Summary
Denne protokol beskriver en kalibrering-fri tilgang til kvantificering af protein homo-oligomerisering in vitro- baseret på fluorescens udsving spektroskopi ved hjælp af kommercielle lys scanning mikroskopi. Den korrekte anskaffelse indstillinger og analysemetoder, der er vist.
Abstract
Antallet og lysstyrke er en kalibrering-fri fluorescens udsving spektroskopi (FFS) teknik til påvisning af protein homo-oligomerisering. Det kan være ansat, ved hjælp af en konventionel Konfokal mikroskop udstyret med digitale detektorer. En protokol til brug af teknik i vitro er vist ved hjælp af en use case, hvor antallet og lysstyrke kan ses at nøjagtigt kvantificere mVenus-mærket FKBP12F36V oligomere tilstand før og efter tilsætning af det dimerizing stof AP20187. Betydningen af at anvende korrekte mikroskop erhvervelse parametre og de korrekte data forbehandling og analysemetoder, der er diskuteret. Navnlig understreges betydningen af valget af photobleaching korrektion. Denne billig metode kan anvendes til at undersøge protein-protein interaktioner i mange biologiske sammenhænge.
Introduction
Protein-protein interaktioner, jeg n in Vitro
Traditionelt er krystallografi og Kernemagnetisk resonans eksperimenter kombineret med kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) de teknologier, der er valgt til præcist beskriver den tre-dimensionelle arkitektur af proteiner og at udlede deres funktion af granske deres strukturelle detaljer i høj opløsning. Proteiner, men er ikke statiske strukturer og kan gennemgå en række konformationelle ændringer og vibrationer i tid og rum. Dette er grunden til strukturelle oplysninger fra krystallografiske eller CryoEM data skal suppleres med andre teknikker (fx molecular dynamics simulationer og enkelt molekyle teknikker): funktionen af et protein, der er relateret til dets konformationelle ændringer og interaktioner, og disse oplysninger er ikke til stede i en statisk struktur. For at sende forespørgsler om intra molecular dynamics, er teknikker baseret på enkelt molekyle Forster resonans energi Transfer (smFRET) meget effektiv1. Disse metoder er i stand til at vurdere forskellige delpopulationer af molekyler i komplekse medier. Dette er meget vigtigt, da disse ændringer er hurtig og opstå under erhvervelse af data (dvs. nanosekund til andet område).
To vigtigste tilgange er almindeligvis ansat til at detektere og kvantificere disse ændringer: proteiner i løsning og overflade-immobilisering. Til påvisning af indbyrdes molekylære interaktioner og navnlig processen af dimerization induceret af ligander, er smFRET ikke altid det bedste værktøj. Faktisk, FRET afhænger ikke kun af afstanden (≈10 nm), men også på orientering af de to dipoler (donor og acceptor, χ2), og overlapningen af donor emission med de acceptor absorptionsspektre2, men måske denne sidste betingelse er mindre forudsat at experimentalist kan valgte vigtigt, den rigtige FRET par. En særlig ulempe ved smFRET for sondering homo-dimerization kommer fra mærkning af protein af interesse: for hetero smFRET, dimerization kan kun blive registreret op til 50% (dvs., hetero-FRET vil kun kunne opdage donor-acceptor og acceptor-donor homo-dimerer men ikke donor-donor eller acceptor-acceptor, som de andre 50% af dimerer). Brugen af fluorescens-korrelations-spektroskopi (FCS) og derivater (FCCS, etc.3) at undersøge protein diffusion konstanter og bindende konstanter i vitro er et andet alternativ. Disse tilgange er ikke i stand til fuldt kvantificere homo-dimerization enten, som i FCS en foranstaltninger koncentration og diffusion, og radius og diffusion koefficient af et spreder partikel er meget dårligt afhængige molekylvægt; for eksempel vil en 10-fold stigning i molekylvægt kun medføre en ændring af 2,15 fold i diffusion koefficient4. To-farvet FCS eller FCCS, vil kun 50% af homo-dimerer ses af samme grund som ovenfor. Den mest praktiske og kvantitative tilgange til at registrere homo-dimerization i in vitro og i vivo er homo-FRET5 og antallet og lysstyrke (N & B)6. Betragtning af at homo-FRET kræver særlige instrumentering inddrivelse af anisotropy værdi (dvs. optiske elementer/analysatorer til at gendanne den parallelle med og vinkelrette polarisering), N & B præsenteres her som en gunstig teknik til at opdage protein homo-dimerization og sammenlægning. Det kan være ansat både in vitro- og i vivo med en kommerciel set-up.
Antallet og lysstyrke
N & B har været for nylig gennemgik7. Denne revision fokuseret på anvendelsen af teknikken i levende celler. Det er værd at gengive den matematiske formalisme her som disse ligninger vil blive anvendt til data indsamlet in vitro. For det første er det nødvendigt at fastlægge nogle begreber og matematiske mængder:
- En enhed er et sæt af molekyler, der bindes sammen.
- Lysstyrke ε af en enhed, er antallet af fotoner det udsender pr. tidsenhed (per frame).
- n er antallet af enheder, der er til stede.
- For en given pixel i løbet af et billede-serien er < i > dets gennemsnitlige intensitet og σ2 er variansen i dens intensitet.
Derefter, med photon-optælling detektorer og under forudsætning af mobile enheder og ingen baggrund,
hvor N er tilsyneladende nummer og B er tilsyneladende lysstyrke. Dette resulterer i
Anne Juul et al. 8 viste, at med analogt udstyr, man behøver tre korrektion vilkår: S faktor, baggrund forskydningog udlæsning støj σ02. Så igen under forudsætning af mobile enheder,
at give
Bemærk, at ovenstående ligning for forskellige, givet i Anne Juul et al. 8 og en efterfølgende revision. 7 i Anne Juul et al. S i nævneren blev udeladt på grund af et slåfejl og denne fejl blev gengivet i forbindelse med revisionen. Ligningen ovenfor er den rigtige. Instruktioner for måling af S, forskydning og σ02 - sammen med en forklaring af deres betydning - er givet ved Anne Juul et al. 8
Lysstyrke ε er proportional med de sprede enheder oligomere tilstand: ε vil blive dobbelt så stor for dimerer som for monomerer, tre gange så stor for trimere som for monomerer, to gange så stor for hexamers, som det er for trimere og så videre. På denne måde, måling af lysstyrke ε, kan en kvantificering af enhver form for multimerization.
Hvis der er en blanding af oligomere stater nuværende, er antallet og lysstyrke ikke i stand til at inddrive de oligomere enkeltstater stede. Dette er en begrænsning af teknikken.
Detrend algoritme og nandb software
Betydningen af at korrigere for photobleaching har været understreget tidligere9. Photobleaching uundgåeligt opstår under lysmikroskopi eksperimenter i time-lapse tilstand; både i levende celler og in vitro. Mange tilgange er blevet beskrevet i litteraturen til at korrigere for blegning7. Den eksponentielle filtrering teknik med automatisk valg af detrending parameter T er den nuværende bedste. Det er integreret i gratis, open source software nandb9. Faktisk, software, der kræver, at brugeren kan manuelt vælge deres detrending parameter kan føre til forkerte resultater, fordi denne parameter valg vil sandsynligvis blive vilkårligt og forkert. Den automatiske algoritme undersøger data og bestemmer parameteren passende for det, uden behov for brugeren intervention9. Selv med den bedste valg af udjævning parameter, detrending har sine begrænsninger og fungerer godt kun med photobleaching procent lavere end 25%, som vist med simuleringer9. Interessant, når du bruger den automatiske detrending rutine, dets nøjagtighed er sådan, at man kan arbejde med lav lysstyrke værdier (selv B < 1,01), og dermed lav intensitet, og stadig være tilstrækkeligt præcise til at kvantificere homo-dimerization.
Photobleaching medfører også et andet problem: tilstedeværelsen af photobleached fluorophores i en kompleks multimer. Dette gør fx en trimer vises som en dimer, når en af de tre enheder i trimer er ikke-fluorescerende. Hur og Mueller10 viste hvordan man kan korrigere for dette, og denne korrektion blev også understreget i en efterfølgende anmeldelse7. Nandb software indeholder denne rettelse9.
Af FKBP12 F36V system
FKBP12F36V er et protein, som naturligvis ikke oligomerize men er kendt for at dimerize ved tilsætning af AP20187 stof (i daglig tale kendt som BB dimerizing ligand)11,12. Dette gør det en ideel prøvesag for antallet og lysstyrke: med mærket FKBP12F36V, en fordobling af oligomere stat bør overholdes ved tilsætning af BB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. FKBP12 F36V - mVenus rensning
- Omdanne (DE3) pLysS celler med pET22b vektor indeholdende monomerized menneskelige FKBP12F36V12 og N-terminale His6 og mVenus tags (vektor fås på anmodning). Plade celler på LB-agar suppleret med 50 µg/mL Ampicillin og 34 µg/mL Chloramphenicol.
- Overføre transformerede kolonier i 100 mL LB starter kultur og vokse til 16-20 timer ved 37 ° C under omrystning.
- Fortynd tætte starter kultur (OD600 > 1) 1: 100 i LB medium (2 x 500 mL partier) og vokse i 2-3 timer til OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
- Cool kulturer på is. Fremkalde med 250 µM IPTG og vokse til 16-20 timer ved 21 ° C, 200 rpm.
- Høste celler ved centrifugering ved 2.000 x g i 20 minutter.
- Resuspend pellet i 40 mL af IMAC buffer (20 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazol, 1 mM β-mercaptoethanol) suppleret med EDTA-fri proteasehæmmere (1 tablet pr. celle pellet).
- Der sonikeres celler (500 watt, 20 kHz, 40% amplitude, 9 s på 11 s off i 15 min.) på is og høst opløselige materiale ved centrifugering ved 20.000 x g.
- Overførsel opløselige lysate til en konisk kolbe og tilsættes 2 mL af harpiks (Se Tabel af materialer). Inkuber i 1 time med 105 rpm rotation
Bemærk: Nikkel sepharose kan også bruges til denne IMAC trin. - Høste harpiks og vask med 250 mL af IMAC buffer A efterfulgt af 500 mL af IMAC buffer B (20 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazol, 1 mM β-mercaptoethanol).
Bemærk: Stige til 50 mM imidazol hvis bruger nikkel sepharose harpiks. - Elueres His6-mærkede protein ved hjælp af IMAC buffer C (20 mM natriumfosfat pH 7,5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 1 mM β-mercaptoethanol).
- Injicere op på en størrelse udstødelse kolonne (Se Tabel af materialer) ekvilibreres i 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V har sin peak eluering ved 87.71 mL på kolonnen vi brugte.
- Vurdere renhed via SDS-PAGE og pool og koncentrere sig efter behov.
2. forberedelse af flerhuls plade Array
- Optø den renset FKBP12F36V (eller mærket protein af interesse) fra-80 ° C.
- Der fremstilles en opløsning af 100 nM renset FKBP12F36V (medium, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Der sonikeres og centrifugeres (hurtig spin af 13.000 rpm) for at forhindre dannelsen af aggregater.
- Der afpipetteres 100-200 µL i en 8 godt observation kammer med en glas-bund.
- Tilføje BB dimerizer til endelige koncentrationer af 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 og 500 nM12,13.
- Som reference, forberede en opløsning af 100 nM af mVenus alene at vurdere potentielle sammenlægning og nedbør effekter og genoprette en lysstyrkeværdi for monomeren med de samme indstillinger for erhvervelse.
3. kalibrering-gratis Konfokal erhvervelse
- Start Konfokal systemet (figur 1). Lys scanning mikroskop Konfokal system udstyret med digitale detektorer eller godt karakteriseret analog detektorer8, og i stand til at holde en konstant hviletiden for hver pixel erhvervet ville arbejde.
- Indstille excitation strålegang:
- Tænd for 514 nm laser og sæt det på 20-100 nW magten ved afgangen fra målet (for FKBP12F36V-mVenus).
- Vælg 63X1.4NA mål eller en krave korrektion vand fordybelse mål designet til FCS.
- Tænde en HyD, APD eller kalibreret ydelse detektor. Detektorer i stand til af foton-optælling er at foretrække, som i dette tilfælde, beregning af S, forskydning og σ02 er unødvendige.
- Vælg vinduet emission fra 520-560 nm
- Indstille pinhole på 1 luftige enhed til den tilsvarende emission ~ 545 nm.
- Indstil erhvervelse på 16 x 16 pixels
- Sæt den pixel dwell tid tbo sådan, at det opfylder tramme >> TD >> tbo, hvor D er opholdstid af spreder protein og t ramme er framerate. Dette svarede til at hviletiden til ~ 13 µs.
Bemærk: Nogle kommercielle producenter havde scannere, der ikke holde hviletid pr. pixel konstant. Denne uforanderlighed er afgørende for metoden til at arbejde. - Sæt pixelstørrelse på ~ 120 nm.
- Vælg xyt erhvervelse mode og vælg antallet af billeder der skal erhverves per erhvervelse og godt (for eksempel 5.000).
- Hvis systemet er udstyret med høj overførselshastighed tilstand, indføre koordinaterne for hvert hul, og antallet af erhvervelser pr. brønd for at automatisere processen.
Bemærk: Vær forsigtig til at sikre tilstedeværelsen af en vand dispenser til hvis bruger objektivt fordybelse. - Hvis systemet er udstyret med en perfusion system, indlæse BB løsning og programmere perfusion at starte højre-efter 5000th ramme til at evaluere kinetik af dimerization mens erhverve f.eks. 10.000 billeder.
- Tilføj en dråbe olie i oliebestandighedsobjektet / vand hvis udnytter en krave korrektion vand fordybelse mål designet til FCS.
- Montere 8 godt observation kammer i scenen.
- Vælg den korrekte godt og fokusere på løsningen.
Bemærk: Vigtigt: undgå at fokusere tæt på bunden glasset til at undgå refleksion og spredning. Når der fokuseres dybere ind i løsningen, afbryde den automatiske fokus indstilling. - Starte erhvervelse og gemme den resulterende stak af billeder i TIFF-format.
4. detrend og lysstyrke analyse ved hjælp af R pakke nandb
- Som forbehandling kvalitetskontrol, skal du bruge ImageJ14 til at tage et kig på billederne og inddrive profilen intensitet, som vist i figur 2en. Dette er nyttigt at bestemme eller ej for meget photobleaching har fundet sted. Hvis der er for meget blegning, er dataene ikke egnet til videre analyse.
Bemærk: ImageJ kan også være nyttigt at konvertere billeder til TIFF fra kommercielle formater. Nandb software beskrevet nedenfor kan kun arbejde med TIFF-filer. - Hent og Installer Rasmussen og RStudio15,16. Det er bedst at hente og installere R først, derefter RStudio.
Bemærk: Det følgende er en beskrivelse af hvordan man bruger pakken nandb Rasmussen. Kendskab til sproget Rasmussen er ikke forpligtet til at bruge nandb, men det vil gøre livet lettere. - Installere pakken nandb.
- Åbn RStudio og i konsollen, type install.packages("nandb") og vente til installationen.
- Få at vide nandb
- Anmeld den manuelle17.
- Anmeld den indbyggede RStudio hjælp til forskellige funktioner. Funktionen mest tilbøjelige til at blive brugt vil være ved hjælp af vil være brightness(). Se hjælp-filen til denne funktion ved at skrive? Brightness() på konsollen.
- Beregne lysstyrke
- Sige man har en billedfil på skrivebordet med navnet img001.tif (Bemærk at 'nandb' kun virker med TIFF-filer). Man kan beregne lysstyrken af dette billede:
b <-lysstyrke ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")- Dette tildeler den variable b i R. billedets lysstyrke Tau = "auto" sikrer, at billedet er korrekt detrended før lysstyrke beregning. De mest almindelige ting at gøre her er at beregne gennemsnit eller median lysstyrken af billedet. Man kan gøre dette ved at skrive mean(b) eller median(b). Man kan også skrive lysstyrke billedet til skrivebordet ved hjælp af
ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
- Dette tildeler den variable b i R. billedets lysstyrke Tau = "auto" sikrer, at billedet er korrekt detrended før lysstyrke beregning. De mest almindelige ting at gøre her er at beregne gennemsnit eller median lysstyrken af billedet. Man kan gøre dette ved at skrive mean(b) eller median(b). Man kan også skrive lysstyrke billedet til skrivebordet ved hjælp af
- Sige man har mappe fuld af billeder images_folder på skrivebordet og man skal beregne lysstyrke af disse billeder og skrive lysstyrke billeder som TIFF-filer. Derefter se? brightness_folder(). Denne funktion behandler en hel mappe på én gang:
brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
Det er især godt for dem, der har en software, de foretrækker at R, fordi alle filer behandles i én enkelt kommando, og derefter en kan gå på arbejde med output lysstyrke TIFF billeder i deres valgte software, det være sig ImageJ14 , Python eller noget andet.
- Sige man har en billedfil på skrivebordet med navnet img001.tif (Bemærk at 'nandb' kun virker med TIFF-filer). Man kan beregne lysstyrken af dette billede:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detrending og monomere lysstyrke
Når dataene er opnået, kan man starte lysstyrke beregninger for at bestemme tilstanden oligomere protein af interesse i løsningen. Selv om effekten af blegning i løsning ikke kan være så drastiske som det kan være i vivo, intensitet spor har stadig nok ikke stationære betyder, muligvis på grund af photophysical effekter relateret til fluorophore,18 , men årsagerne til dette er ikke fuldt forstået. Dette har betydning ved beregningen af lysstyrke; Når du forsøger at bestemme monomer-dimer overgange, er dette aspekt afgørende. Ved at anvende automatiske detrend algoritme til de data, der er vist i figur 2en, intensitet spor er korrekt rettet, giver en mere nøjagtig værdi for lysstyrke af FKBP12F36V-mVenus i løsning. Før tilsætning af BB, uden detrending, B = 1.026, mens efter detrending, B = 1.005 (figur 2b).
Bestemmelse af FKBP12 F36V -mVenus monomer-dimer overgange in vitro-
Sekvenser af 20.000 billeder af renset FKBP12F36V - mVenus i 100 nM løsning blev erhvervet som angivet i afsnittet protokol. Efter 10.000 rammer blev erhvervet, blev homodimerizer stof BB tilføjet til løsningen samtidig erhverve. Hver på hinanden følgende række 5.000 rammer blev analyseret (figur 3). Den gennemsnitlige lysstyrke 5 minutter efter BB tilføjelse var B = 1.010, hvilket er en 2-fold stigning, som angiver en FKBP12F36V dimer. Kinetik af processen er vist i figur 3b; forsinkelsen mellem BB tilføjelse til fuld FKBP12F36V dimerization var ca. 2 minutter.
Identifikation af protein aggregater
En række af protein aggregater blev registreret både i et begrænset antal billeder, og også i intensitet trace (figur 4). Disse aggregater forekommer naturligt i løsning, når du arbejder med proteiner og kan elimineres ved sonicating og/eller øge protein fortynding. Ikke desto mindre i nogle biologiske problemer skal man registrere overgange mellem monomerer og store aggregater. Figur 4 viser et eksempel, hvor en FKBP12F36V protein samlede diffust gennem observation volumen (billeder 16 x 16); vores tidligere beregninger af disse data blev kasseret dog er et eksempel vist i figur 4 til at vise, at disse aggregater kan påvises og karakteriseret ved hjælp af de samme indstillinger og tilgang. Ved første øjekast, når de evaluerer de 5000 billeder, man kan genoprette den gennemsnitlige lysstyrke for FKBP12F36V-mVenus behandlet med BB (B = 1.010). Visning af raw lysstyrke billedet, kan man tydeligt se, dog en region af interesse på ca 8 pixel med en høj værdi af B ≈ 1.080. Denne region af interesse falder sammen med et par rammer på t = 34-37 s hvor et FKBP12F36V aggregat spredt omkring området observation. Samlet forblive ikke i observation volumen længe nok til at præcist bestemme dens størrelse.
Figur 1 . Anvendelsen af N & B at opdage protein monomer-dimer overgange i løsning. (a) forenklet optisk bane af laser scanning mikroskop (LSM) udstyret med en Laserkilde (sat på 514 nm ved mVenus mærket proteiner) instrueret (blå pile) mod en nedsænkning målsætning (i vores tilfælde en 63X1.4NA olie) lysende en 100 nM løsning af FKBP12F36V-mVenus løsning. Emission fluorescens (grønne pile) passerer gennem en dichroic spejl og er rettet mod en bandpass filter, der renser emissionen lys, og et pinhole sat til 1 luftige enhed beliggende lige før et punkt digital detektor kan photon optælling. (b) en Konfokal volumen af belysning er scannet gennem 16 x 16 pixel lysende enkelt FKBP12F36V-mVenus-molekyler, der indtaste og afslutte den Gaussisk form Konfokal volumen producerer en bred vifte af fluorescens intensitet udsving. (c) Image serien erhvervet over tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Automatiske detrending er nødvendigt at præcist at måle en befolkning af monomerer i løsning. a en stak af 5000 16 x 16 pixel billeder blev erhvervet som beskrevet i protokollen afsnit. Intensiteten af det første billede er vist sammen med den gennemsnitlige tidsopløst intensitet profil, der viser lange sigt udsving, som kan være relateret til blegning og andre opløsningsmidler og/eller photophysic effekter. Uanset årsagen disse langsigtede svingninger, de påvirker beregningerne af lysstyrke og dermed kræver detrending. Uden automatisk detrend, får man B = 1.026, hvorimod efter automatiske detrending, B = 1.005. Også, lysstyrke uden (venstre paneler, anden række) og med (lige paneler, anden række) glat filtrering er vist. (b) de samme data præsenteret i (a) var detrended og resultater med hensyn til intensitet og lysstyrke vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . In vitro-N & B er i stand til at løse overgangen mellem FKBP12F36V monomerer og dimerer i realtid. Tilføjelse af dimerizer stoffet BB resulterede i en to-fold stigning i ægte lysstyrke lige efter 2 min (fra 0,005 til 0.010 i ægte molekylære lysstyrke). (a) intensiteten af det første billede er vist sammen med den gennemsnitlige intensitet profil af det detrended billede. Lysstyrke uden (venstre paneler, anden række) og med (lige paneler, anden række) glat filtrering er vist. (b) mener lysstyrke er afbildet (hver 5000 billeder) ved hjælp af sande molekylære lysstyrke ε. Dimerization opstår 2 minutter efter BB tilsætning (t = 1 min) på t = 4 min. Monteret kurven er en sigmoide funktion at understrege tendens til dimerization efter tilsætning af dimerizer stoffet (BB). Fejllinjer udgør standardfejl for den lysstyrke fordeling på hvert tidspunkt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . In vitro N & B at løse størrelsen af protein aggregater i løsning. (a) tidsopløst intensitet detrended spor til erhvervelse af FKBP12F36V-mVenus er vist sammen med lysstyrke billeder (anden række). (b) tidsopløst detrended intensitet sporingen viser højst i intensitet, der er fremhævet med en rød prikket cirkel (øverste venstre panel). Den første intensitet ramme, der svarer til denne særlige tid (t = 34 sekunder) er vist og en rød pil viser en FKBP12F36V-mVenus samlet ind i området belysning. Et nærmere kig ind i glattes lysstyrke billedet viser en region af interesse, der indeholder høje oligomere stater og resten af billedet indeholder en blanding mellem monomerer og dimerer med et gennemsnit på B = 1.008. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B er en teknik til at opdage multimerization ved hjælp af kommercielle lys scanning Konfokal mikroskoper udstyret med digitale detektorer. Denne fremgangsmåde er ganske attraktiv i forhold til enkelt punkt FCS, FCCS og smFRET fordi det er kalibrering gratis og beregningen af lysstyrke er ligetil og koncentration uafhængige6. Det er af stor betydning, men at korrigere for blegning og langvarig intensitet udsving før du udfører lysstyrke beregninger9; en svag stigning af lysstyrke på grund af blegning og andre artefakter kan mistolkes som en forandring i oligomere stat (som det ses i figur 2en) Hvis detrending er forsømt eller udført forkert. Anvendelse af automatiske detrend algoritme giver mulighed for nøjagtig lysstyrke beregninger.
Det er vigtigt, at følge en række regler ved erhvervelse af billederne. Først, opholdstid af molekyler i Konfokal volumen, og derfor deres diffusion konstant skal være kendt for at sætte de rigtige parametre for Konfokal systemet; opholdstid af mærket molekyler skal opholde sig mellem pixel dvæle tid og ramme gang7. At vælge den rigtige fluorophore er afgørende. En lyse og stabile fluorophore er nødvendige for god signal til støj og minimal photobleaching. Laser power bør holdes relativt lav at undgå blegning. Foton tæller 1 eller 2 pr. pixel er tilstrækkelig. At holde tæller lav er også afgørende at undgå detektor harmonikasammenstød. Teknikken klarer lavt photon budgetter bedre end det klarer med blegning. MVenus har været ansat i denne protokol; der er en forholdsvis lyse fluorophore, sammenlignes med eGFP19. Et alternativ er brugen af nanoboosters, der selektivt målrette en fluorescerende proteiner; disse kan være meget lysere end traditionelle fluorophores20.
Med hensyn til hardware, digital photon-optælling detektorer gøre kvantificering lettere, men N & B er muligt med analog detektorer, forudsat at man har genvundet nogle erhvervelse parametre. 8
Selv om andre tilgange som anisotropy kan registrere homo-dimerization, med fremkomsten af ny software at forenkle analyse, står N & B alene som en tilgængelige tilgang til at detektere og kvantificere protein interaktioner og oligomerisering, begge in vitro- og i levende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er blevet støttet af Wellcome Trust give R.N. 105278/Z/14/2 Wellcome Trust Center for humangenetik er finansieret af Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2. Arbejde i gruppen C.S. understøttes af Cancer Research UK (C20724/A14414) og det Europæiske Forskningsråd under EUs Horisont 2020 forskning og Innovation program tilskud 647278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
- Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. , (2017).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
- Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. , (2017).
- Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
- Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
- Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. , (2017).
- RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. , (2016).
- Nolan, R. nandb R package. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
- Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).
