Summary
De belangrijkste focus van dit protocol is efficiënt isoleren levensvatbare primaire glomeruli culturen met minimale contaminanten voor gebruik in een verscheidenheid van downstream toepassingen. De geïsoleerde glomeruli structurele relaties tussen component celtypes behouden en kunnen gekweekte ex vivo voor een korte tijd.
Abstract
Behoud van de glomerulaire structuur en functie is cruciaal in de preventie van glomerulonephritis, een soort gekenmerkt door Proteïnurie die uiteindelijk tot chronische leiden kan nierziekte en einde-fase nierziekte. De glomerulus is een complex apparaat verantwoordelijk voor de filtratie van plasma uit het lichaam. In ziekte, structurele integriteit is verloren en zorgt voor de abnormale lekkage van plasma inhoud in de urine. Een methode om te isoleren en bestuderen van de glomeruli in cultuur is essentieel voor de studie van deze ziekten. In dit protocol wordt een efficiënte methode voor het ophalen van intact glomeruli van volwassen ratten nieren terwijl het behoud van de structurele en morfologische kenmerken beschreven. Dit proces is geschikt voor het genereren van hoge rendementen van de glomeruli per nier met minimale besmetting van andere segmenten van het Nefron. Met deze glomeruli, kunnen letsel voorwaarden worden geïmiteerd door hen met een verscheidenheid aan chemische toxinen, met inbegrip van tijdje sulfaat, welke oorzaken proces geweest en Proteïnurie in diermodellen voet aan het broeden. Mate van letsel kan worden beoordeeld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie, immunofluorescentie kleuring en westelijke bevlekken. Nephrin en Wilms Tumor 1 (WT1) niveaus kunnen ook van deze culturen worden beoordeeld. Vanwege het gemak en de flexibiliteit van dit protocol, kunnen het geïsoleerde glomeruli zoals beschreven of op een manier die het best past bij de behoeften van de onderzoeker te helpen betere studie glomerulaire gezondheid en structuur in zieke Staten worden gebruikt.
Introduction
De glomerulus is een zeer gespecialiseerde plukje haarvaten verantwoordelijk voor de filtratie van plasma circuleren. Het vormt het begin van het Nefron, oftewel de basis functionele eenheid van de nier. Glomerulaire functie is gedefinieerd door een uniek fenêtré capillaire endotheel, het middenrif gleuf van podocytes en een tussenliggende kelder-membraan. Deze lagen vormen een semipermeable barrière te maken voor de selectieve uitscheiding van stoffen in het filtraat. Water, ionen en andere kleine moleculen in het algemeen passeren, terwijl grotere moleculen worden bewaard in het plasma. Podocytes zijn gespecialiseerde epitheliale cellen die worden verspreid via het membraan van de kelder, de haarvaten rond met cytoplasmatische projecties bekend als voet processen. De voet van de aangrenzende podocytes interdigitate verwerkt en worden doorkruist door de gleuf pessarium bestaat uit eiwitten zoals nephrin, podocin, P-cadherine en ZO-11. Doorsnede, deze voet processen zijn gelijkmatig gerangschikt over het membraan van de kelder. In zieke glomeruli worden de voet-processen Grove abnormale of "gewist," leiden tot abnormale lekken van plasma inhoud in het filtraat. Als zodanig, is glomerulaire schade in het algemeen gekenmerkt door de aanwezigheid van abnormaal grote hoeveelheden eiwitten (bijvoorbeeld Proteïnurie) en/of rode bloedcellen (b.v., hematurie) in de urine. Bovendien verliezen gewonde podocytes expressie van nephrin, alsmede de regelgever Wilms Tumor 1 (WT1), een belangrijke eiwit verantwoordelijk voor onderhoud van differentiatie2,3. De glomeruli zijn een primaire doelstelling van schade in diabetische nefropathie en andere glomerulonephritides zoals minimale verandering ziekte, membraanachtig nefropathie en focale segmentale glomerulosclerosis. Deze ziekten zijn belangrijke oorzaken van progressief nierfalen en de ontwikkeling van de einde-fase nierziekte, een aandoening waarbij overleven op dialyse of niertransplantatie berust. Daarom is het belangrijk om te bestuderen van de glomeruli om chronische nier ziekte (CKD) pathologie beter te begrijpen.
Een celcultuur is cruciaal voor de glomerulaire biologie studeren. Vanwege haar centrale rol in het genereren van het middenrif gleuf, alsmede het bestaan van specifieke proteinuric ziekten als gevolg van de gleuf membraan eiwit mutaties, heeft veel onderzoek begrijpelijkerwijs gebruikt de podocyte los. Dit heeft geleid tot de generatie van primaire podocyte cellijnen in vitrogebruiken. Deze cellen kunnen worden gekweekt onder allerlei omstandigheden en zelfs kunnen worden gekweekt op poreuze ondergronden te beoordelen permeabiliteit4. Echter, het isolement van delende cellen vaak selecteert u dedifferentiated cellen die sommige van hun podocyte markers hebben verloren. Dit heeft geleid tot de generatie van voorwaardelijk vereeuwigd podocytes afgeleid van een stam van de transgene muis een temperatuurgevoelige mutant van het SV40 grote T gen (bijvoorbeeld immortomouse), die kan worden geteeld in cultuur maar ook uitvoering gedifferentieerd om uit te drukken een volledige reeks van podocyte markeringen5. Deze methoden van primaire cultuur zijn cruciaal in begrip podocyte biologie4,6,7.
Niettemin, culturen met eencellige soorten ontbreken de intercellulaire relaties die zich in vivo evenals de ondersteunende structuur en matrices voordoen, en monolayers van deze cellen doen niet per se het driedimensionele recapituleren architectuur van de glomeruli. De vereeuwigd podocytes kunnen ook worden omslachtig en uitdagende cultuur8, en bezit van ofwel de immortomouse of een startende hoeveelheid cellen uit gevestigde onderzoekers aan de slag. Verder is de glomerulus bestaat uit niet alleen podocytes, maar ook capillaire endotheliale cellen en het membraan van de kelder, evenals mesangial cellen, die ondersteuning voor de structuur bieden. Daarom is het nuttig aan een ex vivo benadering beschikbaar aan alle onderzoekers voor de studie van intact glomeruli die behouden hun inheemse architectuur evenals alle cellen vormen de normale glomerulus.
In 1958 beschreef Cook en Pickering de eerste isolatie van de glomeruli van de nier konijn. Na opmerkingen dat vet emboli werd ingediend in de glomeruli, ze gepostuleerd dat deeltjes van dezelfde grootte kunnen worden gebruikt om specifiek deze structuren te isoleren. Inderdaad, de infusie van ijzeroxide deeltjes in de nier die leidde tot de vangst van deze deeltjes in de glomeruli. Na mechanische dissociatie en zeven van de nier, zou de glomeruli geïsoleerde intact en heeft daar met zuiverheid door het gebruik van magnetische scheiding9. In 1971, Misra heeft aangetoond dat de ijzeroxide infusies kon worden weggelaten, en glomerulaire isolatie bereikt met zeven van gehakt mens, hond, konijn of rat nier weefsel10. Deze techniek is gewijzigd sinds dan afhankelijk van het doel van de onderzoekers, maar in wezen heeft geresulteerd in gezuiverde voorbereidingen die verder kan worden onderzocht of waaruit zou primaire celculturen gevestigde11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Hier beschrijven we een protocol voor de isolatie van intact levensvatbare glomeruli van de nier van de rat. Het gehele protocol duurt slechts een paar uur. Hoewel ze niet verspreiden, kunnen experimentele plannen van elke grootte worden ondersteund door het simpelweg toename van de nieren als grondstof. Hoewel er gepubliceerde protocollen voor de scheiding van de magnetische parel van de glomeruli, ze vereisen een intraveneuze injectie van parels zijn duurder en biologie kunnen veranderen aangezien de kralen ofwel door de glomeruli in cultuur behouden zijn of glomerulaire vereisen" Lysing"en verwijdering door centrifugeren19. Vergeleken met de glomeruli van de muis, maakt de grotere omvang van de glomeruli van de rat (bijna 100 µm in twee maanden oude ratten18) het veel gemakkelijker om ze te scheiden van andere structuren van de nier met behulp van een eenvoudige zeven techniek.
Als bewijs van hun nut, hebben we de glomeruli om aan te tonen van de verschillende soorten cellen gekenmerkt. Ze kunnen ook worden blootgesteld aan agentia bekend te verwonden glomeruli in vivo, en wij laten zien dat de nadelige gevolgen van tijdje sulfaat (PS) op deze culturen. PS is een polycation dat de anionogene bezienswaardigheden langs de glomerulaire capillaire muur20 neutraliseert. Deze neutralisatie heeft een dramatisch effect op de barrière van de glomerulaire filtratie en daarom verhoogt Proteïnurie en voet proces geweest. Deze glomeruli kunnen worden beoordeeld met immunoblots voor belangrijke eiwitten zoals nephrin en WT1 om te beoordelen van de algehele gezondheid. Bovendien kan hun structuur worden geëvalueerd met licht, immunofluorescentie, en elektronenmicroscopie.
Globaal, is dit protocol is toegankelijk voor de meeste onderzoekers (hoeft alleen toegang tot de dieren en enkele eenvoudige apparatuur). Met de morfologische kenmerken links onbeschadigd, de onderzoeker vermag de glomeruli analyseren en zien hoe andere belangrijke celtypes en matrix behoud in de glomeruli invloed op functie en ziekte progressie, een tekortkoming van podocyte culturen.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Pittsburgh.
1. isolatie van de Glomeruli van de Rat
- Ter voorbereiding van een steriele 1% isolatie buffer, voeg toe 5 g bovien serumalbumine (BSA) in een bekerglas van 600 mL.
- 500 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toevoegen aan het bekerglas en roer met een magnetische roeren staaf totdat alle BSA wordt ontbonden.
- Steriel filter de 1% BSA/PBS buffer in een cel cultuur kap.
Opmerking: De steriele 1% BSA/PBS buffer kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal een week.
- Verkrijgen van 2 tot en met 4 Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 150 tot 200 g/stuk.
- Euthanaseren ratten via kooldioxide inhalatie met behulp van een kamer in die 100% kooldioxide wordt geïntroduceerd met een snelheid van 10-30% van het volume van de kamer per minuut. Observeren van dieren voor de stopzetting van de ademhaling en verschoten oogkleur vóór verwijdering van kooldioxide.
- Bereiden de huid over de voorste buik met 70% ethanol en tondeuses om te verwijderen van haar, gebruik te maken indien gewenst. Maak een middellijn incisie in de huid met behulp van chirurgische schaar of scalpel. Maak een andere middellijn incisie door de spier laag bloot van de inwendige organen. Uitbreiden van de incisie superiorly via het middenrif en het borstbeen of de ribbenkast als een secundaire methode voor euthanasie.
- Isoleren en verwijderen van beide nieren en leg in een steriele 50 mL plastic conische buis met 30 mL Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS) op ijs.
Opmerking: Meerdere ratten kunnen worden euthanized in de dezelfde kamer en alle van de nieren kan worden geplaatst in de dezelfde conische buis.
- Houd de nieren op ijs en vervoer aan een steriele cel cultuur kap. De nieren overbrengen in een steriele petrischaal met 5 mL HBSS, ook over ijs, en verwijderen en het negeren van perirenal vet met een schaar en scherpe pincet. Indien nog aanwezig, ook verwijderen en negeren de capsule rond de nieren door het maken van een kleine incisie van oppervlakkige en gebruik vervolgens scherpe pincet voorzichtig om het te trekken uit de buurt van het orgel.
Opmerking: Houd altijd nier isolaten op ijs en praktijk steriele techniek in. Een stuk van steriel gaas kan worden geplaatst in de petrischaal als een geborsteld oppervlak aan de nier op zijn plaats te houden tijdens de manipulatie.- Nieren doormidden snijden in de lengte (sagittale sectie) en verwijderen en de medulla (dat is donkerder van kleur) met een scalpel in een tweede petrischaal met 5 mL HBSS negeren.
- Breng de resterende stukken, die overwegend nier cortex zijn, in een derde petrischaal met 5 mL HBSS en gehakt met een steriele scheermesje totdat de stukken zijn minder dan 1 mm in grootte, of tot een pasta ontstaat.
- NAT van de boven- en onderkant van een zeef 180 µm met 1% BSA/PBS over een afval bekerglas van 500 mL. Deze stap is essentieel als het jassen van de zeef met eiwit en vermindert de hechting van de glomeruli, die opbrengst zal verbeteren.
- Leg de gehakt cortex op een kleine rand van de zeef en met de getextureerde plunjer flens (de zijde tegenover de rubberen afdichting) van een 10 mL spuit brij van het weefsel door de zeef in een pan van de bodem op ijs zitten. Regelmatig spoelen met HBSS maar gebruik zo weinig mogelijk te vermijden monsterverdunning.
Opmerking: Niet meer dan 30 mL buffer totaal, dus alleen 25 mL meer kunnen hier worden gebruikt. De reden voor het plaatsen van het gehakt weefsel aan slechts één rand van de zeef is om hechting van de glomeruli door beperking van de blootstelling aan deel van de zeef in plaats van de oppervlakte van de gehele zeef.- Om dit te vergemakkelijken, de vloeistof verzamelen in de onderste pan te spoelen van de zeef te hergebruiken. Zodra conventioneel-het zeven voltooid is, grondig te wassen onder in de zeef nog eens met 1% BSA/PBS buffer van de bodem van de pan vast te leggen van de glomeruli die losjes in acht kunnen worden genomen.
- Verzamel alle van de vloeistof in de onderste pan in verschillende 10 mL spuiten uitgerust met 20 G naalden en doorgeven via de naald ten minste 2 extra keer. Op de laatste collectie, door de glomeruli-bevattende vloeistof in de spuit totdat u het passeren van de 90 µm zeef te houden.
- Terwijl de vloeistof wordt opgeslagen in de spuiten, de onderste pan wassen door te spoelen met 1% BSA/PBS in afval bekerglas en natte boven- en onderkant van een zeef 90 µm met 1% BSA/PBS. Plaats de zeef op de top van de pan bodem op ijs.
- Het monster in de spuiten toepassen door een van de randen van de zeef en mush door de zeef met een andere flens spuit zoals hierboven beschreven. Wassen met oplossing uit de onderste pan voor het verzamelen van alles op een van de randen van de zeef.
- Zeven eenmaal is voltooid, de onderkant van de zeef zoals in stap 1.5.1 grondig te wassen. Verzamel alle van de vloeistof in de onderste pan in een 50 mL plastic conische buis.
- Wassen van de onderste pan met 1% BSA/PBS in een afval bekerglas en natte boven- en onderkant van een zeef 75 µm met 1% BSA/PBS. Plaats de zeef op de top van de pan bodem op ijs.
- Het monster van toepassing op een van de randen van de zeef. Vloeistof moet gemakkelijk doorstromen. Spoel via de bovenkant met ten minste 20 mL van de 1% BSA/PBS in afval bekerglas. De onderkant van de zeef zo goed grondig te wassen. De glomeruli blijft op de bovenkant van deze 75 µm zeef.
- HBSS gebruiken voor het verzamelen van de glomeruli in een petrischaal door spoelen door de zeef ondersteboven. Gebruik zoveel HBSS desgewenst hier. In één of meer 50 mL kunststof conisch sproeibuis(-buizen) verzamelen op het ijs.
- Centrifugeer bij 1800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, verwijderen van supernatant zorgvuldig met een pipet en resuspendeer de pellet in 10 mL koude HBSS. Combineer de monsters als meerdere conische buizen werden verzameld in 1.7.2. Herhaal de stap van centrifugeren.
- Resuspendeer de glomeruli in 5 mL HBSS tot klaar om te gaan met de volgende stap.
- Indien gewenst nemen een telling van het totale glomeruli. Hiervoor, neemt een 10 µL monster met een pipet en breng de druppel op een glasplaatje. Bekijken onder een Microscoop, tellen de glomeruli in het veld en vermenigvuldig met 500 te krijgen van de totale opbrengst.
Opmerking: Zuiverheid kan worden vastgesteld door het aantal tubuli gezien in het veld te tellen en te delen door het totale aantal van de glomeruli en zaadvormende structuren. Er moet > 95% glomeruli in het gezichtsveld.- Als er significante buisvormige besmetting, herhaal stap 1.6.1 verder, en zorg ervoor dat u grondig wassen wanneer 1.7.1 voltooiing van stap. Dit is de stap in welke buisvormige besmetting is het meest waarschijnlijk optreden.
2. letsel van de Glomeruli
- Het verzamelen van de glomeruli in een kunststof conisch tube van 15 mL en de spin naar beneden op 200 x g. resuspendeer in een passend bedrag van HBSS op basis van de totale opbrengst zodat er ongeveer 9.000 glomeruli per putje. Pipetteer 450 µL van monster in elk putje van de plaat van een 24-well, of enige vorm van de plaat die past de stroomafwaartse tests vereist.
Opmerking: Pipetting omhoog en omlaag als u wilt mengen glomeruli in buffer zorgt voor een homogene oplossing. De glomeruli zal zijn zeer kleverig en zwaar en vasthouden aan elkaar evenals vestigen op de bodem van een oplossing, snel en op de zijkanten van de buis. - Om 6 mg/mL tijdje sulfaat (PS) oplossing, eerst los 1 g PS in 10 mL dH2O verwarmd tot 40 ° C in een kunststof conisch tube van 15 mL en de vortex grondig. Neem 30 µL van de oplossing en voeg naar 470 µL van dH2O.
Opmerking: Dit zal produceren een 6 mg/mL oplossing, en wanneer 50 µL worden toegevoegd aan de put, zoals hieronder beschreven, de eindconcentratie is 0,6 mg/mL.- In tweevoud, voeg 50 µL tijdje sulfaat (dit is een 1:10 verdunning) aan elk putje van één groep, terwijl het verstrekken van een andere groep 50 µL van HBSS (negatieve controle).
- Incubeer de plaat voor 4 uur bij 37 ° C.
- Spin down inhoud van elk putje in een microcentrifuge buis (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) en spoel tweemaal met 1 mL PBS elke.
- Uit de laatste wasbeurt gecombineerd en resuspendeer in 300 µL van PBS. Opgesplitst in drie aliquots worden voorbereid voor de isolatie van de eiwit, transmissie elektronenmicroscoop (TEM) visualisatie en immunofluorescentie (IF) kleuring.
3. voorbereiding van de Glomeruli p.a.
- Spin down de inhoud van de drie aliquots (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) en aspirate uit de resterende buffer en gaat u verder met de analyse van het monster door TEM, als, of eiwit isolatie.
- Verwerking voor TEM
- Corrigeer glomerulaire pellets in 150 µL van koude 2,5% Glutaaraldehyde in 0,01 M PBS. Het fixeer zorgvuldig verwijderen van de pellet met behulp van een pipet van Pasteur, om ervoor te zorgen niet te verstoren de pellet, dan het gespoeld met PBS en post het in 1% osmium tetroxide met 1% kalium Hexacyanoferraat bevestigen.
- Uitdrogen van het monster door een gesorteerde reeks van ethanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) en propyleenoxide vervolgens insluiten in epoxy materiaal te embedding.
- Gesneden semi-dun (300 nm) secties op een ultramicrotome. Vlek met 0,5% toluïdine blauw in 1% natriumboraat en onderzoeken ze onder de lichte Microscoop.
- Uiterst dunne secties gesneden (65 nm), vlekken hen met uranyl acetaat en Reynold van lood citraat en onderzoeken op een transmissie-elektronenmicroscoop.
- Verwerking voor als
- Voeg 150 µL van een 12%-gelatine in PBS oplossing en onmiddellijk plaats op droog ijs vormen een pellet. Geniet van de pellet in 500 µL van 2% paraformaldehyde/1 x PBS in een microcentrifuge buis 's nachts bij 4 ° C.
- Plaats de pellet in een basis schimmel en insluiten door optimale scherpe temperatuur (OCT) medium over droog ijs toe te voegen. Knip 5-10 µm secties op een cryotome en ga verder met immunofluorescentie/immunohistochemistry of standaard histologische vlekken.
- Voor de isolatie van de eiwit
- 150 µL van RIPA buffer aan gecentrifugeerde glomerulaire pellet met 1,5 µL van proteaseinhibitor en dounce met weefsel homogeniseerders toevoegen.
- Ga door naar eiwit kwantificering en immunoblotting of andere eiwit analyse.
Representative Results
Het protocol uit de tijd van euthanasie bij isolatie van de glomeruli kan worden afgerond in minder dan 2 h en heeft een hoge doorvoersnelheid en efficiëntie. Met het juiste gebruik van de techniek, de opbrengst van de glomeruli per rat nier varieert van 6000-10.000 glomeruli wanneer beginnen met 8 nieren. De definitieve opschorting dichtbevolkte is verpakt met de glomeruli en heeft een totale zuiverheid > 95%, met minimale besmetting van buisvormige segmenten of andere celtypes (Figuur 1A, B). Daarnaast kunnen de glomeruli OCT-embedded worden gekleurd met haematoxyline en eosine (H & E) vlekken te zien van de morfologie (Figuur 1C). Deze glomeruli behouden hun structuur in het gehele protocol, zelfs na verwerking. We laten zien dat geïsoleerde glomeruli intact en levensvatbare podocytes(Figuur 2), mesangial cellen (Figuur 2B) en endotheliale cellen (Figuur 2C bezitten).
Het geïsoleerde, kunnen de glomeruli worden blootgesteld aan bekende chemische verwondingen te simuleren in vivo pathologie. In dit geval werd tijdje sulfaat (PS) gekozen voor haar vermogen om het verstoren van de lading van de glomerulaire filtratie barrière, die uiteindelijk leidt tot voet proces geweest. PS-behandelde glomeruli hebben een opvallende daling nephrin (rood) en een aantal kernen positief voor WT1 (groen) via immunofluorescentie (Figuur 3A, B). De glomeruli kunnen ook worden bereid voor transmissie-elektronenmicroscopie (Figuur 3C). Controlemonsters hebben normale podocyte morfologie en voet van processen, overwegende dat de glomeruli PS-behandeld hebben voet proces geweest (Figuur 3D), dat is een teken van podocyte dysfunctie en in in-vivo modellen met behulp van de PS21wordt gezien. Dit kwam ook overeen met een afname van de nephrin gedetecteerd door immunoblotting (Figuur 3E, F).
Om te bepalen van levensvatbaarheid, werd gekloofd caspase-3 beoordeeld als een marker van apoptosis. Met behulp van immunofluorescentie, verschijnt gekloofd caspase-3 eerst in een paar cellen beginnen 2 h na isolatie (Figuur 4). Het aantal cellen uiten deze protease werd meer overvloedig na verloop van tijd, met de hoogste niveaus te zien op 24 en 48 uur. Dit suggereert dat apoptosis treedt relatief vroeg in cultuur en dat downstream toepassingen snel na isolatie voor de beste resultaten moeten worden uitgevoerd.
Figuur 1 . Typische uitstraling van rat glomerulaire culturen na isolatie. (A) helderveld beeld van glomerulaire cultuur. Hoewel we een veld waar in deze opname (pijlpunt) een enkele renale zaadvormende bestaat kozen, zijn de culturen die verkregen in het algemeen > 95% zuiver. Schaal bar is gelijk aan 100 µm. (B) uitgebreide beeld van een enkele glomerulus. (C) de haematoxyline en eosine vlek van een enkele glomerulus. Schaal bars in B en C gelijk 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Samenstellende celtypes worden bewaard in geïsoleerde glomeruli. Immunofluorescentie confocal microscopie werd uitgevoerd voor nephrin (rood, podocytes) en cel-specifieke markers te identificeren podocytes, mesangial cellen en het endotheel. (A) Costain voor nephrin en WT1 (groen, podocytes). (B) Costain voor nephrin en PDGFR-β (groen, mesangial cellen, pijl). (C) Costain voor nephrin en CD31 (groen, endotheliale cellen, schepen in dwarsdoorsnede gekenmerkt door pijlpunten). Schaal bar = 25 µm op alle panelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Podocyte letsel kunnen geïnduceerde in vitro met behulp van geïsoleerde rat glomeruli. (A) immunofluorescentie Confocal Microscopie voor nephrin en WT1 in een onbehandelde glomerulaire cultuur. Noteer de lineaire nephrin kleuring (rood) en de aanwezigheid van WT1-positieve kernen (groen), die meestal worden gezien wanneer er gezonde podocytes. (B) na tijdje lanthaansulfaat behandeling, nephrin expressie is gedaald en niet-lineaire en WT1 is afwezig, met vermelding van podocyte letsel. (C) Transmission electron microscpy (TEM) afbeelding weergegeven: voet processen, kelder membraan en een typisch voorbeeld van normale glomerulaire structuur fenêtré endotheel. Bar is gelijk aan 500 nm. (D) na tijdje sulfaat, voet processen worden langwerpige of gewist (pijlpunten), wat erop wijst podocyte letsel. Nephrin daalde (E) westelijke vlek voor nephrin tonen na tijdje sulfaat behandeling. (F) actine laden controle voor westelijke vlek wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen in geïsoleerde glomeruli. Immunofluorescentie confocal microscopie voor gekloofd caspase-3 (groen) werd uitgevoerd. Een co vlek van nephrin werd uitgevoerd om gemakkelijk vinden de glomeruli. Hoewel er geen gekloofd caspase-3 positiviteit op 0 en 1 h na de isolatie van de glomeruli was, werd fluorescentie signaal in een paar cellen opgemerkt bij 2 h. geleidelijk dat meer cellen positief werd hoe langer na isolatie die zij werden onderzocht. Het grootste aantal caspase-3 positieve cellen werden vermeld op 24 en 48 h. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit is een efficiënte methode voor het herstellen van de glomeruli van rat nier met behulp van goedkope, herbruikbare apparatuur met een eenvoudig protocol. Zoals bij alle ingrepen, zijn er beperkingen aan het nut ervan. Ten eerste, hoewel we > 95% zuiverheid krijgen, vanwege de zeven aard van het protocol en de grondstof is het onmogelijk om uit te sluiten alle verontreinigingen, en een paar rode bloedcellen en het occasionele tubulaire segment zullen aanwezig zijn in de cultuur. Wij verwachten niet dat deze kleine verontreinigingen worden een probleem voor de overgrote meerderheid van de aanvragen. Ten tweede het zeven protocol is gebaseerd op het gebruik van rat nieren, waarin de glomeruli veel groter dan bij muizen zijn. Als muis glomeruli nodig zijn, is een techniek die gebruik van commerciële magnetische kralen (bvDynabeads) gepubliceerd22geweest. Ten derde is gebleken dat specifieke mRNAs (plasminogen activator inhibitor-1 en collageen ik) in geïsoleerde glomeruli ontlenen bijna volledig Bowman van capsule in plaats van intraglomerular cellen23. Dit kan leiden tot verkeerde conclusies als mRNA geïsoleerd uit deze glomeruli wordt geprobeerd. Opgemerkt moet worden dat de meerderheid van de glomeruli in onze handen gepelde zijn en moet daarom gebrek aan significante bijdragen van Bowman capsules. Ten vierde, begint celdood optreden relatief snel onder de kweekomstandigheden.
We vonden dat de apoptotic programma, zoals blijkt uit de vormgeving van gekloofd caspase-3, was geactiveerd vanaf 2U voor cultuur. Dit is in het algemeen akkoord met vorige verslagen waaruit blijkt dat apoptosis, zoals beoordeeld door DNA fragmentatie TUNEL en histologische analyse, begint te gebeuren binnen 1-2 uur na isolatie24. Echter moet ook opgemerkt worden dat de vroege opmerkingen toonde dat metabole activiteit van geïsoleerde gezeefde glomeruli wanneer gekweekt voor ten minste 3 uur, suggereren aanzienlijke cellulaire levensvatbaarheid op deze timepoint16kon worden opgespoord. Wij vinden echter gebaseerd op de resultaten, dat zou het verstandig om gebruik te maken van geïsoleerde glomeruli onmiddellijk in beoogde experimenten voor de beste resultaten. Het is raadzaam dat alle experimenten worden uitgevoerd voordat 72 h, zoals we hebben gezien dat de gehele structuur van de glomerulaire begint te verslechteren buiten dat timepoint.
Het is veel gemakkelijker te verkrijgen van hogere opbrengsten bij het starten met 4-8 nieren in tegenstelling tot slechts 2 omdat een aantal van de glomeruli verloren als gevolg van naleving van de verschillende zeven, maar zodra de zeven zijn maximaal gecoat er geen extra verlies is. Om dezelfde reden is het belangrijk om de zeven weken in de BSA/PBS buffer vóór gebruik zoals glomeruli zijn meer kans te houden op een droge zeef, en beperken van weefsel blootstelling aan een van de randen van de zeef. Wij stellen voor beginnend met maar liefst 6 nieren (3 ratten) te verkrijgen van een redelijke opbrengst.
Sommige onderzoekers hebben de primaire podocyte culturen van geïsoleerde glomeruli die neigen te groeien van de glomeruli tijdens cultuur17geïsoleerd. Wij hebben gemerkt dat sommige geïsoleerde glomeruli zich aan de cultuur schotel plastic houden zal en dat cellen beginnen zal te migreren uit de glomerulaire structuur laat timepoints (72 uur na de isolatie). De studie van deze cellen valt buiten het bestek van dit protocol van de isolatie, en er is enige controverse over de vraag of deze cellen podocytes, pariëtale epitheliale cellen of beide15,25. Met name Mundel et al., hebben gemeld dat geplaveide cellen geoogst van gezeefde glomeruli kunnen worden opgewekt om te differentiëren in volwassen podocytes onder specifieke voorwaarden26kweken. Sommige van de verwarring met betrekking tot de identiteit van de cel kan afhangen van of de geïsoleerde glomeruli worden ingekapseld (met inbegrip van Bowman van capsule die wordt bevolkt door pariëtale epitheliale cellen) of Ontschaalde in de zeven procedure. In onze handen, met behulp van opeenvolgende zeef maten van 180, 90 en 75 µm geleid tot de meerderheid van de glomeruli wordt gepelde.
De meeste vormen van proteinuric chronische nierziekten zijn als gevolg van de stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit. Verschillende auteurs hebben geïsoleerd glomeruli in ex vivo permeabiliteit experimenten gebruikt. In één methode, werd de verandering in de glomerulaire volume na het veranderen van de osmotische inhoud van de omliggende media gebruikt om te schatten permeabiliteit27. Onlangs, werd vastgesteld dat lekkage van een fluorescente sonde van geïsoleerde glomeruli kon voor het meten van de permeabiliteit worden gekwantificeerd en in knaagdieren blootgesteld aan glomerulaire ziekte experimentele modellen28kon worden uitgevoerd.
We hebben gemerkt dat in het voorbereidingsproces van TEM, soms zien we de podocyte voet processen lift uit de kelder-membraan. Wij denken niet dat dit gebeurt in de cultuur en is meer waarschijnlijk een artefact tijdens de bereiding van de monsters van de TEM. Met name, zelfs wanneer dit gebeurt, is het duidelijk de voet processen "normaal" kijken of zijn gewist.
Globaal, is dit protocol biedt een methode waarmee een morfologische en cellulaire veranderingen in reactie op schade kan evalueren. Wij verwachten dat het kan worden gebruikt als een metgezel techniek om geïsoleerde podocyte culturen, met name bij interacties met de extracellulaire matrix of andere inheemse celtypes worden overwogen. Het houdt belofte voor het vergroten van kennis van proteinuric CKD, die het vermogen om toekomstige therapeutics voor deze slopende ziekte zou verbeteren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of Nefrologie Gottschalk Award, een universiteit van Pittsburgh Medical Center concurrerende medische Research Fund Award en een universiteit van Pittsburgh Artsen academische Foundation Award. Wij danken Gerard Apodaca voor zijn technische suggesties voor glomerulaire behoud voor histologische analyse, Mara Sullivan en Ming zon voor hulp bij elektronenmicroscopie, en Yingjian Li en Youhua Liu voor hun technische inbreng in dit protocol. Wij danken ook Cynthia St. Hilaire voor het antilichaam CD31.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
