Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58149
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Summary

Efferocytosis, phagocytic fjerning av apoptotisk celler, er nødvendig for å opprettholde homeostase og er tilrettelagt av reseptorer og signalveier at for anerkjennelse, engulfment og internalisering av apoptotisk celler. Her presenterer vi en fluorescens mikroskopi protokoll for kvantifisering av efferocytosis og aktiviteten til efferocytic signalveier.

Abstract

Studere regulering av efferocytosis krever metoder som er nøyaktig kvantifisere opptaket av apoptotisk celler og undersøke signalnettverk og cellulær prosessene som styrer efferocytosis. Denne kvantifisering kan være vanskelig å utføre apoptotisk celler er ofte efferocytosed stykkevis, dermed nødvendiggjør metoder som kan nøyaktig avgrense mellom den efferocytosed delen av en apoptotisk mål mot gjenværende unengulfed mobilnettet fragmenter. Tilnærmingen skissert heri utnytter dual-merking tilnærminger til å tallfeste nøyaktig dynamikken i efferocytosis og efferocytic antall efferocytes som makrofager. Stoffer til apoptotisk-cellen er merket med en celle-sporing fargestoff aktivere overvåking av alle apoptotisk celle-avledet materiale, mens overflaten biotinylation apoptotisk cellen tillater differensiering mellom internalisert og ikke-internalisert apoptotisk celle fraksjoner. Efferocytic kapasitet på efferocytes bestemmes av tar fluorescerende bilder av live eller fast celler og kvantifisere mengden bundet versus internalisert mål, som atskilte av streptavidin flekker. Denne tilnærmingen gir flere fordeler sammenlignet med metoder som flowcytometri, nemlig nøyaktig avgrensning av ikke-efferocytosed mot efferocytosed apoptotisk celle fraksjoner, muligheten til å måle efferocytic dynamics live-celle mikroskopi, og kapasitet til å utføre studier av mobilnettet signalering i celler som uttrykker fluorescently-merket effekter av transgener. Kombinert, tjene metodene som er nevnt i denne protokollen som grunnlag for en fleksibel eksperimentelle tilnærming som kan brukes til nøyaktig kvantifisere efferocytic aktivitet og undersøke mobilnettet signalveier aktive under efferocytosis.

Introduction

Apoptose, eller programmert celledød, er en sterkt regulert fysiologisk prosess som skjer i de fleste multicellular organismer og er avgjørende for deres utvikling og homeostase1. I tillegg til å være involvert i normal celle omsetning og embryonale utvikling, apoptose gjør fjerning av infiserte eller skadede celler fra vev og kan utløses svar på infeksjon, betennelse, kreft, og også av medisinske tiltak for eksempel strålebehandling eller steroider1. Apoptotisk celler avsløre "spise-meg" signaler på celleoverflaten deres som gjenkjennes av reseptorer på en rekke profesjonelle og ikke-profesjonell phagocytes, kollektivt referert til som "efferocytes". Engasjement i disse reseptorene induserer opptak og nedbrytning av apoptotisk cellen ved efferocyte gjennom en prosess som kalles efferocytosis2,3. Fosfatidylserin er best preget spise-meg signal kjøring efferocytosis. Det er vanligvis begrenset til indre heftet av plasma membranen, med apoptose aktivere en lipid scramblase som forstyrrer denne membranen asymmetri, dermed utsette fosfatidylserin på celle overflaten4. Fosfatidylserin finnes på ekstracellulære overflaten av noen ikke-apoptotisk celler, for eksempel eldre makrofager og aktivert blodplater. Disse cellene er imidlertid ikke efferocytosed av «ikke spise meg» signaler, for eksempel CD47, på deres cellen overflaten5,6,7. Utsatte fosfatidylserin gjenkjennes av en rekke efferocytic reseptorer uttrykt av efferocytes. Binding av disse reseptorene til fosfatidylserin, aktiverer enten direkte eller ved hjelp av opsonins, signalveier som fremmer engulfment til apoptotisk-cellen i en membran-bundet vacuole kalt efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sikringer sekvensielt med endosomes og lysosomer, som leverer den molekylære maskineriet å surheten i efferosome og svekke apoptotisk cellen Last13,14. Når degradert, apoptotisk celle-avledet materiale smugles til gjenvinning endosome – en prosess som begrenser immunreaksjoner mot apoptotisk celle-avledet antigener, og som kan tillate for utvinning av næringsstoffer fra den apoptotisk celle13, 15. Feil i efferocytosis fører til svekket klarering av apoptotisk celler. disse innskuddet cellene gjennom til slutt sekundære nekrose. Nekrotisk celler slipper pro-inflammatoriske cytosolic innholdet, patogener og autoantigens i det ekstracellulære miljøet, dermed kjørte en rekke infeksiøs, provoserende og autoimmune sykdommer16,17. Sammen apoptose og efferocytosis lette fjerning av døende og døde celler og tillate for vedlikehold av vev homeostase.

Undersøker molekylære mekanismer underliggende efferocytosis krever metoder som gir en klar kvantifisering av apoptotisk celle opptak. Denne kvantifisering er komplisert av det faktum at i motsetning til andre opptaket mekanismer som endocytose og fagocytose18,19, efferocytosis ikke kan resultere i engulfment av intakt målcellen, noe som resulterer i stykkevis opptaket apoptotisk cellen av efferocyte20. Protokollen beskrevet her beskriver i vitro efferocytosis analysen som gir nøyaktige avgrensning av den internalisert versus ikke-internalisert deler av personlige apoptotisk celler og kan kombineres med en rekke fast-celle og Live-celle mikroskopi tilnærminger. Tradisjonelle fagocytose analyser legge antistoffer spesifikke phagocytic målet på slutten av eksperimentet for å merke ikke-internalisert mål, mens vår metode forskjellig merking apoptotisk målet med covalently er koblet biotin21 , 22. mens apoptotisk celle spesifikke antistoffer kan brukes i denne analysen biotinylation tilnærmingen gir noe protein-bærende mål merkes og unngår potensielle problemer med sekundær antistoff kryssreaktivitet hvis immunostaining er utført . Spesielt skissere vi utarbeidelsen av apoptotisk Jurkat celler som har vært dobbelt-farget med både celle sporing fargestoff og biotin. Cellen sporing fargestoff tillater apoptotisk celle-avledet materiale sporet under efferocytosis, mens overflaten biotinylation tillater diskriminering av internalisert fra ikke-internalisert deler av efferocytosed apoptotisk celler. Vi beskriver også kultur og utarbeidelse av J774.2 og THP-1 linjer for bruk som murine og menneskelig efferocytes, monocytt-avledet M2 makrofager som et eksempel på primære cellen efferocytosis og Jurkat celler for bruk som efferocytic mål. Disse metodene kan lett brukes på andre linjer eller primære celler, målcellene gjennomgår noen form for celledød (f.eks apoptose, nekrose og necroptosis) og mikron-størrelse imiterer som simulere apoptotisk celler gjennom lipid belegg eller belegg med ligander gjelder for en efferocytic reseptor rundt.

Metoden skissert i denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med flyt cytometri basert metoder som vanligvis brukes i feltet23,24. Ved direkte imaging phagocyte-apoptotisk celle samhandling, kombinert med Fjern merking av både total og ikke-internalisert apoptotisk celle materiale, kan kvantitative tiltak av efferocytosis gjøres. Videre begrenser bruk av pH-ufølsom fluorophores forvirrende faktorer som undertrykkelse av FITC og GFP fluorescens ved lysosomale pH som forundrer noen alternative metoder25. Til slutt, mens ikke beskrevet i detalj, disse metodene kan brukes med efferocytes uttrykke fluorescently-merket effekter av transgener, eller med post fiksering immunostai-, å tillate for kvantifisering Signalering molekyl aktivitet og oppfølging av den cellulære prosesser under efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samling av blod fra friske frivillige ble godkjent av helse vitenskap forskning etikk styret av University of Western Ontario. Venipuncture ble utført i samsvar med retningslinjene i Tri-rådet policyutsagnet på menneskelig forskning.

1. kultur og utarbeidelse av THP-1 Monocyte celle linjen

  1. Kultur THP-1 reaksjoner som en suspensjon kultur i T25 flasker på 37 ° C + 5% CO2. Celler bør dyrkes i 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% fosterets Bovine Serum (FBS).
  2. Hver dag hvile celler hele media vekst av forsiktig risting kolbe, deretter telle umiddelbart celler med en hemocytometer. Cellene må være passaged når cellen tetthet når 1 x 106 celler/mL:
    1. Forvarm RPMI 1640 + 10% FBS i et 37 ° C vannbad.
    2. Overføre 2 x 105 cellene i en 1,5 mL microcentrifuge tube eller en 15 mL konisk rør, og pellets ved sentrifugering på 500 x g ved romtemperatur for 5 min.
    3. Fjern nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet og resuspend pellets i 1 mL (1,5 mL microcentrifuge rør) eller 5 mL (15 mL konisk rør) fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
    4. Sentrifuge røret på 500 x g ved romtemperatur for 5 min. fjerne PBS uten å forstyrre det cellen pellet.
    5. Resuspend pellets i 1 mL av fersk RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. I et nytt T25 kolbe sted 4 mL av varmet media og dette Legg resuspended cellene fra 1.2.5. Kultur i en 37 ° C + 5% CO2 inkubator til cellene krever passaging (vanligvis 3 dager) eller til cellene er nødvendig for et eksperiment.
  3. For et eksperiment med THP-1-derivert makrofager, fjerne det nødvendige antallet celler fra flasken og plate før passaging:
    1. Plasser det nødvendige antallet 18 mm rund glass coverslips (#1.5 tykkelse) i brønnene av en 12-vel plate-vanligvis 1 dekkglassvæske per tilstand og/eller timepoint. Vel aliquot 5 x 104 THP-1 monocytter i hver. Antall celler lagt til hver brønn kan endres, hvis nødvendig.
    2. Oppdra det totale volumet av hver celle som inneholder godt til 1 mL benytter RPMI + 10% FBS varmet til 37 ° C.
    3. Tilsett 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) hver brønn og kultur for 3 dager å indusere differensiering av THP-1 monocytter i macrophage-lignende celler.

2. kultur og forberedelse av J774.2 Macrophage cellen linje

  1. Kultur J774.2 cellene i T25 flasker på 37 ° C + 5% CO2. Celler bør dyrkes i 5 mL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS og passaged når kulturen når 80-90% confluency. Passasjen celler:
    1. Fjern alle medier fra flasken og stige når med 5 mL PBS.
    2. Fjerne PBS fra flasken og erstatte med 5 mL av fersk DMEM + 10% FBS.
    3. Bruker en celle skraper, skraping bunnen av flasken å suspendere cellene i media. Kraftig Pipetter cellene flere ganger for å bryte opp noen celle aggregat.
    4. Fortynne celler 1:5 ved å fjerne 4 mL av cellen suspensjon fra flasken og erstatte den med 4 mL frisk media. Gjenværende celle suspensjon kan forkastet, brukes til å starte en ny cellekultur i en fersk T25 kolbe, eller brukes til et eksperiment.
  2. Sette opp for en efferocytosis analysen ved hjelp av J774.2 celler:
    1. En dag før starten av eksperimentet, suspendere J774.2 celler i 5 mL av fersk media, som per trinn 2.1.1–2.1.3. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og Tilbered nødvendig antall celler i en konsentrasjon av 5 x 104 celler/mL.
    2. Plass det nødvendige antallet 18 mm rund glass coverslips (#1.5 tykkelse) i brønnene av en 12-vel plate. Vel aliquot 1 mL av 5 x 104 celler/mL celle suspensjon i hver.
    3. Kultur over natten slik at cellene overholder dekkglassvæske og passaging.

3. kultur primære menneskelige M2 makrofager

  1. Samle 10 mL heparinized menneskelig blod for hver 12-vel plate av M2 makrofager kreves.
  2. I en 15 mL sentrifuge tube, lag 5 mL av menneskelig blod på 5 mL av forvarmes Lympholyte-poly celle separasjon medium. Forbered flere rør hvis behandling > 5 mL blod i stedet for å bruke større volum rør.
  3. Sentrifuge 300 x g for 35 min, ved hjelp av middels akselerasjon og noen brudd.
  4. Forsiktig fjerne øvre mononukleære celler rik band bruker plast for å hindre og overføring til en 50 mL sentrifuge rør. Hvis flere rør ble utarbeidet i trinn 3.2, kan band samordnes i en enkelt 50 mL tube. Bringe volum av opptil 50 mL med PBS.
  5. Sentrifuge 300 x g i 8 min og fjerne nedbryting. I dette trinnet kan du plassere autoklaveres 18 mm diameter runde coverslips (#1.5 tykkelse) i hver brønn av en 12-vel plate.
  6. Resuspend celle pellet i 300 µL av serum-free RPMI 1640 per ønsket antall brønner; f.eks hvis 10 mL blod ble behandlet for å forberede en full 12 godt plate, avbryte celle pellet 3,6 mL av media.
  7. Legge til 300 µL av cellen suspensjon hver dekkglassvæske inneholder i 12-vel platen. Inkuber 1t på 37 ° C + 5% CO2.
  8. Vask forsiktig dekkglassvæske 3 x med 1 mL av varmet PBS fjerne ikke-tilhenger celler.
  9. Legge 1 mL av RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL rekombinant menneskelige M-CSF + celle kultur antibiotika/antimycotic. Ruge på 37 ° C + 5% CO2 i 5 dager.
  10. Erstatte media med RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL rekombinant menneskelige M-CSF + 10 ng/mL rekombinant menneskelige IL-4 + celle kultur antibiotika/antimycotic. Ruge på 37 ° C + 5% CO2 for 2 dager å fullføre M2 polarisering.
  11. Polarisert makrofager bør brukes innen de neste 3 dagene.

4. forberedelse av apoptotisk Jurkat celler

  1. Kultur Jurkat celler i 5 mL av RPMI 1640 + 10% FBS på 37 ° C + 5% CO2. Jurkats er en suspensjon cellen og opprettholdes av passaging 1:5 i friske, forvarmes media hver 3-5 dager.
  2. For å forberede apoptotisk celler, kan du Jurkat kulturen å vokse til høy tetthet (4-5 dager etter passaging). Aliquot 1,5 mL i en 1,5 mL microcentrifuge rør og pellets celler med sentrifugering 500 x g i 5 min.
  3. Forkast nedbryting og å suspendere celle pellet i 1 mL av serum-free RPMI 1640 medium som inneholder 1 µM staurosporine.
  4. Inkuber 16 h på 37 ° C + 5% CO2 gjengi celler apoptotisk.
  5. Hvis ønsket anerkjenne induksjon av apoptose av farging med Annexin V:
    1. Aliquot 100 µL staurosporine-behandlet Jurkat celle kultur i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Pellets celler med sentrifugering 500 x g i 5 min, forkaste nedbryting og re avbryte celle pellet 100 µL av serum-free RPMI 1640 medium.
    2. Legge 1 µL av fluorescein isothiocyanate (FITC)-konjugert Annexin V og Inkuber i 10 min ved romtemperatur i mørket.
    3. Legg til 900 µL av PBS og overføre hele volumet til et enkelt godt av en 12-vel plate som inneholder en 18 mm rund glass dekkglassvæske (#1.5 tykkelse). Nedspinning i en sentrifuge utstyrt med en plate adapter 200 x g for 1 min å tvinge celler å følge dekkglassvæske. Cellene kan også plasseres i et kammer lysbilde for bildebehandling.
    4. Bildet med fluorescens mikroskop.

5. kvantifisering Efferocytic opptak og dynamikk bruker fast celle Efferocytosis analysen og innsiden ut flekker

  1. Forberede THP-1, J774.2 eller M2 menneskelige makrofager som beskrevet i delene 1-3, henholdsvis.
  2. Kvelden før starten av eksperimentet forberede apoptotisk Jurkat celler som beskrevet i punkt 4.
  3. Umiddelbart før eksperimentet, Tell apoptotisk celler ved hjelp av en hemocytometer. Overføre tilstrekkelig antall apoptotisk celler i en 1,5 mL microcentrifuge tube-vi legge vanligvis 5 x 105 celler/Vel, gir mål: efferocyte forholdet 10:1.
  4. Pellets Jurkat celler med sentrifugering på 500 x g i 5 min og resuspend i 500 μL PBS.
  5. Under sentrifugering, aliquot 10 µL av DMSO til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube. Oppløses i DMSO en minimal mengde N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin). 5-10 krystaller (~0.005 mg) er tilstrekkelig.
  6. Overføre 500 μL apoptotisk celle/PBS suspensjon til DMSO/NHS-biotin inneholder rør. Deretter fortynne en celle sporing fargestoff til produsentens anbefalte konsentrasjon i apoptotisk celle suspensjon. Lage bestemt å merke en celle sporing fargestoff som ikke overlapper spectrally med FITC-Streptavidin (f.eks rød eller langt rødt celle sporing farge).
  7. Inkuber suspensjon for 20 min i romtemperatur i mørket. Legge til en lik mengde RPMI 1640 + 10% FBS og Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur i mørket å slukke alle Ureagert dye.
  8. Pellets celler med sentrifugering 500 x g i 5 min forkaste nedbryting og å suspendere flekker apoptotisk cellene i 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS per brønn av makrofager.
  9. Tilsett 100 µL av farget apoptotisk celle suspensjon dropwise hver brønn av makrofager. Sentrifuge 200 x g i 1 min i en sentrifuge utstyrt med en plate adapter å tvinge kontakt mellom makrofager og apoptotisk celler.
  10. Inkuber plate for den ønskede perioden på 37 ° C + 5% CO2 i en vev kultur inkubator. Makrofager, efferocytosed materiale er vanligvis først synlig etter 20-30 minutter, og utføres etter 120-180 min.
  11. Samtidig ønsket fjerne punkt celler fra inkubator. Vask celler to ganger med 1 mL av romtemperatur PBS å stoppe efferocytosis og fjerne ikke-efferocytosed apoptotisk celler.
  12. Legger til FITC-konjugerte streptavidin en 1:1,000 fortynning hver brønn og ruge for 20 min i mørket. Dette vil merke den utsatte biotin på ikke-efferocytosed apoptotisk celle materiale.
    Merk: Hvis ønskelig, celle kjerner kan være farget i dette trinnet av tillegg av 1:20,000 fortynning av Hoechst 33342 eller 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI).
  13. Vask celler 3 ganger med 1 mL PBS, forsiktig risting eller rock prøvene i 5 minutter per skylling. Fastsette celler med 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS for 20 min ved romtemperatur. Skyll celler når med PBS fjerne overflødig PFA.
  14. Montere coverslips på et lysbilde for bildebehandling og overføring til fluorescens mikroskop. Fange z-stabler av et tilstrekkelig antall celler for nøyaktig kvantifisering-vanligvis 10-30 celler per betingelse. Non-internalisert apoptotisk celle materiale vil bli synlig i det resulterende bildet som cellen sporing fargestoff merket materiale omsluttet av FITC-streptavidin flekker, mens efferocytosed materiale danner diskret celle sporing fargestoff puncta uten noen streptavidin flekker.
  15. Kvantifisere efferocytosis i den resulterende bildene via en rekke tiltak:
    1. Beregn efferocytic indeksen ved å bestemme gjennomsnittlig antall diskrete efferosomes (celle sporing fargestoff+/streptavidin- puncta) per macrophage. Kvantifisere bare makrofager bundet til en apoptotisk celle eller som inneholder ≥1 vises efferosomes. Registrere makrofager bundet til en apoptotisk celle, men mangler separate efferosomes, som har en efferocytic indeks 0.
    2. Beregne efferocytic effektivitet ved å måle brøkdel av makrofager som inneholder ≥1 efferosome.
    3. Beregne hastighet på efferocytosis av tenkelig cellene fast og farget på flere tidspunkt. Bare bilde makrofager bundet til apoptotisk celler, eller som inneholder synlig efferosomes, med z-stabler fanget av hver celle. Når fotografert, bestemme frekvensen av efferocytosis:
      1. Bruke den streptavidin flekker som en guide, og freehand eller polygon markeringsverktøyet i FIJI/ImageJ26 (eller andre bildet analyse programvarepakke), sirkel alle cellen sporing fargestoff+/streptavidin- (f.eks internalisert) materiale i et enkelt fly av z-stakken. Måle integrerte intensiteten av cellen sporing fargestoff denne regionen. Individuelle mål for hver efferosome (f.eks diameter, posisjonering i forhold til kantlinje eller kjernen, etc.)15,27 kan lett kjøpes samtidig med disse målingene, sterkt øke data samlet inn under analyse.
      2. På den samme z-delen, bruker streptavidin flekker som en guide og markeringsverktøyet freehand eller polygon sirkel alle cellen sporing fargestoff+/streptavidin+ (f.eks ikke-internalisert) materiale i et enkelt fly av z-stakken . Bare inkludere flekker fra apoptotisk celler i kontakt med phagocyte. Måle integrerte intensiteten i denne regionen.
      3. Gjenta 4.2.3.1 til 4.2.3.2 i gjenværende z-deler av bildet. Summere integrert intensiteten av efferocytosed (Σeff) og ikke-efferocytosed (Σne) materiale. Brøkdelen av apoptotisk cellen som har vært efferocytosed kan beregnes for cellen som:
        Equation
      4. Kvantifisere brøk-efferocytosed for alle celler i alle tidspunkt. Merk at fluorescerende intensiteten av apoptotisk celler/efferosomes kan variere mellom bilder variasjoner i opptaket av cellen sporing fargestoffer av personlige apoptotisk celler, og endringer i image oppkjøpet parametere som eksponeringstid. Som sådan, bare sammenligne normaliserte verdier som brøkdel Efferocytosed, eller intensitet-uavhengige verdier som efferocytic indeks og efferocytic effektivitet, mellom bilder, mellom eksperimentelle forhold, og mellom gjenta eksperimenter.
    4. For å sikre den resulterende datasettet gjenspeiler variasjonen i efferocytosis mellom celler, kan du gjennomføre disse analysene på maksimalt antall celler i hvert eksperiment.
      Merk: Efferocytic effektivitet og efferocytic indeks kan raskt beregnes (noen få sekunder/cellen), og vi vanligvis ønsker å analysere minst 100 celler per eksperiment, Gjenta hvert eksperiment 3 ganger. Beregner brøkdelen av efferocytosed materialer og efferosome-spesifikke tiltak er mer arbeidskrevende, vanligvis tar 2-3 min/celle for en erfaren analytiker. For disse beregningene kvantifisere vi minst 15 celler per betingelse, per forsøk.
    5. Posten efferocytic indeks, brøkdel efferocytosed og personlige efferosome data på en per-celle-basis.
      Merk: Dette gir dataanalyse ved hjelp av én celle tilnærminger, slik at mellom cellen varianter å være kvantifisert. Befolkningsnivå analyser kan fortsatt bli gjennomført på disse datasett ved å beregne encellede informasjon innhentet personlige eksperimenter. Efferosome-spesifikke mål kan analyseres på befolkningsnivå, encellede nivå, og som ensembler (f.eks som bestander av efferosomes uavhengig av cellene som inneholder dem)15.

6. live celle Efferocytosis analysen ved hjelp av apoptotisk celler

  1. Forberede THP-1, J774.2 eller M2 makrofager som beskrevet i trinn 1-3, henholdsvis. Eventuelt cellene skal være transfected med effekter av transgener eller andre genetisk konstruerer minst 18 h før du utfører noen eksperimenter.
  2. Kvelden før starten av eksperimentet, Forbered apoptotisk Jurkat celler som beskrevet i avsnitt 4 og 5 med følgende endringer:
    1. Fortynne celler og indusere apoptose etter 4.1-4.3, og samle det nødvendige antallet apoptotisk celler som 5.3-5.4.
    2. Legge til en celle sporing fargestoff på produsentens anbefalte konsentrasjon apoptotisk celle suspensjon. Inkuber suspensjon for 20 min i romtemperatur i mørket. Legge til en lik mengde RPMI 1640 + 10% FBS og Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur i mørket å slukke alle Ureagert dye. Ikke Legg NHS-biotin for disse eksperimentene.
    3. Pellets celler med sentrifugering 500 x g i 5 min forkaste nedbryting og å suspendere flekker apoptotisk cellene i 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS per brønn av makrofager.
  3. Hvis nødvendig, etiketten makrofager ved fjerne kultur medier fra hver brønn og legge til 500 µL av PBS med produsentene anbefalt fortynning av en celle sporing fargestoff som ikke overlapper spectrally med cellen sporing fargestoff lagt til apoptotisk cellene eller fluorescerende effekter av transgener uttrykt av makrofagene. Inkuber for 20 min i romtemperatur i mørket, og deretter legge en lik mengde DMEM + 10% FBS og Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur i mørket å slukke alle Ureagert dye.
  4. Overføre macrophage inneholder dekkglassvæske til en Leiden kammer. Legge til 400 µL DMEM + 10% FBS, etterfulgt av 100 µL av merket apoptotisk celle suspensjon. Bland ved forsiktig pipettering media 2 – 3 ganger.
  5. Overføre Leiden kammeret til et oppvarmet og CO2-perfused kammer av en levende celle fluorescerende mikroskop.
    Merk: For mikroskop oppsett som mangler CO2 perfusjon evner, bruke vev kultur medium buffered med 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) i stedet for natriumbikarbonat å opprettholde fysiologisk pH mens den kultur er eksponert for luft.
  6. Fange en time-lapse serie som inneholder et hvitt lys (kontrast eller DIC) bilde og bilder av alle fluorescerende etiketter:
    1. Bruke en 100 X linsen eksperimenter der løse fine detaljer er nødvendig (f.eks membran dynamikken i phagocyte-apoptotisk celle interaksjoner). I mellomtiden, mer generelle tiltak (antall apoptotisk celle opptak, samhandling tid mellom makrofager og apoptotisk celler, etc.) er best fotografert med en 60 X eller 63 X mål.
    2. Hvis tilgjengelig, bruke punkt-besøk for å image flere felt-of-view under en oppkjøpet, dermed øker antallet efferocytic hendelsene i et enkelt eksperiment
    3. Fordi efferocytes sluke ofte små fragmenter av apoptotisk celler, i stedet for intakt celler, er det best å fange z-stabler. For å minimere Phototoksisitet, fange z-deler atskilt med fokal dybde mikroskop målet (vanligvis 0,5-1.0 µm), gjennom tykkelsen på cellen (vanligvis 8-10 µm for makrofager, f.eks 8-20 stykker/mobiltelefon). Dette sikrer at alle engulfment og menneskehandel hendelser vil være synlig i minst en z-fly. Alternativt bruke store (1 – 5 µm diameter) apoptotisk celle imiterer eller apoptotisk celler som gjennomgå minimal fragmentering under efferocytosis (f.eks varme sjokkert nøytrofile) i stedet uten z-stabling. Vi har beskrevet utarbeidelsen av både forfalsker og apoptotisk nøytrofile tidligere28.
    4. Minimere photobleaching, bruker lys fluorophores og fange profilen benytter oppkjøpet innstillinger som minimerer photobleaching- f.eks lav intensitet eksitasjon kombinert med høy kameraet gevinst og kort eksponering ganger29. Vi anbefaler bruk av mikroskop utstyrt med en høy følsomhet elektromagnetisk kostnad - sammen enhet (EM-CCD) kamera eller spinning-disk AC confocal og et høyhastighets piezoelectric mekanisk scenen, for denne formen for bildebehandling.
  7. Antall mulige analyse metoder som kan brukes på disse time-lapse videoer er omfattende og vår evne til å vurdere her. Som eksempler, bruke manuell eller automatisert sporing til å spore fusjon og fisjon bevegelse av efferosomes i cellene15, kvantifisere efferosome fusion dynamics med endolysosomes av colocalization analyse i makrofager uttrykke rom-spesifikke fluorescerende effekter av transgener13, skjermen opptak prosesser som utprøvende og cup formasjon30, bestemmer rekruttering dynamikken i signalisering og smugling proteiner til efferosome13, og/eller kvantifisere degradative aktiviteten til efferosomes ved hjelp av apoptotisk celler merket med pH-sensitive, oksiderende-sensitive eller protease-aktivert fluorophores31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Natten kultur av Jurkat celler med 1 µM staurosporine gir apoptose av > 95% av celler som kan bekreftes med Annexin V flekker (figur 1). Andre celletyper, kan brukes av disse eksperimentene, men konsentrasjonen av staurosporine og staurosporine behandling varighet må være optimalisert for hver celle linje. For pålitelig gjenkjenning og kvantifisering av efferocytosis, > 80% av cellene skal apoptotisk før du legger dem til i efferocytes. Andre indusere av apoptose (f.eks varme-sjokk, etoposide og UV-lys) kan også brukes, men i vår erfaring, disse produserer en mer heterogen induksjon av apoptose og resultere i blandet celle populasjoner som inneholder apoptotisk, videregående necrotic og ikke-apoptotisk målcellene.

For fast-celle bildebehandling med innsiden ut flekker, tett apposed efferocyte-apoptotisk celle interaksjoner observeres på alle tidspunkt, med klart beskrevne ikke-efferocytosed (streptavidin+/cell sporing fargestoff+) og efferocytosed (streptavidin-/cell sporing+) materialer vises (figur 2). Det er viktig å merke seg at synapse som danner mellom efferocyte og apoptotisk cellen er ofte stramt nok til å utelukke streptavidin, og dermed en celle sporing fargestoff farget objekt med streptavidin når som helst på omkretsen bør vurderes en bundet cellen og ikke en efferosome. I de fleste eksperimenter vil brøkdel av apoptotisk celler som er efferocytosed øke i en tidsavhengige måte, enten gjenstår ingen ikke-internalisert apoptotisk celle materialer, eller til phagocyte når sin maksimale efferocytic kapasitet (figur 3). analyse er vanligvis utført og registrert for enkeltceller (figur 3A), men data kan være gjennomsnitt over celler i individuelle eksperimenter og gjennomsnittlige verdiene fra flere eksperimentelle gjentar analysert med konvensjonelt statistiske metoder (figur 3B). Endringer i denne standardisert protokollen kan gjøres å tillate bruk av primære celletyper, alternativ efferocytic mål, og ytterligere flekker skal inkluderes. Figur 4 viser for eksempel en primær M2-polarisert menneskelige macrophage som har efferocytosed apoptotisk celle imiterer består av 3 µm diameter silica perler belagt i en blanding av fosfatidylserin og phosphatidylcholine28, etterfulgt av etterfølgende fiksering, permeabilization og immunostai-for gjenvinning endosome merket Rab17.

Under levende celle imaging efferocytic profesjonell phagocytes vil bli observert å utvide og trekke liten prosesser i en prosess kalt "undersøkelser"30 (figur 5, t = 0); Når disse prosessene møter et mål de fast overholder målet og trekke det til phagocyte. Denne prøvende aktiviteten kan ikke sees med ikke-profesjonell phagocytes som epitelceller. Efferocyte vil danne en tett "efferocytic synapse"32 mellom seg selv og den apoptotisk cellen med denne synapse ofte innhyllende en stor del av den apoptotisk cellen (figur 5, t = 10). Efferocyte vil deretter trekke stykker av apoptotisk cellen fra denne synapse i sin stoffer (figur 5, 10-30 min). Kort tid etter deres dannelse smugles disse begynnende efferosomes fra synapse og mot peri-kjernefysiske området, et resultat av Rab7/RILP/dynein-dynactin mediert transport33. Over tid vil efferosomes krympe og resulterende dårligere materialer distribueres gjennom cellen, der de er sannsynlig absorbert eller resirkulert13,15. Muligheten til å oppdage disse prosessene er svært avhengig av oppkjøpet Rammehastigheten og varigheten av forsøket. Rask prosesser som undersøkelser ikke observeres på lavere bildefrekvens, mens langsom hendelser (efferosome handel og absorpsjon) krever lengre tenkelig perioder, i begge tilfeller oppkjøpene stort bilde krever ofte erobringen av lavere intensitet bilder begrense photobleaching og Phototoksisitet (figur 5). Som med fast-celle analysen, kan live-celle-versjon av denne analysen endres for å passe behovene til etterforskeren. Figur 6 viser et enkelt bilde av en levende celle oppkjøp av J774.2 makrofager uttrykke effekter av transgener som fluorescently demark plasma membranen (PM-GFP) og som binder selektivt signalnettverk lipid PI (3) P (FYVE-RFP). Generasjon av PI (3) P på efferosome membranen kan oppdages som co lokalisering av FYVE-RFP med PM-GFP+ efferosome membran. Av kvantifisere intensiteten av FYVE-RFP på efferosome, dynamikken i PI (3) P signalisering på efferosome kan kvantifiseres (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Annexin V farging av apoptotisk og apoptotisk Jurkat celler. Annexin V etiketter i fosfatidylserin "spise-meg" signal av apoptotisk celler. (Øverst) Ubehandlet (UT) Jurkat celler viser en sunn (jevn og avrundet) morfologi (DIC) og flekker ikke med Annexin V. (nederst) Jurkat celler kultivert natten med 1 µM staurosporine (m) ta en apoptotisk morfologi (uregelmessig og blebbed) og flekker med Annexin V. skala bar = 10 µm, bilde intensitet vises som en farger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: tidlige og sene Engulfment av apoptotisk Jurkat celler av J774.2 makrofager. Bildene er av makrofager på et tidlig (60 minutter) og sent (120 minutter) stadium av efferocytosis. Hvitt lys (DIC) bildet illustrerer stramt grensesnittet mellom macrophage (mφ) og apoptotisk-cellen (AC). Cellen sporing fargestoff (CTD, rød) avslører av alle apoptotisk celle-avledet materiale. FITC-Streptavidin flekker (Str, grønn) identifiserer delen av apoptotisk cellen som ennå ikke vært oppslukt av macrophage. Macrophage kjerner var pre beiset med DAPI (blå). Efferosomes (rød) versus ikke-internalisert delen av apoptotisk cellen (grønn/gul) identifiseres lett i en overlapping av Streptavidin og celle sporing farge bilder. Merk at streptavidin flekker på macrophage-apoptotisk celle grensesnittet på det tidlige timepoint, opprettet av utelukkelse av streptavidin fra tett dannet efferocytic synapse (*). Macrophage kjernen identifiseres av Hoechst flekker (blå). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tid-løpet av brøkdelen av apoptotisk celle Efferocytosed av J774.2 makrofager. Efferocytosis analyser ble utført for angitt klokkeslett og brøkdel av svelget lett apoptotisk celle materiale på hvert punkt med cellen sporing fargestoff/Streptavadin flekker. (A) brøkdel av efferocytosed materialer i individuelle makrofager, data presenteres fra individuelle celler, vannrette linjen indikerer middelverdien. 12 – 17 celler per betingelse, data fra 1 av 5 uavhengige eksperimenter. (B) brøkdel av efferocytosed materialer, gjennomsnitt over 5 uavhengige eksperimenter, minst 10 celler/tilstand/gjenta. p < 0,05 sammenlignet med 30 min, Kruskal-Wallis test med Dunn korreksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: analyse av Rab17 rekruttering til Efferosomes i primære menneskelige makrofager. En M2-polarisert macrophage omsluttet apoptotisk celle forfalsker (piler) og var immunostained for Rab17 (grønn) 60 minutter etter engulfment. Skala bar = 5 µm. cellekjernen er farget med Hoeschst, DIC bildet viser cellen morfologi og brukes til å identifisere apoptotisk celle imiterer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: levende celle efferocytosis analysen. En celle sporing fargestoff labeledJ774.2 macrophage (mφ, grønn) ble registrert som det engulfed en apoptotisk Jurkat celle merket med en annen farge celle sporing fargestoff (AC, rød). Apoptotisk cellen er delt i flere fragmenter under internalisering prosessen resulterer i stykkevis opptak og dannelse av flere efferosomes (piler). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: bruke fluorescerende effekter av transgener å undersøke Efferocytic signalering. En J774.2 macrophage ble transfekterte med en GFP-merket plasma membranen markør (PM, grønn) og FYVE-RFP konstruksjonen som binder signalnettverk lipid PI (3) P (rød). Efferocytosis danner en begynnende plasma membran-avledet efferosome som inneholder PI (3) P, som oppdages av FYVE-RFP rekruttering (pil). Dynamikken i PI (3) P signalering ble kvantifisert som brett intensiteten i forhold til FYVE-RFP signalet tilstede på efferosome nedleggelse (t = 0, diagram). Dette eksperimentet brukt en apoptotisk celle-mimicking perle (pil, DIC) i stedet apoptotisk celler. Skala bar = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som er nevnt i denne protokollen Aktiver bildebehandling og kvantifisering av dynamisk efferocytic prosessen, bruke både fast-celle og live-celle tilnærminger. Disse metodene har flere fordeler sammenlignet med vanlig ansatt flyt cytometri-baserte metoder23,24. Bruk av innsiden ut flekker med fast prøver gir en mer robust og nøyaktig kvantifisering av hastighet og omfanget av efferocytosis-faktisk mange flyt cytometri-baserte metoder bare etiketten apoptotisk celler og makrofager med ulike fluorophores, og poengsummen efferocytosis som brøkdel av makrofager co farging med den apoptotisk celle markøren, dermed mangler kapasitet til å skille mellom bundet versus internalisert apoptotisk celle materiale. Alternativ flyt cytometri tilnærmingsmåtene er de bruker pHrodo merket apoptotisk celler24. pHrodo er en pH-sensitive fluorophore som øker i lysstyrke på surt pH. Mens dette fluorophore gir bedre oppløsning mellom ikke-internalisert versus internalisert materialer, som fluorescens øker spesielt følgende internalization apoptotisk cellen og forsuring av efferosome, kan resultatene være forvirret av sykdom prosesser som svekke efferosome forsuring34,35, og denne metoden vil savne efferosomes i tidlig (før forsuring) stadier av efferocytosis36, i forsuring regioner av cellen27, eller i celler som svakt syre deres lysosomer37. En annen fordel med metoden beskrevet i denne protokollen er bruk av live-celle for å måle dynamikken i efferocytosis, som prosesser som undersøkelser, dannelsen av efferocytic synapse, og intracellulær smugling av efferosomes ikke være oppdaget bruker flyt cytometri-baserte tilnærminger.

Mens denne metoden har mange fordeler, eksperimenter krever kvantifisering av mange hundre celler- f.eks eksperimenter oppdage sjeldne hendelser, eller kvantifisere svært variabel prosesser, kan være vanskelig, med analyse av disse store datasett å ta en overdreven mengde tid. Høy gjennomstrømming imaging tilnærminger som imaging flyt cytometri38 tillate høyere ytelse enn konvensjonelle mikroskopi, selv i vår erfaring gjeldende automatiserte image analyse programmer ikke er alltid i stand til nøyaktig segmentering ikke internalisert-versus internalisert materialer. Spesielt tett efferocytic synapse som danner mellom den apoptotisk cellen og efferocyte kan utelate streptavidin flekker, og som sådan en bundet apoptotisk celle vises ofte som en fast masse i cellen sporing fargestoff kanal, som er delvis omsluttet av streptavidin flekker (figur 2). Dermed mens efferosomes identifiseres lett algoritmer, er delen bundet til apoptotisk-cellen ofte feilidentifisert som en efferosome på grunn av vanskelighetene av delvis streptavidin flekker. Mens vi har ennå å finne et program som kan nøyaktig identifisere og kvantifisere stykkevis opptaket av apoptotisk celler uten menneskelig assistanse, har vi funnet at trening halvautomatisk systemer39 sterkt akselerere analyse, redusere brøk efferocytosed målinger for 2-3 min til < 60 s per celle. Alternativt, ikke-fordøyelige apoptotisk celle etterligner eller celletyper som minimalt fragmenter på apoptose, kan brukes i stedet. Dette forenkler gjenkjenning for å enkelt, større strukturer, som kan være mer mottakelig for automatiserte metoder og kan eliminere behovet for z-stabling. Selv med disse framskrittene, oppkjøp og analyse hastigheten på denne metoden forblir begrensende, og som sådan flowcytometri fortsatt det mest levedyktige metoden når analyser av store cellen tallene er nødvendig23.

Selv om vi har beskrevet denne metoden bruker celle-line og primære menneskelige makrofager som efferocytes og apoptotisk Jurkat-celler (en T celle linje) som mål, kan denne metoden brukes på alle efferocytic celle type eller apoptotisk celle target. Faktisk har lignende tilnærminger brukt å undersøke efferocytosis i hepatocytter og epitelceller9,40,41, og efferocytosis av klinisk relevante mål som tumor celler42. Det kan være nødvendig å endre denne protokollen bruker ikke-immune efferocytes, eller når modellering bestemte efferocytic hendelser. For eksempel Jurkat celler er ikke-tilhenger, og derfor er usannsynlig å fullt recapitulate mekaniske krefter og romlig begrensninger efferocytes oppstår når samarbeidsstil tilhenger apoptotisk celler og apoptotisk celler i solid vev. Mange celletyper vil opprettholde heft under apoptose og derfor kan brukes som tilhenger mål; som ett eksempel gjennomgå HeLa celler reproduserbar staurosporine-indusert apoptose, fosfatidylserin desperat og blebbing over en 4-6 h periode mens vedheft av celle kroppen43. Celler suspendert i kollagen matrise eller Stamcelle-avledet organoids44 kan være potensielle modeller for å studere efferocytosis i solid vev, men vi er klar over noen studier som har brukt disse metodene. For noen modeller immunceller som Jurkat celler og nøytrofile bør ikke brukes som apoptotisk mål, som disse cellene kan frigi cytokin-baserte "finne-meg" signaler som CX3CL1 som kan være en forvirrende faktor i modeller der inflammatoriske eller trekkfugler prosesser er undersøkt45. Dermed mens allsidighet av denne analysen tillater den å utforske efferocytosis over en rekke celletyper og modellere systemer, må omsorg tas å velge riktig efferocytes og målcellene oppdrettsforholdene beste modellen den fysiologiske Behandle under etterforskning.

Analyse-metodene som er beskrevet i denne protokollen er ment som et utgangspunkt, med imaging-baserte natur disse eksperimentene slik at en rekke analyser. For eksempel efferosome plassering og diameter målinger kan samlet når brøkdel efferocytosed mål, eller målt i live-celle tid-kurs, for å undersøke prosesser som intracellulær smugling av efferosomes og frekvensen av apoptotisk celle fornedrelse13,15. Immunostaining (Figur 4) kan brukes til å undersøke rekruttering av proteiner til efferosomes, mens live-celle imaging kombinert med morfologiske analyser kan brukes å kvantifisere prosesser slik bindende effekt og priser engulfment30 , 46. vi ofte utføre disse analyser i makrofager uttrykke fluorescerende effekter av transgener som rapporterer Signalering molekyl aktivisering eller aktiviteten til mobilnettet hendelser under efferocytosis (figur 6). Disse journalister muliggjøre overvåking signalnettverk prosesser under efferocytosis; for eksempel har vi brukt fluorescently-merket Rab GTPases for å utforske rollen som Rab5, Rab7 og Rab17 i formidling av efferosome behandling og påfølgende smugling av apoptotisk celle-avledet antigener13,15. Tilsvarende kan inkorporering av journalister av celledød, efferosome pH, reaktive oksygen arter produksjon og andre cellulære prosesser i live-celle eksperimenter brukes til å undersøke prosessene formidling nedbrytning av efferosomes31 ,47. En felles utfordring i disse eksperimentene er identifisere effekter av transgener eller journalister med kompatible fluorophores; ofte, vil vi fjerne cellen sporing fargestoff og/eller streptavidin til gratis kanaler for imaging andre fluorophores. For noen eksperimenter er det gunstig å erstatte apoptotisk cellen med en ikke-fragmentering etterligne. Dette gir kvantifisering signalnettverk dynamikk og cellulære prosesser uten kompleksiteten i sporing av flere efferosomes avledet fra en enkelt apoptotisk celle. Se Evans et al. instruksjoner om forbereder apoptotisk celle etterligner28.

Vanligste problemer når utforme disse eksperimentene er å finne en kombinasjon av fluorophores som tillater for ønsket prosesser til å avbildes, samtidig som photobleaching og Phototoksisitet29. Fluorophore utvalg bestemmes i hovedsak av lasere/eksitasjon filtrene, dichroics/kuber og utslipp filtre av mikroskopet, og derfor valg av fluorophores er ofte gjelder for individuelle mikroskop. Vanligvis lengre bølgelengde fluorophores (oransje til langt rødt, f.eks utslipp maxima > 580 nm) er mindre utsatt for photobleaching og disse bølgelengder er oppfører celler. Grønn fluorophores (utslipp maxima ~ 525 nm) kan brukes, men omsorg må tas for å begrense Phototoksisitet til cellene. Fluorophores som opphisse på bølgelengder mindre enn 480 nm (fiolett og blå) bør unngås på grunn av deres høye Phototoksisitet og tilbøyelighet for disse eksitasjon bølgelengder å bleke andre fluorophores29. Der det er mulig skal høy lysstyrke og stabile fluorophores velges. Tilsvarende bilde oppkjøpet parameterne skal justeres for å minimere photobleaching og Phototoksisitet- f.eks han lav eksitasjon intensitet foretrekkes over høyere eksitasjon intensiteter48. Tillegg av antioksidanter som rutin og fjerning av noen media-komponenter kan forbedre både photostability og redusere Phototoksisitet49. Selv med nøye utvalg av fluorophores bildebehandling krever behovet for å begrense photobleaching ofte erobringen av bilder med lav signal-til-støy-forhold (se figur 5 for et eksempel). Hvis kvantifisere fluorescens intensitet, må stor forsiktighet tas til begrense bildebehandling gjenstander; ideelt sett bør raw-bilder uten noen form for behandling analyseres. Hvis deconvolving bilder før kvantifisering, må en deconvolution algoritme som bevarer fluorescent intensiteter brukte50,51.

Live celle oppkjøp kan være spesielt utfordrende, med vellykket eksperimenter krever en forsiktig balanse mellom eksitasjon intensitet, eksponeringstid, bildefrekvens og eksperimentets varighet. Eksitasjon intensitet og eksponering tid skal justeres for å minimere Phototoksisitet som beskrevet ovenfor, med forbeholdet at lengre lukkertider kan resultere i bevegelse gjenstander på grunn av cellen bevegelse eller begrense bildefrekvensen for oppkjøpet. Bildefrekvens kan variere avhengig av eksperimentelle kravene. Lavere bildefrekvens (5-30 min mellom rammer) tillate imaging over lengre perioder (12 h eller mer), men gir minimal data på fenomener som membran dynamikk og post-efferocytosis smugling av efferosomes. Høy ramme-priser (idet rask idet 1 rammen per sekund) gir utmerket midlertidig løsning efferocytic hendelser og efferosome handel, men selv med nøye utvalg av fluorophores, eksitasjon intensitet og eksponeringstider-photobleaching eller Phototoksisitet vanligvis begrenser disse eksperimentene mindre enn en time i varighet. I vår erfaring, anskaffe bilder hver 1-2 min, eksperimentelle perioder med 2-6 h, er en akseptabel kompromiss som gir målbare bilder av et tilstrekkelig antall efferocytic hendelser, rimelig midlertidig løsning.

Endret og mislykkede efferocytosis er kjent for å være involvert i patologi kreft, åreforkalkning og flere autoimmune sykdommer, med efferocytosis målretting terapier viser stor klinisk lover7,52, 53,54,55. Videre utvikling i disse feltene krever identifikasjon og karakterisering av cellulære prosesser, reseptorer og signalnettverk trasé som regulerer efferocytosis. Analysen presentert i denne protokollen representerer et kraftig verktøy for disse studiene og kan endres for å kvantifisere mange av mobilnettet og signalnettverk prosessene regulere efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) opererer Grant MOPP-123419, naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada Discovery Grant 418194, og en Ontario departementet for forskning og innovasjon tidlig forskning prisen til BH. DGW bidro noen av bildene presentert, optimalisering av protokollene og skrivingen av manuskriptet; Han ble finansiert av en disposisjon stipend fra Universitetet i Liverpool. CY er finansiert av en Vanier Graduate Scholarship og CIHR MD/PhD Studentship. Virkemiddelapparat ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 138 Efferocytosis fagocytose apoptose mikroskopi phagocyte macrophage
Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G.,… More

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter