون الملون أثناء هذه الخطوة بالإضافة لتمييع هويشت 33342 1:20,000 أو 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد (DAPI).
  13. يغسل خلايا 3 مرات مع 1 مل برنامج تلفزيوني، برفق الهز أو هزاز العينات لمدة 5 دقائق كل الشطف. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الزائدة منهاج عمل بيجين.
  14. جبل كوفيرسليبس على شريحة لتصوير ونقل إلى مجهر الأسفار. التقاط z-رزمة عدد كاف من الخلايا للقياس الكمي الدقيق – عادة 10-30 في خلايا كل حالة. عدم استيعاب apoptotic خلية المواد ستكون الظاهر في الصورة الناتجة كخلية تتبع صبغ المسمى المواد المغلفة تلطيخ فيتك-streptavidin، بينما تشكل المواد افيروسيتوسيد خلية منفصلة تتبع بونكتا صبغة خالية من أي ستريبتافيدين تلوين.
  15. قياس افيروسيتوسيس في الصور الناتجة عن طريق مجموعة متنوعة من التدابير:
    1. حساب مؤشر افيروسيتيك بتحديد متوسط عدد افيروسوميس منفصلة (خلية تتبع صبغ+بونكتا/streptavidin– ) كل بلعم. قياس فقط الضامة منضمة إلى خلية أبوبتوتيك أو التي تحتوي على إيه وان افيروسوميس مرئية. سجل الضامة ملزمة الخلية أبوبتوتيك، ولكن ينقصها افيروسوميس منفصلة، كوجود فهرس افيروسيتيك 0.
    2. حساب الكفاءة افيروسيتيك بقياس جزء صغير الضامة التي تحتوي على افيروسومي إيه وان.
    3. حساب معدل افيروسيتوسيس بخلايا التصوير الثابت والملون في نقاط زمنية متعددة. فقط صورة الضامة منضمة إلى خلايا أبوبتوتيك، أو التي تحتوي على افيروسوميس مرئية، مع المكدسات z القبض على كل خلية. وبمجرد تصويرها، تحديد سعر افيروسيتوسيس:
      1. استخدام تلطيخ streptavidin كدليل، وأداة التحديد اليدوي أو مضلع في فيجي/إيماجيج26 (أو حزمة برمجيات تحليل الصورة الأخرى)، ضع دائرة حول كل خلية تتبع صبغ+/streptavidin– (مثل استيعاب) مادة في طائرة واحدة من z-المكدس. قياس كثافة تكاملاً خلية تتبع صبغ هذه المنطقة. التدابير الفردية لكل15،افيروسومي (مثل القطر لتحديد المواقع بالنسبة إلى حد الخلية أو النواة، إلخ)27 يمكن بسهولة الحصول عليها في وقت واحد مع هذه القياسات، إلى حد كبير زيادة البيانات التي جمعت أثناء التحليل.
      2. في الجزء z نفسه، استخدام streptavidin تلطيخ كدليل وأداة التحديد اليدوي أو مضلع، دائرة كل خلية تتبع/streptavidin صبغ++ (مثلاً غير مستوعبة) المواد في طائرة واحدة من z-المكدس . لا يتضمن سوى تلطيخ من الخلايا أبوبتوتيك على اتصال بلعمية. قياس كثافة المتكاملة لهذه المنطقة.
      3. كرر الخطوات 4.2.3.1 إلى 4.2.3.2 z-الأقسام المتبقية من الصورة. مجموع كثافة المتكاملة افيروسيتوسيد (Σeff) والمواد غير افيروسيتوسيد (Σني). يمكن حساب جزء صغير الخلية أبوبتوتيك التي تم افيروسيتوسيد للخلية ك:
        Equation
      4. قياس افيروسيتوسيد الكسر لكافة الخلايا الموجودة في كافة النقاط الزمنية. نلاحظ أن شدة الفلورسنت apoptotic الخلايا/افيروسوميس يمكن أن تختلف بين الصور بسبب الاختلافات في الامتصاص خلية تتبع الأصباغ بالخلايا أبوبتوتيك الفردية، ونتيجة للتغيرات في صورة اقتناء المعلمات مثل وقت التعرض. على هذا النحو، تطبيع فقط مقارنة القيم من قبيل "افيروسيتوسيد كسر"، أو قيم كثافة مستقلة مثل مؤشر افيروسيتيك والكفاءة افيروسيتيك، بين الصور وبين الظروف التجريبية، وبين تكرار التجارب.
    4. للتأكد من مجموعة البيانات الناتجة عن ذلك يعبر بدقة عن الاختلاف في افيروسيتوسيس بين الخلايا، إجراء هذه التحليلات على الحد الأقصى لعدد الخلايا الممكنة في كل تجربة.
      ملاحظة: مؤشر الكفاءة وافيروسيتيك افيروسيتيك ويمكن حساب سرعة (بضع ثوان في الخلية)، ونحن نهدف عادة لتحليل خلايا على الأقل 100 كل تجربة، وتكرار التجربة كل 3 مرات على الأقل. حساب جزء افيروسيتوسيد المادية، والتدابير الخاصة افيروسومي هي أكثر شاقة، عادة أخذ 2 – 3 دقيقة/الخليوي لأحد المحللين ذوي خبرة. لهذه الحسابات ونحن تحديد الحد ني خلايا 15 كل حالة، وكل تجربة.
    5. مؤشر السجل افيروسيتيك وكسر افيروسيتوسيد والبيانات افيروسومي الفردية على أساس كل خلية.
      ملاحظة: هذا يسمح لتحليل البيانات باستخدام النهج خلية واحدة، مما يسمح للاختلافات بين الخلية كمياً. يمكن إجراء تحليل مستوى السكان لا يزال على هذه البيانات بحساب متوسط البيانات خلية واحدة المكتسبة من التجارب الفردية. يمكن تحليل القياسات الخاصة افيروسومي على مستوى السكان، مستوى خلية واحدة، والفرق (مثلاً كسكان افيروسوميس مستقلة عن الخلايا التي تحتوي عليها)15.

6-تعيش الخلية باستخدام خلايا Apoptotic الإنزيم افيروسيتوسيس

  1. إعداد الضامة THP-1 أو J774.2 أو M2 كما هو موضح في الخطوات 1-3، على التوالي. إذا لزم الأمر، يجب أن تكون transfected الخلايا مع المتسلسلات أو بنيات أخرى وراثية على الأقل 18 ح قبل إجراء أي تجارب.
  2. المساء قبل البدء التجربة، إعداد أبوبتوتيك جوركات الخلايا كما هو موضح في المقاطع 4 و 5 مع التعديلات التالية:
    1. تمييع الخلايا ويحفز المبرمج حسب 4، 1-4-3، وجمع العدد المطلوب من الخلايا apoptotic حسب 5.3 – 5.4.
    2. إضافة خلية تتبع صبغة بتركيز الموصى بها الشركة المصنعة إلى تعليق خلية أبوبتوتيك. احتضان تعليق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إضافة وحدة تخزين تساوي RPMI 1640 + 10% FBS واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لإخماد أي صبغة الممتص. لا تقم بإضافة دائرة الصحة الوطنية--البيوتين لهذه التجارب.
    3. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 500 x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، وإعادة تعليق الخلايا apoptotic الملون في 100 ميليلتر من RPMI 1640 + 10% FBS الواحدة من الضامة جيدا.
  3. إذا لزم الأمر، إضافة تسمية الضامة بإزالة ثقافة وسائل الإعلام من كل بئر وإضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على المصنعين أوصت تمييع خلية تتبع صبغة لا تتداخل طيفيا بخلية تتبع صبغ الخلايا أبوبتوتيك أو لأي الفلورسنت المتسلسلات التي الضامة أعرب عنها. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، ثم إضافة وحدة تخزين تساوي دميم + 10% FBS واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لإخماد أي صبغة الممتص.
  4. نقل ساترة المحتوية على بلعم إلى دائرة ليدن. إضافة 400 ميليلتر من دميم + 10% FBS، تليها 100 ميليلتر من تعليق خلية مسماة أبوبتوتيك. المزيج بلطف بيبيتينج وسائل الإعلام 2 – 3 مرات.
  5. نقل الدائرة ليدن مياه دافئة وأول أكسيد الكربون2-الدائرة perfused مجهر فلوري خلية حية.
    ملاحظة: للمجهر على الأجهزة التي تفتقر إلى قدرات نضح2 CO، استخدام أنسجة المتوسطة الثقافة مخزنة مع 1 ملم حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 4 (حبيس) بدلاً من بيكربونات الصوديوم للحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية في حين الثقافة معرضة للهواء.
  6. التقاط سلسلة الوقت الفاصل بين التي تحتوي على صورة ضوء أبيض (مرحلة التباين أو DIC)، وصور لكافة التسميات الفلورسنت:
    1. استخدام عدسة هدف X 100 للتجارب حيث يتم تسوية التفاصيل الدقيقة المطلوبة (مثلاً غشاء ديناميات التفاعل خلية بلعمية-أبوبتوتيك). من جهة أخرى، تدابير أكثر عمومية (معدل امتصاص الخلية أبوبتوتيك، ووقت التفاعل بين الضامة، والخلايا أبوبتوتيك، إلخ) يتم تصويرها أفضل استخدام X 60 أو 63 X الهدف.
    2. إذا كانت متوفرة، استخدم نقطة-زيارة لصورة متعددة الحقول لعرض خلال عملية شراء واحدة، وبالتالي زيادة عدد الأحداث افيروسيتيك اعتقل في تجربة واحدة
    3. لأنه غالباً ما تبتلع افيروسيتيس أجزاء صغيرة من الخلايا أبوبتوتيك، بدلاً من خلايا سليمة، فمن الأفضل لالتقاط مكدسات z. للتقليل من الضيائية، التقاط z-أقسام مفصولة بعمق التنسيق الخاص بك الهدف المجاهر (عادة 0.5 – 1.0 ميكرومتر)، من خلال سمك الخلية (عادة 8-10 ميكرون الضامة، مثلاً 8 – 20 شرائح/الخلية). وهذا ما يضمن أن جميع الإحاطة والاتجار الأحداث ستكون مرئية في z-طائرة واحدة على الأقل. بدلاً من ذلك، استخدام كبيرة (1 – 5 ميكرون القطر) apoptotic خلية يقلد أو خلايا أبوبتوتيك التي يخضع لها تفتيت الحد الأدنى أثناء افيروسيتوسيس (مثل الحرارة صدمة العَدلات) بدلاً من ذلك دون التراص z. لقد قمنا بوصف إعداد يقلد والعدلات apoptotic سابقا28.
    4. لتصغير فوتوبليتشينج، واستخدام فلوروفوريس مشرق والتقاط صور استخدام إعدادات اقتناء التي تقلل من فوتوبليتشينج — مثل الإثارة المنخفضة الكثافة جنبا إلى جنب مع كاميرا عالية الربح والتعرض القصير مرات29. نوصي بشدة باستخدام مجهر مجهز بكاميرا عالية الحساسية كهرومغناطيسية جهاز اقتران (م-اتفاقية مكافحة التصحر) أو القرص الغزل [كنفوكل] ومرحلة كهرضغطية ميكانيكية عالية السرعة، لهذا الشكل من التصوير.
  7. العدد أساليب التحليل الممكنة التي يمكن تطبيقها على أشرطة الفيديو هذه الوقت الفاصل بين الواسعة ويتجاوز قدرتنا على استعراض هنا. كأمثلة على ذلك، استخدام اليدوي أو الآلي تتبع البرمجيات لتتبع الانصهار والانشطار وحركة افيروسوميس داخل الخلايا15، قياس ديناميات الانصهار افيروسومي مع اندوليسوسوميس بتحليل كولوكاليزيشن في الضامة معربا عن تحديد المتسلسلات الفلورسنت الخاصة بحجرة13، رصد الإقبال على عمليات مثل عمليات التدقيق وكأس تشكيل30، ديناميات توظيف الإشارات والاتجار بالبروتينات افيروسومي13، و/أو قياس نشاط بوليمرات افيروسوميس باستخدام خلايا apoptotic المسمى مع فلوروفوريس حساسة لدرجة الحموضة، مراعية للأكسدة أو تنشيط حوزتي31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بين عشية وضحاها ثقافة خلايا جوركات مع staurosporine ميكرومتر 1 ينتج المبرمج من > 95% خلايا التي يمكن تأكيدها بالخامس Annexin تلطيخ (الشكل 1). يمكن استخدام أنواع الخلايا الأخرى لهذه التجارب، على الرغم من أن تركيز ستاوروسبوريني ومدة العلاج ستاوروسبوريني سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل خط الخلية. للكشف عن موثوقة والتحديد الكمي افيروسيتوسيس، > ينبغي أن 80% خلايا أبوبتوتيك قبل إضافتها إلى افيروسيتيس. مستحثات أخرى من المبرمج (مثل الحرارة-الصدمة واتوبوسيدي والأشعة فوق البنفسجية-الضوء) يمكن أن تستخدم أيضا، ولكن في تجربتنا، تنتج هذه تحريض غير متجانسة أكثر المبرمج والنتيجة في الخلية المختلطة السكان التي تحتوي على أبوبتوتيك، الثانوية نخرية و الخلايا الهدف غير أبوبتوتيك.

لتصوير الخلية ثابت مع تلطيخ من الداخل إلى الخارج، ينبغي أن تراعي التفاعلات الخلية أبوبتوتيك افيروسيتي الرئيسي يعارضها عن كثب في جميع النقاط الزمنية، مع محددة بوضوح غير افيروسيتوسيد (ستريبتافيدين+/الخليوي تتبع صبغ+) و افيروسيتوسيد (ستريبتافيدين–/الخليوي تعقب+) المواد المرئية (الشكل 2). من المهم أن نلاحظ أن المشبك الذي يشكل بين خلية أبوبتوتيك وافيروسيتي في كثير من الأحيان ضيق ما يكفي لاستبعاد streptavidin، وهكذا ينبغي النظر في أي خلية تتبع الصبغ الملون الكائن إذ تضع ستريبتافيدين في أي نقطة في المحيط ربط الخلية ولا افيروسومي. في معظم التجارب ستزيد جزء صغير خلايا أبوبتوتيك التي يتم افيروسيتوسيد بطريقة تعتمد على الوقت، حتى تبقى أية مواد الخلية غير مستوعبة أبوبتوتيك، أو حتى يصل بلعمية قدرتها القصوى افيروسيتيك (الشكل 3). عادة إجراء التحليل والمسجلة للخلايا المفردة (الشكل 3 أ)، ومع ذلك، بلغ متوسط البيانات عبر الخلايا ضمن التجارب الفردية والقيم المتوسطة من يكرر تجريبية متعددة تم تحليلها مع التقليدية النهج الإحصائي (الشكل 3B). يمكن إجراء التعديلات لهذا البروتوكول الموحد إفساح المجال لاستخدام أنواع الخلايا الابتدائية، أهداف افيروسيتيك البديلة، وتلطيخ إضافية لإدراجها. على سبيل المثال، يبين الشكل 4 الابتدائي الاستقطاب M2 بشرية بلعم له افيروسيتوسيد أبوبتوتيك خلية يقلد تضم 3 ميكرومتر الخرز والسليكا القطر المغلفة بخليط فوسفاتيديلسيريني و phosphatidylcholine28، تليها التثبيت لاحقاً، وبيرميبيليزيشن وإيمونوستينينج لعلامة دخلول إعادة التدوير Rab17.

خلال الخلايا الحية التصوير افيروسيتيك البالعات المهنية وسيتبع لتمديد والتراجع عن عمليات صغيرة في عملية تسمى "التدقيق"30 (الشكل 5، t = 0)؛ عندما تواجه هذه العمليات هدف بشدة الالتزام بالهدف واستدراجه إلى بلعمية. لا يمكن ملاحظة هذا النشاط السبر مع البالعات غير الفنية مثل الخلايا الظهارية. ثم ستشكل ضيق افيروسيتي "افيروسيتيك المشبك"32 بين نفسها وبين الخلية أبوبتوتيك، مع هذا المشبك غالباً ما تخيم على جزء كبير من الخلايا أبوبتوتيك (الشكل 5، t = 10). ثم ستعتمد افيروسيتي قطعة من الخلية أبوبتوتيك من هذا المشبك في سيتوسول به (الشكل 5، 10 – 30 دقيقة). فور تشكيلها، يتم الاتجار بهذه افيروسوميس الوليدة بعيداً عن المشبك ونحو المنطقة المحيطة النووية، نتيجة Rab7/ريلب/دينين-ديناكتين بوساطة النقل33. مع مرور الوقت سوف يتقلص افيروسوميس والمواد المتدهورة الناتجة عن إعادة توزيع في جميع أنحاء الخلية، حيث من المرجح استيعاب أو إعادة تدويرها13،15. القدرة على الكشف عن هذه العمليات يعتمد اعتماداً كبيرا على اقتناء الإطار معدل ومدة التجربة. لا يمكن ملاحظة عمليات سريعة مثل التدقيق في انخفاض معدلات الإطار، بينما تتطلب الأحداث بطيئة (الاتجار افيروسومي والاستيعاب) أطول فترات التصوير – وفي كلتا الحالتين، غالباً ما تتطلب هذه المقتنيات الصورة الكبيرة التقاط الصور المنخفضة الكثافة للحد من فوتوبليتشينج والضيائيه (الشكل 5). كما هو الحال مع فحص خلايا ثابتة، يمكن تعديل الصيغة خلية يعيش من هذا التحليل لتناسب احتياجات المحقق. ويبين الشكل 6 إطار واحد لاقتناء خلية حية الضامة J774.2 الإعراب عن المتسلسلات التي ديمارك فلوريسسينتلي غشاء البلازما (م-التجارة والنقل) والذي يربط بشكل انتقائي الدهن يشير PI (3) ف (فيفي-RFP). ويمكن الكشف عن جيل PI (3) ف على الغشاء افيروسومي كالتعريب المشارك من فيفي-طلب تقديم العروض مع الغشاء افيروسومي م-التجارة والنقل+ . بقياس كثافة فيفي-طلب تقديم العروض على افيروسومي، يمكن قياسها كمياً ديناميات ف PI (3) إشارات على افيروسومي (الشكل 6).

Figure 1
رقم 1: أنيكسين V تلطيخ Apoptotic والخلايا غير أبوبتوتيك جوركات-- أننيكسين V تسميات في فوسفاتيديلسيريني "أكل-لي" إشارة كشفها بواسطة الخلايا أبوبتوتيك. (أعلى) غير المعالجة جوركات (UT) خلايا عرض مورفولوجية صحية (السلس وتقريبه) (DIC) ووصمة عار لا مع "أنيكسين ف" (أسفل) جوركات الخلايا المزروعة بين عشية وضحاها مع staurosporine ميكرومتر 1 (STS) تحمل مورفولوجيا apoptotic (عدم انتظام وبليبيد) ووصمة عار مع بار "أننيكسين V. مقياس" = 10 ميكرومتر، كثافة الصورة معروضة كمخطط لون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الإحاطة المبكرة والمتأخرة من جوركات أبوبتوتيك الخلايا التي الضامة J774.2. الصور من الضامة في وقت مبكر (60 دقيقة)، والمرحلة المتأخرة (120 دقيقة) من افيروسيتوسيس. الضوء الأبيض (DIC) صورة توضح واجهة ضيقة بين بلعم (mφ) وخلية أبوبتوتيك (AC). خلية تتبع صبغة (اجتماعان، أحمر) يكشف عن الموقع من جميع المواد المستمدة من الخلايا أبوبتوتيك. فيتك-Streptavidin تلطيخ (Str) الأخضر يحدد جزء الخلية أبوبتوتيك التي قد لا بعد تم غارقة في بلعم. وكانت نويات بلعم ملطخة مسبقاً مع DAPI (أزرق). سهولة تحديد افيروسوميس (أحمر) مقابل الجزء غير مستوعبة لخلية apoptotic (الأخضر/الأصفر) في تراكب ستريبتافيدين وخلية تتبع الصور صبغ. ملاحظة عدم وجود streptavidin تلطيخ في واجهة الخلية بلعم-أبوبتوتيك في تيميبوينت المبكرة، تم إنشاؤها بواسطة استبعاد ستريبتافيدين من المشبك افيروسيتيك شكل محكم (*). يتم تعريف نواة بلعم بواسطة هويشت تلطيخ (أزرق). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الوقت--دورة من جزء صغير من الخلية أبوبتوتيك افيروسيتوسيد التي الضامة J774.2. وأجريت فحوصات افيروسيتوسيس للمشار إليه مرات، وجزء صغير من مادة الخلية apoptotic اجتاحت العزم عند كل نقطة وقت استخدام خلية تتبع تلطيخ صبغ/ستريبتافادين. (أ) جزء من المواد افيروسيتوسيد داخل الضامة الفردية، يتم تقديم البيانات من الخلايا الفردية، شريط أفقي يشير إلى الوسط. 12 – 17 الخلايا كل حالة، والبيانات من 1 5 تجارب مستقلة. (ب) جزء من المواد افيروسيتوسيد، وبلغ متوسط عبر 5 تجارب مستقلة، على الأقل 10 خلايا/شرط/تكرار. ف < 0.05 بالمقارنة مع 30 دقيقة، اختبار كروسكال-واليس مع تصحيح دن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحليل للتوظيف Rab17 إلى افيروسوميس في الضامة البشرية الأساسية- بلعم الاستقطاب M2 apoptotic خلية يقلد (الأسهم) وكان إيمونوستاينيد ل Rab17 (الأخضر) 60 دقيقة بعد الإحاطة. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. نواة الخلية هي ملطخة هويشست، والصورة DIC يظهر مورفولوجيا الخلايا ويستخدم لتحديد apoptotic خلية يقلد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: خلية يعيش بالانزيم افيروسيتوسيس. تم تسجيل خلية تتبع صبغ labeledJ774.2 بلعم (mφ، الأخضر) كما أنها اجتاحت خلية جوركات أبوبتوتيك المسمى مع خلية لون مختلفة تتبع صبغة (AC، أحمر). يتم تقسيم الخلية أبوبتوتيك إلى أجزاء متعددة أثناء عملية الاستيعاب، مما يؤدي إلى امتصاص مجزأة وتشكيل افيروسوميس متعددة (الأسهم). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: استخدام المتسلسلات الفلورسنت للتحقيق مما يشير إلى افيروسيتيك- بلعم J774.2 تم transfected مع علامة معلم بروتينات فلورية خضراء غشاء البلازما (بعد الظهر، الأخضر) وبناء فيفي-طلب تقديم العروض، الذي يربط الدهن يشير PI (3) ف (أحمر). افيروسيتوسيس أشكال افيروسومي المستمدة من غشاء البلازما وليدة التي تحتوي على PI (3) ف، كما تم الكشف عن طريق التعيين فيفي-طلب تقديم العروض (السهم). ديناميات إشارات ف PI (3) كان كمياً كما إضعاف كثافة بالنسبة إلى إشارة فيفي-طلب تقديم العروض الحالية عند الإغلاق افيروسومي نقطة (t = 0، الرسم البياني). تستخدم هذه التجربة حبة محاكاة خلية أبوبتوتيك (السهم، DIC) بدلاً من الخلايا أبوبتوتيك. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول يمكن تصوير والتحديد الكمي لعملية افيروسيتيك الحيوية، واستخدام نهج ثابت-خلية وخلية يعيش. هذه النهج توفر العديد من المزايا على مدى تدفق العاملين عادة الأساليب المستندة إلى الخلوي23،24. ويوفر استخدام التلوين من الداخل إلى الخارج مع عينات الثابتة كمي أكثر قوة وأكثر دقة من معدل ومدى افيروسيتوسيس – في الواقع، العديد من الأساليب القائمة على قياس التدفق ببساطة تسمية الخلايا أبوبتوتيك والضامة مع فلوروفوريس المختلفة، و افيروسيتوسيس نقاط كجزء الضامة تلطيخ يشترك مع علامة الخلية أبوبتوتيك، وبالتالي تفتقر إلى القدرة على التفريق بين الالتزام مقابل مواد الخلية apoptotic المدخلة. وتشمل النهج البديلة التدفق الخلوي استخدام فرودو المسمى apoptotic الخلايا24. فرودو هو fluorophore حساسة لدرجة الحموضة أن الزيادات في السطوع في الأس الهيدروجيني الحمضية. بينما توفر fluorophore هذا القرار أفضل بين غير-استيعابه مقابل المواد المدخلة، كما يزيد من الأسفار على وجه التحديد في أعقاب الاستيعاب الداخلي للخلية أبوبتوتيك وتحمض افيروسومي، يمكن أن تكون النتائج مرتبك قبل عمليات الأمراض التي قد تنال من افيروسومي التحمض34،35، وهذا الأسلوب سوف افتقد افيروسوميس في المراحل الأولى (ما قبل التحميض) من افيروسيتوسيس36، تقع في المناطق الفقيرة تحميض من خلية27، أو في الخلايا التي أسيديفي ضعيفة بهم lysosomes37. وميزة ثانية للأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول هو استخدام خلية يعيش التصوير لقياس ديناميات افيروسيتوسيس، كعمليات مثل عمليات التدقيق، تشكيل المشبك افيروسيتيك، والاتجار بداخل الخلايا من افيروسوميس لا يمكن أن يكون تم الكشف عن استخدام النهج القائم على قياس التدفق.

بينما هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا، والتجارب التي تتطلب التحديد الكمي لمئات عديدة من الخلايا — مثل تجارب الكشف عن الأحداث النادرة، أو التحديد الكمي للعمليات اختلافاً كبيرا – يمكن أن يكون صعباً، مع تحليل لهذه مجموعات البيانات الكبيرة أخذ قدرا هائلا من الوقت. الفائق التصوير النهج مثل التصوير التدفق الخلوي38 قد يسمح لإنتاجية أعلى من الفحص المجهري التقليدي، على الرغم من أن في صورتنا تجربة الآلية الحالية تحليل البرامج ليست دائماً قادرة على دقة تجزئة غير-استيعابه مقابل المواد المدخلة. على وجه التحديد، يمكن استبعاد المشبك افيروسيتيك الضيقة التي تشكل بين الخلية أبوبتوتيك وافيروسيتي ستريبتافيدين تلطيخ، وعلى هذا النحو خلية apoptotic منضم غالباً ما يظهر ككتلة صلبة في خلية تتبع قناة الصبغ، وهو يلفها جزئيا من streptavidin تلطيخ (الشكل 2). وهكذا، بينما هي سهولة تحديد افيروسوميس حسابياً، غالباً ما هو ضريبي جزء منضم لخلية apoptotic افيروسومي نظراً لصعوبة المحاسبة لتلطيخ streptavidin الجزئية. في حين أننا لم تجد برنامج الذي يمكن بدقة تحديد وقياس استيعاب تدريجي apoptotic الخلايا دون المساعدة الإنسانية، وجدنا أن النظم الآلية شبه المدربة39 يمكن أن تعجل إلى حد كبير تحليل، الحد من الكسر قياسات افيروسيتوسيد من 2-3 دقيقة إلى < 60 ثانية لكل خلية. وبدلاً من ذلك، يحاكي خلية apoptotic غير الهضم أو أنواع الخلايا التي تجزئ الحد الأدنى عند المبرمج، يمكن استخدامها بدلاً من ذلك. وهذا يسهل عملية الكشف عن الهياكل واحد، أكبر، الذي قد يكون أكثر قابلية للنهج الآلي وقد تلغي الحاجة إلى التراص z. حتى مع هذه التطورات، بسرعة اقتناء وتحليل لهذا الأسلوب ما زال مقيداً، وعلى هذا النحو التدفق الخلوي يبقى الأسلوب الأنجع عند تحليل أرقام الخلية الكبيرة هو المطلوب23.

على الرغم من أننا قد وصف هذا الأسلوب باستخدام خط الخلية والضامة البشرية الأولية افيروسيتيس وأبوبتوتيك جوركات الخلايا (خط خلية T) كأهداف، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي افيروسيتيك الخلية نوع أو apoptotic الخلية المستهدفة. وفي الواقع، استخدمت نهج مماثلة للتحقيق في افيروسيتوسيس في خلايا الكبد والخلايا الظهارية9،،من4041، وافيروسيتوسيس من الأهداف ذات الصلة سريرياً مثل ورم الخلايا42. قد يكون من الضروري تعديل هذا البروتوكول عند استخدام افيروسيتيس غير المتمتعين بالمناعة، أو عند نمذجة الأحداث افيروسيتيك محددة. على سبيل المثال، جوركات الخلايا غير ملتصقة وذا من غير المحتمل أن تماما الخص قوي ميكانيكية وتواجه القيود المكانية افيروسيتيس عند التفاعل مع الخلايا apoptotic ملتصقة أو apoptotic الخلايا داخل الأنسجة الصلبة. العديد من أنواع الخلايا سوف تحافظ على الالتصاق خلال المبرمج وذلك يمكن استخدامها كأهداف ملتصقة؛ على سبيل المثال، الخضوع خلايا هيلا تكاثر المبرمج الناجمة عن ستوروسبوريني والهرولة فوسفاتيديلسيريني وبلبينغ خلال فترة 4-6 ح مع الحفاظ على التصاق الجسم خلية43. قد تكون الخلايا التي علقت في مصفوفة الكولاجين أو أورجانويدس المستمدة من الخلايا الجذعية44 نماذج محتملة لدراسة افيروسيتوسيس في الأنسجة الصلبة، على الرغم من أننا على علم بأي من الدراسات التي استخدمت هذه النهج. بعض نماذج الخلايا المناعية مثل الخلايا جوركات، وينبغي عدم استخدام العَدلات كأهداف أبوبتوتيك، كما يمكن أن تطلق هذه الخلايا على أساس سيتوكين "العثور على--لي" إشارات مثل CX3CL1 التي قد تكون عامل التباس في نماذج فيها التهابات أو المهاجرة وتشكل عمليات التحقيق45. وهكذا، بينما براعة هذا الفحص يسمح باستخدامه لاستكشاف افيروسيتوسيس عبر مجموعة من أنواع الخلايا ونظم نموذجية، يجب الحرص على تحديد افيروسيتيس المناسبة والخلايا المستهدفة وشروط الثقافة لأفضل نموذج الفسيولوجية عملية قيد التحقيق.

وتهدف فقط كنقطة بداية، مع طبيعة هذه التجارب تمكين طائفة واسعة من التحليلات المستندة إلى تصوير تحليل الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، القياسات افيروسومي لتحديد المواقع وقطرها يمكن جمعها عند إجراء القياسات افيروسيتوسيد الكسر، أو قياس داخل خلية يعيش الوقت-الدورات، من أجل التحقيق في عمليات مثل الاتجار داخل الخلايا افيروسوميس، ومعدل apoptotic خلية تدهور13،15. يمكن استخدام إيمونوستينينج (الشكل 4) للتحقيق تجنيد البروتينات إلى افيروسوميس، في حين يمكن استخدام التصوير الخلية تعيش جنبا إلى جنب مع التحليلات المورفولوجية للتحديد الكمي للعمليات مثل فعالية الربط ومعدلات الإحاطة30 , 46-نحن كثيرا ما إجراء هذه الاختبارات في الضامة معربا عن المتسلسلات فلوري أن التقرير يشير إلى تفعيل جزيء أو نشاط الأحداث الخلوية أثناء افيروسيتوسيس (الشكل 6). تمكين هذه الصحفيين رصد إشارات العمليات خلال افيروسيتوسيس؛ على سبيل المثال، أننا استخدمنا معلم فلوريسسينتلي جتباسيس Rab لاستكشاف دور Rab5، Rab7 و Rab17 في التوسط لتجهيز افيروسومي والاتجار apoptotic المستضدات المشتقة من الخلايا،من1315اللاحقة. وبالمثل، يمكن استخدام إدراج الصحفيين لموت الخلايا وافيروسومي الأس الهيدروجيني وإنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية والعمليات الخلوية الأخرى إلى خلية يعيش تجارب للتحقيق في عمليات الوساطة تدهور افيروسوميس31 ،47. تحديا مشتركاً في هذه التجارب هو تحديد المتسلسلات أو الصحفيين مع fluorophores متوافق؛ في كثير من الأحيان، سوف نقضي على الخلية تتبع صبغ و/أو ستريبتافيدين لتحرير القنوات للتصوير الأخرى fluorophores. لبعض التجارب أنه مفيد لاستبدالها تقليد عدم تفتيت الخلية أبوبتوتيك. وهذا يسمح للتحديد الكمي للإشارات ديناميات والعمليات الخلوية دون تعقيد تتبع افيروسوميس متعددة مستمدة من خلية واحدة أبوبتوتيك. انظر إيفانز وآخرون للحصول على إرشادات حول إعداد apoptotic خلية يقلد28.

صعوبة الأكثر شيوعاً عند تصميم هذه التجارب هو إيجاد مزيج من فلوروفوريس التي تسمح للعمليات المطلوبة تصويرها، مع التقليل من فوتوبليتشينج ولالضيائيه29. اختيار فلوروفوري إلى حد كبير تمليه عوامل التصفية الليزر/الإثارة، ديتشرويكس/مكعبات وعوامل الانبعاثات للمجهر، ومن ثم اختيار فلوروفوريس في كثير من الأحيان محددة لمجاهر الفردية. عموما، أطول طول موجي فلوروفوريس (البرتقالي إلى استعملنا، مثل الانبعاثات ماكسيما > 580 نانومتر) هي أقل عرضه فوتوبليتشينج وهذه الأطوال الموجية أقل إرباكا للخلايا. فلوروفوريس الأخضر (الانبعاثات ماكسيما ~ 525 نانومتر) يمكن استخدامها، ولكن رعاية الاحتياجات التي يتعين اتخاذها للحد من الضيائية إلى الخلايا. فلوروفوريس التي تثير عند أطوال موجية أقل من 480 نانومتر (بنفسجي وأزرق) ينبغي تجنبها نظراً لارتفاع الضيائية والميل لهذه الأطوال الموجية الإثارة التبييض الأخرى فلوروفوريس29. حيثما كان ذلك ممكناً، ينبغي اختيار fluorophores عالية السطوع ومستقرة. وبالمثل، ينبغي تعديل المعلمات اقتناء الصورة إلى أدنى حد من فوتوبليتشينج والضيائيه – مثلاً يعد التعرض في الإثارة منخفض الكثافة المفضلة أكثر من أعلى الكثافات الإثارة48. إضافة مضادات الأكسدة مثل ﺭﻭﺗﻳﻧ، وإزالة بعض مكونات وسائط يمكن تحسين كلا فوتوستابيليتي وتقليل لالضيائيه49. حتى مع الاختيار الدقيق لظروف التصوير وفلوروفوريس، تقتضي الحاجة إلى الحد فوتوبليتشينج في كثير من الأحيان التقاط الصور مع انخفاض نسب إشارة إلى الضوضاء (انظر الشكل 5 على سبيل مثال). إذا كان قياس كثافة الأسفار، عناية كبيرة الاحتياجات التي يتعين اتخاذها للحد من المصنوعات اليدوية في تجهيز الصور؛ ومن الناحية المثالية، يجب أن يتم تحليل الصور الخام دون أي شكل من أشكال المعالجة. إذا ديكونفولفينج الصور قبل القياس الكمي، يجب أن تكون خوارزمية deconvolution يحافظ على شدة الفلورسنت تستخدم50،51.

يعيش خلية الشراء يمكن أن يكون تحديا خاصة، مع التجارب الناجحة التي تتطلب توازناً دقيقا بين كثافة الإثارة ووقت التعرض، ومعدل الإطار، ومدة التجربة. وينبغي تعديل وقت الشدة والتعرض للإثارة لتقليل لالضيائيه كما هو موضح أعلاه، مع التحذير بأن التعرض لأوقات أطول قد يسفر عن التحف الحركة بسبب حركة الخلية أو تحد من معدل الإطار للحصول على. معدل الإطار يمكن أن تختلف تبعاً لمتطلبات التجريبية. انخفاض معدلات الإطار (5 – 30 دقيقة بين الإطارات) السماح للتصوير على مدى فترات طويلة من الزمن (ح 12 أو أكثر) ولكن توفر الحد الأدنى من البيانات على ظواهر مثل ديناميات الغشاء والاتجار بالوظيفة-افيروسيتوسيس افيروسوميس. ارتفاع معدلات الإطار (أسرع وقت 1 إطار في الثانية الواحدة) تقديم الأزمنة ممتازة افيروسيتيك الأحداث والاتجار افيروسومي — ولكن حتى مع التحديد الدقيق فلوروفوريس وشدة الإثارة وأوقات التعرض – فوتوبليتشينج أو الضيائية عادة سوف تحد هذه التجارب لمدة أقل من ساعة. في تجربتنا، الحصول على صور كل 1 – 2 دقيقة، على مدى فترات تجريبية من ح 2 – 6، هي حل وسط مقبول توفر الصور القابلة للقياس الكمي لعدد كاف من افيروسيتيك الأحداث، مع قرار الزمنية المعقولة.

افيروسيتوسيس تغيير وفشل المعروف أن تشارك في أمراض السرطان وتصلب الشرايين واضطرابات المناعة الذاتية متعددة، مع استهداف افيروسيتوسيس العلاجات وعد العظمى إظهار السريرية527،، 53،،من5455. مزيد من التنمية في هذه المجالات وسيتطلب تحديد وتوصيف العمليات الخلوية، مستقبلات ومسارات الإشارات التي تنظم افيروسيتوسيس. الفحص الواردة في هذا البروتوكول ويمثل أداة قوية لهذه الدراسات ويمكن تعديلها للتحديد الكمي للعديد من العمليات الخلوية وإشارات تنظيم افيروسيتوسيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم تمويل هذه الدراسة بالمعاهد الكندية للصحة البحوث (استوفوا) العاملة بمنحه اجتماع الأطراف-123419، والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا اكتشاف منحة 418194، ووزارة أونتاريو للبحوث والابتكار جائزة البحوث المبكرة للبوسنة والهرسك. الورشة ساهمت بعض الصور المعروضة، لتعظيم الاستفادة البروتوكولات وكتابة المخطوطة؛ أنه بتمويل من منحة مضخة فتيلة من جامعة ليفربول. وتمول قبرصي فانييه الدراسات العليا المنح الدراسية، واستوفوا MD/الدكتوراه سنهم. وكان وكالات التمويل أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 138، افيروسيتوسيس، البلعمه، المبرمج، والفحص المجهري، بلعمية، بلعم
التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G.,… More

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter