Summary
이 프로토콜의 주요 초점은 가능한 기본 glomeruli 문화 다양 한 다운스트림 응용 프로그램에에서 사용 하기 위해 최소한의 오염 물질을 효율적으로 분리 하는 것입니다. 격리 된 glomeruli 구성 요소 셀 형식 간의 구조적 관계를 유지 하 고 교양 비보 전 짧은 시간 동안 수 있습니다.
Abstract
사 구조와 기능 보존은 사 구체 신 염의 예방, 신장 질환 특징으로 이어질 수 있는 결국 만성 proteinuria와 끝 단계 신장 질병의 범주에. glomerulus은 복잡 한 기구는 시체에서 플라즈마의 여과 대 한 책임 이다. 질병에서 구조적 무결성 손실 이며 소변으로 비정상적인 플라즈마 내용 누설에 대 한 수 있습니다. 격리 하 고 문화에서 glomeruli 검사 메서드는 이러한 질병의 연구에 대 한 중요 한. 이 프로토콜 구조 및 형태학 상 특성을 보존 하는 동안 그대로 glomeruli 성인 쥐 신장에서 검색 하는 효율적인 방법을 설명 합니다. 이 과정은 다른 nephron 세그먼트에서 최소한의 오염 신장 당 glomeruli의 높은 수익률을 생성할 수 있는. 이러한 glomeruli와 부상 상태는 원인 발 프로세스 항목 및 동물 모델에서 proteinuria protamine 황산 등 화학 독 소의 다양 한 그들을 배양 하 여 유사 수 있습니다. 상해의 정도 전송 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 염색 법, 그리고 서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 평가 될 수 있다. Nephrin 및 Wilms 종양 1 (WT1) 수준 또한 이러한 문화에서 평가 될 수 있습니다. 용이성과이 프로토콜의 유연성, 격리 glomeruli 설명 또는 더 나은 연구 사 건강 및 질병 상태에서 구조 연구자의 요구에 가장 적합 한 방법으로 활용할 수 있습니다.
Introduction
glomerulus 모세 혈관 순환 플라즈마의 여과 대 한 책임의 고도로 전문화 된 술 이다. 그것은 신장의 기본적인 기능 단위 nephron의 시작 부분을 형성 한다. 사 기능 고유 fenestrated 모 세관 내 피, podocytes, 슬릿 막과 중간 지하실 멤브레인에 의해 정의 됩니다. 이러한 레이어는 filtrate에 물질의 선택적 배설 수 있도록 반 투과성 방 벽을 형성 한다. 물, 이온, 및 다른 작은 분자 일반적으로 통과, 큰 분자는 플라즈마에 유지 됩니다. Podocytes는 지하실 멤브레인에 걸쳐 전문된 상피 세포 세포질 예측 발 프로세스로 알려진 모 세관을 둘러싼. 발 인접 podocytes interdigitate의 처리 하 고 슬릿 diaphragms nephrin, podocin, P-cadherin, ZO-11같은 단백질의 구성에 의해 교차. 크로스 섹션에서 이러한 발 프로세스는 균등 하 게 배열 지하실 멤브레인에. 병 glomeruli, 조잡 한 비정상적인 또는 "지워," 플라즈마 내용의 비정상적인 누수는 filtrate에 이어지는 발 프로세스 된다. 따라서, 사 손상 일반적으로 비정상적으로 많은 양의 단백질 (예를 들어, proteinuria) 또는 적혈구 (예, 혈 뇨) 소변에서의 존재에 의해 특징입니다. 또한, 부상된 podocytes nephrin 그것의 레 귤 레이 터 Wilms 종양 1 (WT1), 주요 단백질 차별화2,3의 유지 보수에 대 한 책임의 식을 잃는다. glomeruli 당뇨병 신 장병에 손상의 주요 목표 및 최소 변화 질병, 막 신 장병, 초점 단편 glomerulosclerosis 등 다른 glomerulonephritides 있습니다. 이 질병은 진보적인 신부전 및 말기 신장 질병의 발달, 생존이 투 석 또는 신장 이식에 의존 하는 상태에의 주요 원인. 따라서, 그것은 만성 신장 병 (CKD) 병 리를 이해 하기 glomeruli 공부 하는 것이 중요입니다.
셀 문화 시스템은 사 생물학을 공부 하 고 중요 합니다. 슬릿 격 막 단백질 돌연변이 때문 특정 proteinuric 질병의 존재 뿐만 아니라 슬릿 막 생성에 그것의 중추적인 역할 때문에 많은 연구 인지 고립에서 podocyte을 활용 하고있다. 이 체 외에서활용 하 주 podocyte 셀 라인의 세대를 이끌어 냈다. 이 세포는 다양 한 조건에서 경작 될 수 있다 하 고 침투성4를 평가 하기 위해 투과 지원에 조차 성장 될 수 있다. 그러나, 종종 증식 세포의 고립 그들의 podocyte 마커의 일부를 잃 었 dedifferentiated 셀을 선택 합니다. 들고 SV40 큰 T 유전자 (예: immortomouse), 문화에서 성장 될 수 있지만의 온도 민감한 돌연변이 유전자 변형 마우스 긴장에서 파생 하는 조건부 불멸 하 게 podocytes의 생성을 주도하 고 있다 podocyte 마커5의 전체 배열을 표현 하 분화. 이러한 방법의 기본 문화 이해 podocyte 생물학4,,67에 중추적인 되었습니다.
그럼에도 불구 하 고, 단일 셀 형식이 포함 된 문화 세포 관계 vivo에서 뿐만 아니라 지원 구조와 행렬, 발생 하는 부족 하 고 이러한 세포의 monolayers 할 하지 반드시 정리는 3 차원 glomeruli의 아키텍처입니다. 복잡 하 고 어려운8, 문화 중 하나는 immortomouse의 소지를 요구 하는 불멸 하 게 podocytes 수 있습니다 또는 셀에서의 시작 약 수 설립 조사 시작. 또한,는 glomerulus 뿐만 아니라 podocytes, 하지만 또한 모 세관 내 피 세포와는 지하실 멤브레인으로 mesangial 세포 구조에 대 한 지원을 제공 하는 구성 되어 있습니다. 따라서 비보 전 하는 접근 방식을 사용할 수 그들의 네이티브 아키텍처를 유지 하는 그대로 glomeruli의 연구에 대 한 모든 조사 뿐만 아니라 정상적인 glomerulus 구성 하는 모든 셀을 개발 하는 것이 유용 합니다.
1958 년에, 요리사 및 피커링 glomeruli 토끼 신장에서의 첫 번째 격리를 설명합니다. 지방 혈 glomeruli에 제기 되었다 관측, 후 그들은 구체적으로 이러한 구조를 분리 하는 같은 크기의 입자를 사용 될 수 postulated. 실제로, 신장에 산화 철 입자의 주입 glomeruli에 입자 트랩 이끌어 냈다. 기계적 분리 및 신장 체질, 후는 glomeruli 격리 그대로 고 수 자력 분리9통해 순도 함께. 1971 년 Misra가 보여주었다 혼합 생략 될 수 있는 산화 철 그리고 다진된 인간, 개, 토끼 또는 쥐 신장 조직10의 체질로 사 격리. 이 기술은 수정 된 이후 그는 수 사관의 목표에 따라 하지만 본질적으로 더 공부 될 수 또는 기본 셀 문화 설립된11,12 수는 정화 준비 결과 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
여기 우리는 그대로 가능한 glomeruli 쥐 신장에서의 격리에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 전체 프로토콜 불과 몇 시간 걸립니다. 비록 그들은 증식 하지 않는, 어떤 크기의 실험 계획 단순히 시작 물자로 신장 수를 증가 하 여 지원할 수 있다. Glomeruli 마그네틱 비드 분리에 대 한 게시 프로토콜을 확인 하 고는, 하는 동안 그들은 구슬의 정 맥 주입을 요구, 더, 그리고 비싼 구슬 glomeruli 문화에 의해 유지 하거나 또는 요구 사 이후 생물학을 변경할 수 있습니다 " lysing"고 원심19에 의해 제거. 마우스 glomeruli에 비해 쥐 glomeruli (2 개월 된 쥐18에서 약 100 µ m)의 더 큰 크기 쉽게 그것 간단한 체질 하 기술을 사용 하 여 다른 신장 구조에서 그들을 분리.
그들의 유용성의 증거로 서, 우리 다른 세포 유형 설명 하 glomeruli 특징 있다. 그들은 또한 glomeruli vivo에서, 다치게 하 알려진 대리인에 노출 될 수 있습니다 그리고 이러한 문화에 protamine 황산 (PS)의 부작용 설명. 추 신: 중화 사 모 세관 벽20따라 음이온 사이트는 polycation이입니다. 이 중화 사 여과 장벽에 극적인 효과 있으며 따라서 proteinuria와 발 프로세스 항목을 증가. 이러한 glomeruli nephrin 등 전반적인 건강을 평가 하기 위해 WT1 주요 단백질에 대 한 immunoblots로 평가 될 수 있다. 또한, 빛, 면역 형광 검사, 전자 현미경과 그들의 구조를 평가할 수 있습니다.
전반적으로,이 프로토콜은 대부분 수 사관 (하나만 동물 및 몇 가지 간단한 장비에 대 한 액세스를 필요)에 액세스할 수 있습니다. 형태학 상 기능 손상 되지 않은 왼쪽, 연구원은 수는 glomeruli 분석 하 고 어떻게 다른 중요 한 세포 유형을 참조와 매트릭스는 glomeruli에서 보존에 영향을 미치는 기능과 질병 진행, podocyte 문화의 단점.
Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 피츠버그의 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 쥐 Glomeruli의 격리
- 살 균 1% 절연 버퍼를 준비 하려면 600 mL 비 커에 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 5 g을 추가 합니다.
- 비 커를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 500 mL를 추가 하 고 모든 BSA 해산 때까지 자석 교 반 봉으로 저 어.
- 살 균 필터 셀 문화 후드에서 1 %BSA / PBS 버퍼.
참고: 살 균 1 %BSA / PBS 버퍼 1 주까지 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
- 2 ~ 4 Sprague-Dawley 쥐 150 ~ 200 g 무게를 얻을.
- 쥐를 통해 이산화탄소 흡입 챔버 볼륨 분당의 10-30%의 비율로 100% 이산화탄소 도입 챔버를 사용 하 여 안락사 호흡의 정지에 대 한 동물을 관찰 하 고 이산화 탄소에서에서 제거 하기 전에 눈 색깔을 버렸다.
- 70% 에탄올과 전방 복 부 위에 피부 준비를 발기, 머리 제거를 원하는 경우. 수술가 위 또는 메스를 사용 하 여 피부에 절 개를 중간 선을 확인 합니다. 내부 장기를 노출 하려면 근육 레이어를 통해 다른 중간 절 개를 확인 합니다. 안락사의 보조 방법으로 횡 경 막과 흉 골 또는 흉 곽을 통해 위에 절을 확장 합니다.
- 분리 하 고 두 신장 제거 살 균 50 mL 30 mL 행 크 스 버퍼링된 소금물 (HBSS) 얼음에의 플라스틱 원뿔 튜브에 배치.
참고: 여러 쥐 같은 챔버에 안락사 수와 모든 신장 같은 원뿔 튜브에 놓일 수 있습니다.
- 살 균 세포 문화 후드 얼음과 전송에 신장 유지 하십시오. 무 균 배양 접시 얼음, 동안 또한 HBSS의 5 mL를 포함 하는 신장 전송 하 고 제거 하 고가 위 perirenal 지방 질을 삭제 날카로운 집게. 여전히 존재 하는 경우 또한 제거 하 고 작은 표면 절 개를 하 여 신장 주변 캡슐을 버리고 날카로운 집게를 사용 하 여 부드럽게 잡아당겨 기관에서.
참고: 항상 얼음과 연습 내내 살 균 기술에 신장 분리를 유지. 멸 균 거 즈의 조각 장소에서 조작 하는 동안 신장을 질감된 표면으로 페 트리 접시에 놓일 수 있다.- 신장 반으로 잘라 세로로 (midsagittal 섹션) 제거 하 고 삭제 HBSS의 5 mL와 함께 두 번째 페 트리 접시에 메스와 모 수 (이) 색상에 어두운.
- 신장 피 질은 주로, 나머지 조각 3 HBSS의 5 mL를 페 트리 접시에 전송 하 고 조각 크기, 1 m m 미만 또는 붙여넣기 구성 될 때까지 무 균 면도날으로 말하다.
- 위쪽 및 아래쪽 1 %180 µ m 체의 젖은 BSA/500 mL 폐기물 비 커 위에 PBS. 이 단계는 중요 한 단백질으로 체 코트 고 수율 향상 됩니다 glomeruli의 부착을 감소 시킨다.
- 체의 작은 가장자리에 다진된 피를 놓고 얼음에 앉아 바닥 냄비에 체를 통해 조직 개썰매를 10 mL 주사기의 질감된 플런저 플랜지 (고무 인감 반대 측)를 사용 합니다. HBSS로 정기적으로 씻어 하지만 샘플 희석을 피하기 위해 가능한 한 조금 사용.
참고: 버퍼 총, 더 여기에서 사용 될 수 있습니다만 25 mL의 30 mL을 초과 하지 마십시오. 체의 한 가장자리에 다진된 조직 배치에 대 한 이유는 전체 체 표면적 보다는 체의 일부에 대 한 노출을 제한 하 여 glomeruli의 준수를 줄이는 것입니다.- 이것을 촉진 하기 위하여 체 린스를 바닥 냄비에 수집 하는 액체를 다시 사용 합니다. 체질 완료 되 면, 신중 하 게 느슨하게 붙어 있을 수 있습니다 어떤 glomeruli 잡으려고 팬의 바닥에서 1 %BSA / PBS 버퍼와 한 번 더 체의 바닥 세척.
- 20 G 바늘을 갖춘 여러 10 mL 주사기로 바닥 냄비에 액체의 모든를 수집 하 고 적어도 2 추가 번 바늘을 통해 전달. 마지막 컬렉션에 유지 glomeruli 포함 된 액체 주사기 90 µ m 체를 통과 하는 준비까지.
- 액체를 주사기에 저장 하는 동안 1 %BSA / PBS 폐기물 비 커와 젖은 상단와 하단 1 %90 µ m 체의 홍 조에 의해 바닥 냄비를 씻어 BSA/PBS. 얼음 바닥 냄비 위에 체를 놓습니다.
- 위에 설명으로 다른 주사기 플랜지와 체 통해 주사기에 샘플 체와 개썰매의 한 가장자리에 적용 됩니다. 씻어 체에의 한 가장자리에 모든 것을 수집 하 하단 팬에서 솔루션.
- 체질 한 번 완료, 신중 하 게 단계 1.5.1로 체의 바닥을 씻어. 50 mL 플라스틱 원뿔 튜브에서 바닥 냄비에 모든 액체를 수집 합니다.
- 1 폐기물 비 커와 젖은 상단에 BSA/PBS %와 1 %75 μ m 체의 하단 바닥 냄비를 씻어 BSA/PBS. 얼음 바닥 냄비 위에 체를 놓습니다.
- 체의 한쪽 가장자리에 샘플을 적용 됩니다. 액체는 쉽게 통해 흐름 해야 합니다. 1%의 최소한 20 mL와 상단을 통해 린스 폐기물 비 커에 BSA/PBS. 조심 스럽게 씻어도 체의 하단. glomeruli이 75 μ m 체 위에 유지 됩니다.
- HBSS를 사용 하 여 거꾸로 체 통해 rinsing 하 여 배양 접시에서 glomeruli 수집. 사용 하 여 필요에 따라 많은 HBSS 여기. 얼음에 하나 이상의 50 mL 플라스틱 원뿔 tube(s)로 수집 합니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 1800 x g에서 centrifuge, 상쾌한 피 펫,으로 신중 하 게 제거 하 고 차가운 HBSS 10 mL에 펠 릿을 resuspend. 여러 개의 원뿔 관 1.7.2에서 수집 된 샘플을 결합 한다. 원심 분리 단계를 반복 합니다.
- 다음 단계를 진행할 준비가 될 때까지 HBSS의 5 ml에서는 glomeruli를 resuspend.
- 원하는 경우, 총 glomeruli 수 가져가 라. 이 피 펫과 10 µ L 샘플 고 유리 슬라이드에 드롭 장소. 와 확인 현미경, 계산 필드에서 glomeruli 및 500 총 수익률을 얻을 수를 곱하십시오.
참고: 순도 tubules는 필드에서의 수를 계산 하 여 결정 될 수 있습니다 구조 glomeruli 및 관의 총 수를 나누어. 시야에 > 95 %glomeruli 있어야 한다.- 중요 한 관 오염 있는 경우에, 단계 1.6.1 이후, 반복 하 고 씻어 때 1.7.1 단계 완료 있는지 확인 하십시오. 이것은 단계에 있는 관 오염 발생 하는.
2입니다. Glomeruli 부상
- 200 x g. HBSS 잘 당 약 9000 glomeruli는 총 수익률에 따라의 적절 한 금액에 Resuspend에서 내려 15 mL 플라스틱 원뿔 튜브에 스핀 glomeruli를 수집 합니다. 샘플의 450 µ L 24-잘 접시의 각 음에 플라스틱 또는 다운스트림 분석 실험에 맞는 모든 플레이트 포맷 필요 합니다.
참고: 혼합 glomeruli 버퍼에 위쪽 및 아래쪽 Pipetting 균질 솔루션을 보장 합니다. glomeruli 매우 끈 적 하 고 무거운 및 것 이다 서로 게 충실 뿐 아니라 신속 하 고 튜브의 측면에는 솔루션의 하단에 정착. - 황산 (PS) 솔루션 6 mg/mL protamine을 하려면 먼저 철저 하 게 15 mL 플라스틱 원뿔 튜브와 소용돌이에 40 ° C에가 열 하는 dH2O의 10 mL에 1 g PS의 분해. 솔루션의 30 µ L 고 dH2O의 470 µ L에 추가.
참고:이 6 mg/mL 해결책을 생산할 예정 이다 그리고 아래에 설명 된 50 µ L 우물에 추가 됩니다, 최종 농도 0.6 mg/mL.- 중복, protamine 황산의 50 µ L을 추가 (이것은 1시 10분 희석) HBSS (부정적인 제어)의 또 다른 그룹 50 µ L를 제공 하면서 한 그룹의 각 잘.
- 4 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
- Microcentrifuge 튜브 (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) 각의 내용을 아래로 회전 시키십시오 고 각 PBS의 1 mL로 두 번 씻어.
- 최종 세척에서 aspirate 하 고 PBS의 300 µ L에서 resuspend. 3 aliquots 단백질 격리, 전송 전자 현미경 (TEM) 시각화, 그리고 면역 형광 얼룩 (경우)에 대 한 준비를 분할 한다.
3. 분석을 위한 Glomeruli 준비
- 3 aliquots (g, 4 ° C, 10-15 s x 4000)와 나머지 버퍼에서 aspirate의 내용을 아래로 회전 하 고 가장, 샘플 분석을 진행 하면, 또는 단백질 격리.
- 가장에 대 한 처리
- 사 알 약 0.01 M PBS에 차가운 2.5%도 150 µ L를 수정 했다. 펠 릿, 펠 렛을 방해 하지 않도록 하는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다음 PBS로 그것을 씻어 서에서 신중 하 게는 정착 액을 제거 하 고 1% 칼륨 ferricyanide와 1% 오스뮴 tetroxide에서 포스트 수정.
- 에탄올의 등급된 시리즈를 통해 샘플을 탈수 (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%)와 다음 자료를 포함 하는 에폭시에 포함 하는 프로필 렌 산화물.
- 잘라 얇은 반 (300 nm)는 ultramicrotome에 섹션. 0.5%와 1% 나트륨 붕 산 염에 톨루이 블루 stain 고 가벼운 현미경 검사.
- 잘라 ultrathin 섹션 (65 nm), uranyl 아세테이트와 Reynold의 리드 시트르산, 얼룩 및 전송 전자 현미경에서 검사.
- IF에 대 한 처리
- PBS 솔루션에서 12% 젤라틴의 150 µ L을 추가 하 고 즉시 드라이 아이스 펠 릿을 형성 하기에 놓습니다. 2 %paraformaldehyde / 1 500 µ L에 펠 릿을 담가 하룻밤 4 ° c.에 microcentrifuge 관에서 PBS x
- 기본 몰드에 펠 릿을 놓고 드라이 아이스에 최적의 절삭 온도 (10 월) 매체를 추가 하 여 포함 합니다. cryotome에 5-10 µ m 섹션을 잘라 고 면역 형광/immunohistochemistry 또는 표준 조직학 얼룩.
- 단백질 분리에 대 한
- 프로 테아 제 억제제의 1.5 µ L 함께 centrifuged 사 펠 릿 및 조직 균질과 dounce RIPA 버퍼의 150 µ L를 추가 합니다.
- 단백질 정량화 및 immunoblotting 또는 다른 단백질 분석을 진행 합니다.
Representative Results
격리는 glomeruli의 안락사의 시간에서 프로토콜 2 시간 만큼 적게 완료 될 수 있으며 높은 처리량 및 효율성. 기술, 6000-10000 glomeruli 8 신장부터 시작 하는 때 쥐 신장 범위 당 glomeruli의 수익률의 적절 한 사용으로 마지막 정지 glomeruli 선사 밀도가 있으며 전반적인 순도 > 95%를, 최소한의 오염 관 세그먼트 또는 다른 세포 유형 (그림 1A, B)에서 보여주는. 또한, 10 월 임베디드 glomeruli Hematoxylin과 오신 (H & E) 얼룩으로 형태 (그림 1C) 볼 얼룩이 될 수 있다. 이러한 glomeruli 처리 후에 전체 프로토콜을 통해 그들의 구조를 유지합니다. 절연된 glomeruli 그대로 하 고 가능한 podocytes (그림 2A), mesangial 세포 (그림 2B), 그리고 내 피 세포그림 2(C) 소유 설명 합니다.
절연, 일단은 glomeruli vivo에서 병리학을 시뮬레이션 하기 위해 잘 알려진 화학 부상에 노출 수 있습니다. 이 경우에, 결국 프로세스 겸 발 리드 사 여과 방 벽의 충전을 방해 하는 기능에 대 한 protamine 황산 (PS) 선정 되었다. PS 취급 glomeruli nephrin (빨간색)에서 눈에 띄는 감소와 핵 WT1 (녹색)를 통해 면역 형광 (그림 3A, B)에 대 한 긍정적인 수 있다. glomeruli 전송 전자 현미경 검사 법 (그림 3C)에 대 한 준비 또한 수 있습니다. 컨트롤 샘플 정상적인 podocyte 형태학 있고 PS 취급 glomeruli 발 과정 겸 (그림 3D), podocyte 장애의 징조 이며 vivo 모델 PS21을 사용 하 여 본 반면 프로세스를 발. 이 또한 nephrin immunoblotting (그림 3E, F)에 의해 감지에 있는 감소에 대응 했다.
생존 확인, 쪼개진된 caspase 3 apoptosis의 감 적으로 평가 했다. 면역 형광 검사를 사용 하 여, 쪼개진된 caspase 3 먼저 절연 (그림 4) 후 2 시간을 시작 몇 가지 셀에 나타납니다. 이 효소를 표현 하는 셀의 수는 24 및 48 h에 최고 수준으로 시간이 지남에, 더 풍부한 되었다. 이 apoptosis 초기 문화에에서 상대적으로 수행 제안 최상의 결과 대 한 격리 후 곧 다운스트림 응용 프로그램을 수행 해야 합니다.
그림 1 . 격리 후 쥐 사 문화의 전형적인 모습. (A) 사 문화의 명시 이미지. 우리는 거기에 하나의 신장 관이 현미경이 사진 (화살촉) 필드 선택, 비록 얻은 문화는 일반적으로 > 95% 순수. 눈금 막대는 100 µ m. (B) 확대 이미지를의 단일 glomerulus 같습니다. (C) 되며 고 오신 단일 glomerulus의 얼룩. B와 C 스케일 바 동등한 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 구성 세포 유형 격리 glomeruli에 유지 됩니다. Confocal 면역 형광 검사 현미경 검사 법 nephrin (빨강, podocytes) 및 podocytes, mesangial 세포, 및 endothelium 식별 하 셀 특정 마커에 대 한 수행 했습니다. (A) Costain nephrin 및 WT1 (녹색, podocytes). (B) Costain nephrin와 PDGFR-β (녹색, mesangial 세포, 화살표). (C) Costain nephrin 및 CD31 (녹색, 내 피 세포, 횡단면 화살촉에 의해 표시에 있는 배). 눈금 막대에 모든 패널 25 µ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Podocyte 상해 유도 생체 외에서 고립 된 쥐 glomeruli를 사용 하 여 될 수 있습니다. (A) Confocal 면역 형광 검사 현미경 검사 법 nephrin 및 WT1 치료 사 문화. Note (레드) 얼룩 선형 nephrin 고 WT1-긍정적인 핵 (녹색)은 일반적으로 건강 한 podocytes 있을 때 볼의 존재. (B) protamine 황산 처리, nephrin 식 후 감소 및 비-선형 이며 WT1 결 석, podocyte 상해를 나타내는입니다. (C) 전송 전자 microscpy (가장) 이미지 보여주는 발 과정, 지하실 멤브레인, 고 fenestrated endothelium 정상적인 사 구조의 전형적인. Equals 500 nm 바. (D) protamine 황산, 후 발 프로세스는 길쭉한 또는 없어지게 (화살촉), podocyte 상해 나타냅니다. (E) 서쪽 오 점 nephrin 보여주는 대 한 protamine 황산 처리 후 nephrin 감소. 서쪽 오 점을 위해 제어 로드 (F) 걸 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 격리 된 glomeruli에서 세포 생존 능력의 평가. 쪼개진 caspase-3 (녹색) confocal 면역 형광 검사 현미경 검사 법은 수행 되었다. Nephrin 공동 얼룩은 glomeruli를 쉽게 찾으려면 수행 되었다. Glomeruli의 격리 후 아무 쪼개진된 caspase 3 양성 0 하 고 1 시간 동안, 몇 가지 세포에 형광 신호 지적 했다 2 헤에 점차적으로 더 많은 셀 설정 되어 긍정적인 더 이상 그들은 조사 했다 격리 후. Caspase 3 긍정적인 세포의 수가 24 및 48 h.에서 지적 했다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 간단한 프로토콜 저렴, 재사용 가능한 장비를 사용 하 여 쥐 신장에서 glomeruli 복구 하는 효율적인 방법입니다. 모든 절차에서와 마찬가지로 그것의 유용성에 한계가 있다. 첫째, 비록 우리가 얻을 > 95% 순도, 프로토콜과 제외 불가능 시작 물자의 체질 하 특성 때문에 모든 오염 물질, 그리고 몇 가지 적혈구와 가끔 관 세그먼트 표시 됩니다 문화에. 우리는 이러한 작은 오염 물질 응용 프로그램의 대부분에 대 한 문제가 될 것을 예상 하지. 둘째, 체질 하 프로토콜 glomeruli는 쥐에서 보다 훨씬 큰 쥐 신장의 사용에 의존 합니다. 마우스 glomeruli 필요 하면 기술 상업 자석 구슬을 (예, Dynabeads)를 사용 하 여 게시 된22되었습니다. 셋째, 그것은 보였다 그 특정 mRNAs (플라스 미노 겐 활성 제 억제 물-1과 콜라겐 나) intraglomerular 세포23보다는 고립 된 glomeruli에 거의 전적으로 보 먼의 캡슐에서 파생. 이 부적절 한 결론 mRNA 절연 이러한 glomeruli에서 시도 하는 경우 발생할 수 있습니다. 그것은 우리 손에 glomeruli의 대부분은 decapsulated 이며 따라서 보 먼의 캡슐에서 상당한 기여를 부족 한다 주목 한다. 넷째, 세포 죽음 문화 조건에서 비교적 빨리 발생 하기 시작 합니다.
우리는 apoptotic 프로그램 쪼개진된 caspase 3의 외관에 의해 입증으로 활성화 되었다 문화의 2 시간에 시작 발견. 이것은 일반적으로 그 apoptosis 격리24후 1-2 시간 이내에 발생 하기 시작 하는 DNA 분열, TUNEL, 조직학 분석에 의해 평가 보여주는 이전 보고서와 계약 이다. 그러나, 그것은 또한 주목 해야한다 이른 관측 신진 대사 활동 고립 된 체질된 glomeruli 때 적어도 3 h,이 timepoint16에서 상당한 세포 생존을 제안에 대 한 교양에서 검출 될 수 보였다. 그럼에도 불구 하 고, 결과에 따라, 우리는 것이 최상의 결과 얻으려면 원하는 실험에 즉시 격리 glomeruli 활용 믿습니다. 우리는 전체 사 구조 그 timepoint 넘어 악화 하기 시작 관찰해 서 모든 실험 72 h 하기 전에 수행 되어야 하는 것이 좋습니다.
그것은 훨씬 쉽게 glomeruli 특정 수 준수 다양 한 체 손실 하지만 여 체는 극대로 입힌 다 면 추가 손실 때문에 유일한 2 반대 4-8 신장부터 시작 하는 때 더 높은 수익률을 얻을. 같은 이유로 그것은 BSA/PBS 버퍼 사전 glomeruli 체의 한쪽 가장자리에 조직 노출 제한 하 고 마른 체에 더 많은 가능성이 사용 하는 체를 흡수 하는 것이 중요. 아니 6 신장 (3 쥐) 적당 한 수익률을 얻을 시작 하는 것이 좋습니다.
일부 조사 문화17동안에 glomeruli 으로부터 성장 하는 경향이 격리 glomeruli 으로부터 기본 podocyte 문화 고립 있다. 우리는 어떤 고립 된 glomeruli 문화 접시 플라스틱에 고착 하는 것 이다 고 셀 늦은 timepoints (72 h 격리 후)에서 사 구조 마이그레이션할 시작 됩니다 지적 했다. 이러한 세포의 연구가 격리 프로토콜의 범위를 넘어 이며이 세포는 podocytes, 정수 리 상피 세포, 또는 둘 다15,25로 몇 가지 논쟁이 있다. 특히, Mundel은 외, 조약돌 셀 체질된 glomeruli에서 수확 특정 배양 조건26에서 성숙한 podocytes로 차별화 하는 유도 될 수 있습니다 보고 있다. 일부 셀 정체성에 관한 혼란 여부 격리 glomeruli 캡슐화 (를 포함 하 여 정수 리 상피 세포에 의해 채워집니다를 보 먼의 캡슐)에 따라 달라질 수 있습니다 또는 체질 하 절차에서 decapsulated. 180, 순차 체 크기를 사용 하 여 우리의 손에 90, 및 75 µ m glomeruli 되 고 decapsulated의 대부분에 지도 했다.
대부분 proteinuric 만성 신장 질환의 형태는 사 침투성 증가 되어야 한다. 몇몇 저자는 침투성 실험 ex vivo에서 에서 격리 glomeruli 활용 하 고 있다. 한 가지 방법은, 주변 미디어의 삼투성 내용을 변경 후 사 볼륨에 변경 침투성27추정 하 사용 되었다. 최근에, 그것은 고립 된 glomeruli에서 형광 프로브 누설 침투성 측정 하 계량 수 및 사 병 실험 모델28에 노출 하는 설치류에서 수행할 수 설립 되었다.
우리 편 준비 과정에서 우리 가끔 볼 발 지하실 멤브레인에서 프로세스 리프트 podocyte 지적 했다. 우리는이 문화에서 일어나는 고 가능성이 더 유물 중 가장 샘플 준비를 생각 하지 마십시오. 특히,이 문제가 발생 하는 경우에 그것은 분명 발 프로세스 "정상적인" 보고 여부 없어지게 됩니다.
전반적으로,이 프로토콜은 하나 상해에 대 한 응답에서 형태 론 적과 세포 변화를 평가할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 우리는 그것 때 사용할 수 있습니다 절연된 podocyte 문화 동반자 기법으로 특히 세포 외 기질 또는 다른 기본 셀 형식 상호 작용 고려 되 고 예상. 그것은이 쇠 약 질병에 대 한 미래의 치료제를 개발 하는 능력을 향상 시킬 것 이라고 proteinuric CKD의 이해를 높이기 위한 약속을 보유 하고있다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 부여 FTF 16990086, NIH P30 DK079307, 장학 고트 포상의 미국 사회, 피츠버그 의료 센터 경쟁 의료 연구 기금 상, 대학 및 피츠버그 대학에 의해 지원 되었다 의사 학술 재단 상입니다. 더 분석, 마라 설리반와 명나라를 통해 전자 현미경 검사 법, 태양 및 Yingjian 리 사 보존 및 그들의 기술 입력이이 프로토콜에 대 한 Youhua Liu에 대 한 그의 기술 제안에 감사 제라드 아 포 다카 하 고. 우리 또한 감사 신 시아 St. Hilaire CD31 항 체.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
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