Summary
Vi præsenterer her, en protokol for tre-dimensionelle kultur af patient-afledte glioblastom celler i retvinklet afstemmelige biomaterialer designet til at efterligne den hjerne matrix. Denne fremgangsmåde giver en in vitro-, eksperimentelle platform, der vedligeholder mange egenskaber i vivo glioblastom celler typisk tabt i kulturen.
Abstract
Glioblastom (GBM) er den mest almindelige, men mest dødbringende, centralnervesystemet kræft. I de seneste år, har mange undersøgelser fokuseret på hvordan den ekstracellulære matrix (ECM) af unikke hjernen miljø, såsom hyaluronsyre (HA), letter GBM progression og invasion. Men de fleste in vitro- kultur modeller omfatter GBM celler uden for rammerne af en ECM. Murine xenografts GBM celler anvendes almindeligt som godt. Men, i vivo modeller gør det vanskeligt at isolere bidrag fra individuelle funktioner af komplekse tumor mikromiljø til tumor adfærd. Her, beskriver vi en HA hydrogel-baseret, tre-dimensionelle (3D) kultur platform, der giver forskere til selvstændigt alter HA koncentration og stivhed. Høj molekylvægt HA og polyethylenglycol (PEG) omfatter hydrogels, som er crosslinked via Michael-type tilsætning i overværelse af levende celler. 3D hydrogel kulturer af patient-afledte GBM celler udstille levedygtighed og spredning satser så godt som eller bedre end, når kulturperler som standard gliomaspheres. Hydrogel system sætter også inkorporering af ECM-mimetiske peptider til at isolere effekten af specifik celle-ECM interaktioner. Hydrogels er optisk gennemsigtig, så levende celler kan være afbildet i 3D kultur. Endelig er HA hydrogel kulturer kompatibel med standardteknikker for molekylære og cellulære analyser, herunder PCR, Western blotting og cryosectioning efterfulgt af immunofluorescens farvning.
Introduction
Tre-dimensionelle (3D) kultur systemer sammenfatte interaktioner mellem cellerne og deres omgivende ekstracellulære matrix (ECM) i native væv bedre end deres todimensionale (2D) modparter1,2. Fremskridt i vævsmanipulering har givet avancerede, 3D kultur platforme, der aktiverer kontrollerede undersøgelser af 1) hvordan kemiske og fysiske komponenter af matrix mikromiljø påvirker celle adfærd og 2) virkning af nye terapeutiske strategier for en række sygdomme, herunder kræft2. Mens in vitro- modeller kan ikke højde for systemiske faktorer, såsom hormonforstyrrende og immun signaler, og dermed kan ikke helt erstatte i vivo modeller, giver de flere fordele, herunder reproducerbarhed, eksperimentelle kontrol, overkommelige priser og hastighed. Her, beskriver vi brugen af hjerne-mimetiske hydrogels i hvilke 3D kulturer af patient-afledte hjerne tumorceller fange mange aspekter af tumor fysiologi, navnlig dynamikken i erhverve behandling modstand3. I forhold til andre in vitro- metoder, repræsenterer disse kulturer bedre i vivo tumor modeller og kliniske observationer3.
Glioblastom (GBM) er den mest hyppige og dødelig kræft med oprindelse i hjernen, med en median overlevelse på kun 1-2 år4,5. I de seneste år, har mange undersøgelser fokuseret på indflydelse af tumor matrix miljø i GBM6,7,8. Unikke hjernen ECM er blevet rapporteret at påvirke GBM celle migration, spredning og terapeutiske modstand6,7,8,9,10,11 , 12. Hyaluronic syre (HA) er en rigelige glykosaminoglykan (GAG) i hjernen, hvor det interagerer med andre GAGs og proteoglycaner at danne en hydrogel-lignende mesh13. Mange undersøgelser har rapporteret HA overekspression i GBM tumorer og dens efterfølgende virkninger på kræft progression8,9,13,14,15,16 ,17. Andre ECM komponenter også påvirke GBM tumor vækst og invasion6,7,15,18. For eksempel, fibronektin, og vitronectin, som er typisk overexpressed i GBM, fremkalde heterodimerization celle langlinefartøjer integrin receptorer gennem binding til "M.H.T." sekvens og indlede komplekse signaling cascades, der fremmer tumor overlevelse19 ,20,21. Udover biokemiske påvirkninger påvirke fysiske egenskaber af matrixen væv også GBM progression22,23.
Løbende erhvervelse af modstand på terapier er en af de vigtigste drivkræfter bag GBM dødelighed4. Narkotika viser lovende resultater i 2D eller gliomasphere modeller har undladt i efterfølgende dyreforsøg og kliniske tilfælde3, som angiver, at virkningerne af microenvironmental faktorer bidraget betydeligt til GBM tumor svar1. Mens dyremodeller kan give en 3D, fysiologisk fald mikromiljø til xenografted patient celler og generere klinisk relevante resultater24,25, kompleksiteten af hjernen mikromiljø i vivo gør det udfordrende for at afgøre, hvilke funktioner, herunder celle-matrix interaktioner, er nøglen til specifikke biologiske resultater. Identifikation af nye terapeutiske mål vil drage fordel af brugen af forenklede kultur platforme som biokemiske og biofysiske egenskaber er defineret.
I modsætning til tidligere rapporteret biomateriale modeller af GBM tumor mikromiljø26,27 , som ikke har opnået ægte ortogonale kontrol over individuelle biokemiske og fysiske funktioner af ECM, biomateriale platform rapporteret her giver afkoblingen af bidragene fra flere uafhængige funktioner til GBM celle fænotype. Her præsenterer vi en HA-baseret, retvinklet afstemmelige, hydrogel system for 3D kultur af patient-afledte GBM celler. Hydrogels er dannet af to polymer komponenter: 1) biologisk aktive HA og 2) biologisk inaktivt polyethylenglycol (PEG). PIND er en udbredt biokompatible og hydrofile materiale med lav protein adsorption og minimal immunogenicitet28. Her, er ca. 5% af glucuronsyre syre fraspaltning på HA kæder functionalized med thiol grupper at aktivere crosslinking til et kommercielt tilgængelige 4-arm-PIND blev afsluttet med maleimides via Michael-type tilsætning. I sin mest almindelige form i kroppen findes HA i høj molekylvægt (HMW) kæder. Her, en lav grad af modifikation af HMW HA (500-750 kDa) hjælper med at bevare indfødte vekselvirkninger mellem HA og dets cellereceptorer, herunder CD4429. Ved at erstatte PIND-thiol for HA-thiol samtidig opretholde et konstant molære forhold på samlede dithioler til maleimides, kan HA koncentration være afkoblet fra mekaniske egenskaber af de resulterende hydrogels. Støkiometriske kontrolelementer kan desuden bruges til at konjugat cystein-afsluttet peptider til en defineret gennemsnitlige antal maleimide-afsluttet arme på hver 4-arm-PIND. Indarbejdelse af ECM-afledte, selvklæbende peptider muliggør interaktion med integriner på kulturperler celler, hvorigennem biokemiske og kemiske signaler er transduced1. Maleimide-thiol tilføjelse forekommer meget hurtigt under fysiologiske tilstande, minimere den tid, der kræves for celle indkapsling og maksimere overlevelse af patient-afledte celler. Derudover hydrogel kulturer kan blive behandlet som typisk væv modellen og er kompatibel med standard karakterisering teknikker herunder Western blotting, flowcytometri og immunfluorescens farvning. Følgende protokol beskriver procedurerne for opdigte hydrogels, oprettelse af 3D kulturer af patient-afledte GBM celler og teknikker til biokemiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menneskelige væv samling trin blev gennemført under institutionelt godkendte protokoller.
1. Thiolation af hyaluronsyre
Bemærk: Molære forhold er angivet med hensyn til antallet af carboxylat grupper, medmindre andet er angivet.
- Opløse 500 mg natrium hyaluronate (HA, 500-750 kDa) på 10 mg/mL deioniseret vand, destilleret vand (DiH2O) i autoklave steriliseret, 250 mL Erlenmeyer-kolbe. Rør løsningen (~ 200 rpm) ved stuetemperatur i 2 timer til fuldt opløses HA. Bruge en røre bar og magnetiske rør plade til at holde reaktion omrøring under thiolation procedure.
- Ved hjælp af 0,1 M saltsyre (HCl), justere pH 5,5 HA løsningen. Der afvejes 69,6 mg (0,25 x molære forhold) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
Bemærk: Selvom uopløst EDC kan føjes direkte til HA løsning, det er typisk nemmere at opløse EDC først i 1 mL DiH2O og derefter hurtigt tilføje EDC løsning til HA-løsning. Før opløsning i 1 mL af DiH2O kan også gøres med N-hydroxysuccinimide (NHS) og cystamine dihydrocholoride før du tilføjer til reaktion i trin 1.3 og 1.4. - Tilføje 17,9 mg (0,125 x molære forhold) af NHS til reaktionen. PH-værdien af reaktion løsningen til 5,5 ved hjælp af 0,1 M HCl og inkuberes reaktion ved stuetemperatur i 45 minutter.
- Tilføje 70.0 mg (0,25 x molære forhold) af cystamine dihydrochlorid oploesningen reaktion. Brug 0,1 M natriumhydroxid (NaOH) til at justere pH til 6.25. Inkuber reaktion ved rumtemperatur natten under omrøring.
- Den følgende dag, skal du bruge 1 M NaOH til at justere pH i opløsningen reaktion til omkring 8. Tilføje 192 mg (4 x molære forhold) af dithiothreitol (DTT) til reaktionen. PH-værdien tilbage til 8 efter tilsætning af DTT og forlade omrøring i 1-2 timer ved stuetemperatur.
- Brug 1 M HCl til at justere pH til 4. Overføre den hele reaktionsblandingen til pre gennemblødt dialyse membran (molekylvægt cut-off omkring 13 kDa) og dialyze mod DiH2O forud indstillet til pH 4.
Bemærk: Lydstyrken på DiH2O for dialyse skal være mindst 40 gange mængden af monomers HA løsningen (fx 50 mL prøve i 2 L af DiH2O, pH 4). - Erstatte dialyse løsning (DiH2O, pH 4) to gange dagligt i 3 dage ved stuetemperatur.
- Filtrere den dialyzed løsning gennem et 0,22 µm membran, vakuum-drevet filter. Flash fryse løsning af thiolated HA i flydende kvælstof. Bruge en lyophilizer til at fryse tørre prøver over 2 dage. Thiolated HA i tør form kan opbevares i et vakuum-forseglet ekssikkator ved-20 ° C i mindst 6 måneder.
- For at bestemme graden af thiolation, bruge Ellman's test og/eller proton NMR spektroskopi30,31.
2. forberedelse af Crosslinking materialer
- Opløs thiolated HA i den ønskede koncentration (i dette eksempel, 13,3 mg/mL) i HEPES-bufferet saltvand (20 mM HEPES i Hanks afbalanceret salt saltvand (HBSS) buffer, justeret for at falde inden for en pH-værdi på 8-9) i en rav hætteglas at minimere eksponering for omgivende lys. Holde den løsning under konstant omrøring.
Bemærk: Dannelsen af svovlbroer mellem dithioler konjugeret til HA kan opstå, hvis pH er over 8, opløsningens koncentration er for høj eller løsningen er venstre omrøring længe før gellation. For at undgå dette problem skal bruge under 15 mg/mL af thiolated HA og opløses thiolated HA indenfor 2 timer med at danne hydrogels. - 4-arm-PIND-maleimide (PIND-Mal, 20 kDa) og 4-arm-PIND-thiol (PIND-thiol, 20 kDa) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,4, at forberede 50 mg/mL PIND-Mal og PLØK-thiol stamopløsninger opløses.
Bemærk: Det tager mindst 1 time til fuldt opløses PIND reagenser. - Hvis du tilføjer ECM-afledte peptider, opløse cystein-indeholder peptider i PBS til at forberede en stamopløsning.
Bemærk: Brug en stock koncentration af 2-4 mM. - Blød silikonegummi forme i ethanol til mindst 20 min at rense dem og derefter autoklave dem for sterilisation.
3. Hydrogel Crosslinking og celle indkapsling
Bemærk: som et eksempel her, indkapsling af fire enkelte, 80 µL hydrogels med 0,5% (w/v) HA og trykstyrke modulus af 1 kPa er beskrevet3. Se tabel 1 for eksempel opskrifter, der giver hydrogels med varierende egenskaber: to hydrogels indarbejde integrin-bindende peptid M.H.T. og to hydrogels indeholder cystein caps som en negativ kontrol for peptid aktivitet. Såning koncentration af patient-afledte GBM celler er 500.000 celler/mL.
- Fortynd PIND-Mal stamopløsning (50 mg/mL, fra trin 2.2) til 12,5 mg/mL ved at tilføje 40 µL af stamopløsningen 120 µL PBS. Opdele den fortyndede løsning i to 1,5 mL microcentrifuge rør, således at hver tube har 80 µL.
- Tilføje 16 µL af stock M.H.T. løsning (2,8 mM, fra trin 2.3) til et rør og 16 µL af stock cystein løsning (2,8 mM, fra trin 2.3) til det andet rør. Vortex at blande. Placere PIND-Mal-M.H.T. eller PIND-Mal-CYS løsningerne på is indtil brug taktfast 3.9.
Bemærk: Proceduren som beskrevet her udbytter hydrogels med ~ 140 µM af peptid. Dette svarer til ca. 1 ud af hver 8 tilgængelige PIND arme bliver besat med en peptid. Dette kan varieres ved at ændre den molære forhold af cystein-afsluttet peptider til rådighed maleimide grupper. Generelt opnår en maksimal koncentration af 280 µM af peptid mens stadig tilstrækkeligt antal maleimide grupper tilgængelige for hydrogel crosslinking. - Fortynd PIND-thiol stamopløsning (50 mg/mL, fra trin 2.2) til 5 mg/mL ved at blande 4 µL af 50 mg/mL stamopløsning med 36 µL af PBS. Tilsæt 120 µL af opløst, thiolated HA fra trin 2.1 til blandingen.
Bemærk: Løsninger HMW ha er meget tyktflydende. Dermed, vi anbefaler at bruge wide-blænde mikropipette tip til transfer løsninger. Pipette langsomt at undgå løsning holder sig til væggene i mikropipette tip og forbedre målenøjagtighed. - Placer de rene, tørre skimmelsvampe (udarbejdet i trin 2.4) i hver brønd af et væv kultur behandlede 12-godt plade. Bruger den ren, stumpe ende af en pipette tip, tryk på gel mug og dobbelttjekke forsegling mellem forme og bunden af godt plade.
Bemærk: Kontroller sæl igen lige før indkapsling at forhindre lækage. - Passage kulturperler GBM celler, tage afstand til enkelt celler og bestemme celle koncentration som tidligere beskrevet3.
Bemærk: Nogle GBM linjer kan ikke adskilles til enkelt celler. I dette tilfælde kan være indkapslet hele gliomaspheres. Imidlertid forberede dissocierede enkelt celler efter præcise celle tælle for at forbedre reproducerbarhed. Protokol for gliomasphere passaging varierer blandt forskellige labs og mange af disse er sandsynligvis kompatibel med hydrogel indkapsling.- (Anbefales) Centrifuge gliomaspheres på 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og tilsættes 1 mL af celle dissociation enzym til celle pellet. Derefter inkuberes i 5 min, forsigtigt trykke tube at agitere.
- Der tilsættes 4 mL komplet næringssubstratet (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL heparin, G21 supplement og 1% penicillin/streptomycin i DMEM/F12) til cellerne.
- Centrifugeres igen ved 500 x g i 5 min og Fjern supernatanten. Endelig, celle resuspenderes i 1 mL af den fuldstændige medium og passere suspenderede celler gennem en 70 µm celle si. (Anbefalede) vask si med en yderligere 4 mL af den fuldstændige medium at maksimere antallet af celler inddrevet.
- Skøn af den koncentration af celler i suspension ved hjælp af en hemocytometer. Opdele cellesuspension til 2 centrifugeglas, hvor hver tube indeholder ~ 80.000 celler. Der centrifugeres 500 g ved x for 5 min; generelt, vil 80.000 celler udgør 2 80 µL hydrogels.
- Fjern supernatanten og resuspend en pellet i 80 µL af PEG-MAL-M.H.T. løsning og en anden pellet i 80 µL af PEG-MAL-CYS løsning (udarbejdet i trin 3.1).
- Bruge en 200 µL, wide-åbning mikropipette tip, dispensere 40 µL af HA løsning (fra trin 3.3 ovenfor) i hver gummi silikone mug (som udarbejdet i trin 3.4).
- Bruge en 200 µL, wide-åbning mikropipette tip, Bland de 40 µL af PEG-MAL-CYS eller PIND-MAL-M.H.T. celle løsning med HA løsning i formen. Pipetteres op og ned hurtigt ikke mere end 10 gange. Gentag for hver gel kultur ved at blive udarbejdet.
Bemærk: Dette trin tager praksis, idet første gellation sker hurtigt (inden for 30 s). Pipetteres op og ned mens du flytter tip til forskellige steder i forme til at sikre, at selv blande. Altid holde spidsen under flydende niveau at undgå dannelsen af luftbobler. Må ikke blandes løsningen for mange gange som gel kan få dannet inde mikropipette tip. PIND-MAL-CYS og PLØK-MAL-M.H.T. kan kombineres på forskellige forhold for at opnå den ønskede M.H.T. peptid koncentration. - Placer godt-pladen som indeholder gel-indkapslede celler i et 37 ° C celle kultur inkubator i 5-10 minutter for at sikre færdiggørelse af reaktionen.
- Tilsæt 2-2,5 mL af næringssubstratet til hver brønd med dannede geler. Bruge en steril, 2 µL pipette tip eller mikro-spatel, blidt adskille mug og gel. Bruge steriliseret pincet til at fjerne støber fra godt pladen. Placer den godt plade tilbage til cellen inkubator (37 ° C og 5% CO2) for kultur og fremtidige eksperimenter.
Bemærk: Træk skimmel lodret opad for at undgå at skade gel kulturer. Generelt er bør medium i gel kulturer udskiftes hver 3-4 dage. Passe på ikke for at Aspirér hydrogels, når du fjerner medium. Hvis det er et spørgsmål, anbefaler vi at bruge en plastik overførsel pipette. Hvis bioluminescens imaging for at spore celle nummer er planlagt, skal GBM celler være transduced med lentivirus kodning constitutively luciferase udtryk før indkapsling, som tidligere beskrevet3. Bioluminescens imaging, tilføje 1 mM af D-luciferin til næringssubstratet 1 h før luminescence billeddannelse.
4. lysate forberedelse til Western Blotting
- Chill 1,5 mL microcentrifuge rør på is (1 pr. gel prøver). Cool centrifuge til 4 ° C.
- Fjerne medium fra godt plader. Overføre geler i prechilled microcentrifuge rør.
- Tilsæt 100 µL af RIPA buffer med 1 x protease/fosfatase hæmmere.
- Ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 20 G kanyle, bryde op gel ved at skubbe hele blandingen gennem nålen mindst 20 gange.
- Flash spin prøven ved hjælp af bænken øverste microcentrifuge og sted prøven tilbage på isen.
- Vortex prøver kortvarigt hvert 5 min i alt af 20 min.
- Centrifuge prøver på 14000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten til nye, pre kølet microcentrifuge rør og opbevares ved-20 ° C (kort sigt) eller og-80 ° C (lang sigt). Udføre gelelektroforese ved hjælp af standard procedurer, som tidligere beskrevet3.
5. udvinding af enkelt celler fra Hydrogel kulturer til flowcytometri
- Fjerne medium og overførsel gel kultur (fra trin 3.11) i en 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Inkuber gel med 500 µL af celle dissociation enzym (f.eks. TrypLE Express) ved 37 ° C i 5 min, lejlighedsvis svippede tube at agitere.
- Overfør blandingen i et 50 mL-centrifugerør med 5 mL af komplet medium. Røret anbringes på is.
- Vedhæfte en 20G nål på en 10 mL sprøjte. Forsigtigt trække cellesuspension op og ned gennem nålen 8 gange.
- Flow blandingen gennem 70 µm celle si i en ny 50 mL-centrifugerør. Anvende en yderligere 5 mL af komplette mellemstore gennem si til at indsamle de resterende celler.
- Der centrifugeres prøve på 400 x g for 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i ønskede buffer til flowcytometri (bruger standardprotokoller3).
6. kryopræservering af Hydrogels for skæring
- Fjerne medium fra gel kulturer (fra trin 3.11).
- Inkuber gel kulturer med 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved 4 ° C natten over.
Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres forsigtigt. - Den næste dag, fjerne PFA. Tilsættes 2 mL 5% saccharose i PBS til geler og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Erstatte 5% rørsukkeropløsning med 2 mL 20% saccharose i PBS og inkuberes i 30 min.
- Erstatte rørsukkeropløsning med 2 mL frisk 20% saccharose i PBS og inkuberes i en yderligere 30 min.
- For tredje gang, skal du erstatte rørsukkeropløsning med 2 mL frisk 20% saccharose i PBS. Der inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Forberede 20% saccharose i Optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte.
Bemærk: På grund af viskositet i OLT, opløsning af saccharose kan tage nogle tid (op til natten). Vi anbefaler at sætte blandingen på en shaker i løbet opløsning til at opretholde agitation. - Den næste dag, fjerne 20% rørsukkeropløsning og forsigtigt hæld 20% saccharose i OCT løsning over gelen. Sørg for at dække det hele gel. Der inkuberes ved 4 ° C til 3 h.
- Overføre gel ind i midten af en indlejring skimmel ved hjælp af en stor, flad spatel; Dette skal gøres omhyggeligt for at undgå at beskadige gel.
- Køligt 2-methylbutane inde i kammeret med et overskud af tøris.
- Fyld formen indlejring med ren OCT (ingen saccharose). Fyld til lige under øverste kant af mug.
- Fryse hydrogel prøven ved nedsænkning i luftkølet 2-methylbutane og derefter gå videre til skæring.
- Afsnit prøven ved hjælp af en kryostaten; snittykkelse på 10-18 µm og skære temperatur omkring-26 ° c er anbefalet.
- Udføre standard immunfarvning procedurer på sektioneret gel kultur, som tidligere beskrevet3.
Bemærk: PFA er kendt lokalirriterende og kræftfremkaldende. Håndtere og bortskaffe PFA ifølge lokalt gældende standarder og forskrifter.
7. total RNA udvinding fra prøver i Hydrogel
Bemærk: Her, vi beskriver en protokol, ved hjælp af en kommerciel kit (se tabel materialer) for at udtrække total RNA fra hydrogel kulturperler celler. Bufferne og alt materiale er tilgængelige i sættet bruges.
- Fjerne næringssubstratet. Bruge P1000 overførsel pipette med wide-bore tip til at overføre hydrogel kultur ind i 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Tilføje 350 µL af buffer RLT hydrogel kultur.
- Ved hjælp af en 20 G kanyle tilknyttes en 1 mL sprøjte, sønderdele gel ved at skubbe hele blandingen gennem nålen mindst 20 gange.
- Overføre hele blandingen i en homogeniseringsapparat kolonne placeret i et 2 mL collection tube. Der centrifugeres ved 13.000 x g i 2 min.
- Overføre supernatanten ind i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør. Pas på ikke at forstyrre gel bundfaldet i bunden.
- Lysate proeven blandes med 350 µL af 100% ethanol. Overføre alle prøven til et spin kolonne (fra kit) sted i et 2 mL collection tube. Der centrifugeres i 1 min på 13.000 x g.
- For efterfølgende trin for RNA oprensning for PCR, Følg den generelle protokol kit producenten.
Bemærk: Når RNA er udvundet, standardprotokoller til PCR kan anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For hvert parti af thiolated HA, bør graden af thiolation kontrolleres ved hjælp af H1-NMR eller en Ellman test. HA ændring ved hjælp af proceduren beskrevet her konsekvent genererer ~ 5% thiolation (defineret som den molære forhold af dithioler at HA disaccharider) (figur 1).
Opsætning af denne nye kultur platform vil kræve hvert laboratorium til at udføre strenge test for at sikre god kultur levedygtighed forud for gennemførelsen af storstilede eksperimenter. Vores 80 µL hydrogels med en seeding tæthed 500.000 celler/mL (40.000 celler/gel) resultere konsekvent i spredning satser, der er sammenlignelig med eller bedre end gliomasphere kulturer (figur 2A-2 C). Som HA/PIND kan hydrogels er optisk gennemsigtige, celle adfærd observeres direkte i live, 3D kulturer ved hjælp af fase kontrast eller Fluorescens mikroskopi. Figur 3A , viser, at 4 dage efter indkapsling, GBM celler i M.H.T.-holdige hydrogels udviser en invasiv fænotype, mens celler dyrkes i hydrogel med PIND-MAL-CYS kontrol har en sfærisk morfologi.
Som det er typisk med xenograft modeller hvor forskere skal vente i dage til måneder indtil implanterede tumorer når progressive vækst24,32, tage patient-afledte celler også tid at tilpasse sig en ny kultur miljø. Dermed, vi anbefaler dyrkning 4-8 dage før påbegyndelse af eksperimenter, såsom narkotikabehandling, at sikre, at de fleste celler har indtastet den eksponentielle vækstfase. Ud over lægemiddelsbehandlinger, kan reagenser som opløselige cyclo-M.H.T., som konkurrencedygtige forstyrrer celle interaktioner med M.H.T. i hydrogels, føjes til næringssubstratet (figur 3A).
Vores hydrogel systemet er kompatibelt med mange fælles metoder til undersøgelse af gliom cellebiologi. Ved hjælp af bioluminescens billeddannelse, som er almindeligt anvendt til at overvåge gnaver xenograft tumorer, kan relative antal levedygtige celler observeres i hydrogel kulturer i løbet af behandlingen. Figur 3B giver et eksempel på denne metode, hvor virkningerne af erlotinib behandling på hydrogel-kulturperler GBM celler blev evalueret over 6 dage. Generelt kan hydrogel kulturer behandles som vævsprøver, når du forbereder lysates for vestlige skamplet eller PCR. Western blot analyse af kløvet poly ADP polymerase angiver, at relative grad af apoptose i behandlede CD44 knockdown celler er højere end vildtype GBM celler dyrkes i 0,5% HA hydrogels ()figur 3 c). På samme måde kan enkelt celle suspensioner tilberedes fra hydrogel kulturer for analyse via flowcytometri bruger standardprotokoller til befriende enkelt celler fra intakt væv (figur 2). Ud over celle funktioner bevare snit af hydrogel-baseret, 3D kulturer frosset organmateriale ECM deponeret af dyrkede celler. For eksempel, deposition mønstre af type IV kollagen skift på erlotinib behandling af hydrogel kulturer (figur 3D).
Figur 1 : Repræsentant H 1 -NMR spektret af thiolated hyaluronsyre. Integreret toppene angiver, at ca. 5% af HA glucuronsyre syre grupper er blevet ændret med en thiol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Spredning af hydrogel-indkapslede celler. A) eksempler på billeder af opdigtede 80 µL geler i 12-godt plader. Efter crosslinking, blev hydrogels hævet i cellekulturmedium. B) repræsentative resultater af spredning sats målt ved hjælp af flowcytometri. GBM celler (HK301) blev inkuberet med 1 µM EdU (5-ethynyl-2 '-deoxyuridine) for 2,5 h på den fjerde dag efter indkapsling eller passaging. Et klik-reaktion blev brugt til konjugat fluorescerende farvestof til indarbejdet EdU, som nærmere beskrevet i Xiao et al. 2017.3 negative kontroller, hvor ingen EdU blev føjet til kulturer, blev medtaget. C) repræsentant konfokalmikroskopi billeder af live (grøn) og døde (rød) celler 24 timer efter hydrogel kulturer af GBM celler (HK157) blev etableret. Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Karakterisering. A) repræsentative fase kontrast billeder af 0,5% (w/v) HA hydrogel-kulturperler celler under varierende forhold for 8 dage efter indkapsling. Pilene angiver celler med en invasiv morfologi. B) repræsentative billeder af bioluminescens signal målt efter 15 dage efter behandling med 1 µM erlotinib eller køretøj (DMSO). 1 mM D-luciferin blev tilføjet til cellekulturmedium 1 h før billeddannelse. Celler var transduced med lentivirus kodning for konstituerende udtryk af firefly luciferase før indkapsling. C) repræsentant immun-skamplet billeder analysere kløvet poly ADP polymerase (cl-PARP) udtryk i GBM celler (HK301) kulturperler i hydrogels med 0,5% (w/v) HA og 1 kPa trykstyrke modulus. Alle beskårne billeder vist var fra den samme skamplet. D) repræsentative farvning af kollagen IV (grøn) og Hoechst 33342 (blå) i hydrogel-kulturperler HK301 celler 12 dage efter behandling med 1 µm erlotinib eller køretøj (DMSO). Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gel Type | Del en (40 µL hver) | Del B (40 µL) | ||||
| 4Arm-PIND-MAL (50mg/mL) | Cystein eller M.H.T. (2,81 mM) | PBS (pH 7,4) | 4Arm-PIND-thiol (50mg/mL) | PBS (pH 7,4) | HA-S (13,3 mg/mL) | |
| 0,5% (w/v) HA 1kPa | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 1,00 ΜL | 9.00 ΜL | 30,0 ΜL |
| 0,5% (w/v) HA 2kPa | 20,0 ΜL | 4.00 ΜL | 16,0 ΜL | 8.00 ΜL | 2.00 ΜL | 30,0 ΜL |
| 0,1% (w/v) HA 1kPa | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 8.00 ΜL | 26.0 ΜL | 6.00 ΜL |
Tabel 1. Hydrogel formuleringer giver uafhængig kontrol af HA koncentration og mekaniske egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generation af reproducerbare data ved hjælp af denne 3D kultur system kræver: 1) konsekvent batch til batch thiolation ha, 2) praksis til at opnå effektiv blanding af hydrogel prækursorer og håndtering af hydrogel kulturer for at forhindre skader og 3) optimeret såning tæthed for hver cellelinje bruges.
Når en bestemt vægt procentdel af HA ønskes i hydrogel, bestemmer graden af thiolation ha bitmapgenkendelse tæthed. Vi anbefaler at bruge en konsekvent mængde af HA for hver enkelt thiolation reaktion for at minimere batch til batch variationer. Vi foreslår at mindst 300 mg ha bruges for hver enkelt thiolation reaktion, så det samme parti af thiolated HA kan bruges til flere eksperimentelle gentagelser. Kindtand forholdet mellem dithioler maleimide grupper på 4-arm PIND bør altid være 1.1:1 til at sikre maksimal crosslinking effektivitet. Således, hvis graden af thiolation er varieret, så mængden af PEG-Mal tilføjet skal justeres i overensstemmelse hermed. Når peptider er konjugeret til maleimides før gel dannelse, skal den anslåede antal PIND arme med tøjret peptider der fratrækkes det samlede antal tilgængelige maleimides for denne beregning. Derudover anbefales det, at holde graden af HA thiolation under 10-15% til at undgå disulfid obligation formation, som vil forhindre opløsningen og sammenhængende gellation.
Michael-type tilføjelse reaktion mellem grupperne thiol og maleimide sikrer, at gellation opstår i under et minut. Mens denne hurtige gellation minimerer mængden af tid celler suspenderet i hydrogel prækursorer er uden komplet medium, der kan kompromittere deres levedygtighed, kræver indkapsling proces erfaring med alle pipettering og blande skridt til at opnå reproducerbare resultater. Vi har typisk nye praktikanter praksis flere runder af gellation uden celler før du udfører "rigtige" indkapsling eksperimenter.
To faktorer kan finjusteres til at modulere gellation hastighed: reaktion temperatur og forløber pH. Sænke reaktion temperatur ved at placere det godt plade på is mens blanding bremser reaktionen og giver mere tid til at blande forløber løsninger. Dette skal dog ske under sterile forhold ved hjælp af ordentlig aseptisk teknik. PH i forløber løsninger kan ligeledes ændres for at forøge eller formindske reaktionstid ved hjælp af højere eller lavere pH, henholdsvis. Da thiolated HA er dialysebehandling mod surt vand til at forhindre disulfid obligation dannelse, vil rekonstitueret thiolated HA give lavere pH end man ellers kunne forvente. I almindelighed, rekonstituering i 20 mM HEPES i HBSS buffer, indstillet til pH 9, vil give en pH nær 7 når 15 mg/mL af thiolated HA (~ 5% thiolated) er opløst. Vi anbefaler at bruge pH 6,8-7 thiolated HA løsning at selv blande i gelopløsning mens maksimering celle sundhed.
Såning tæthed under indkapsling er kritisk for cellulære levedygtighed og eksperimenterende reproducerbarhed. Vi anbefaler såning i intervallet 100.000 til 2.000.000 celler/mL. Vi har fundet, at dette udvalg er optimal for levedygtigheden af de fleste celletyper samtidig forhindre over-confluency inden for en eksperimentel tidsramme på mindst 3 uger. Den indledende seeding tæthed, der optimerer levedygtighed bør bestemmes eksperimentelt for hver celletype anvendes.
Ekstrem omhu bør tages ved ændring af celle medium for at undgå skadelige hydrogel kulturer. Især passe på ikke for at Aspirér hydrogel til en pipette. Således ikke bruge vakuum aspiration og i stedet bruge en steril overførsel pipette til Aspirér manuelt. Ændre kun halv medium i en kultur vel på et tidspunkt kan også hjælpe.
Generelt kræver denne teknik praksis at opnå det nødvendige håndelag og konsistens. Når en lab-specifik protokol er etableret, 3D kultur-systemet gør det muligt for forskeren bruge mange karakterisering metoder som typisk for cellekultur og eksplanterede væv. Her har vi beskrevet flere teknikker til analyse, herunder immunofluorescens, flowcytometri, western blotting og bioluminescens billeddannelse af levende, 3D kulturer (figur 2-3). For mere detaljerede protokoller af karakterisering metoder, se venligst Xiao et al. 20173. Endelig, som HA/PIND hydrogels optisk gennemsigtig, standard lysmikroskopi teknikker, herunder Konfokal imaging, kan bruges til at overvåge live, 3D kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet med midler fra NIH (R21NS093199) og UCLA ARC 3R Award. Vores hjerteligste tak går til laboratoriet af Dr. Harley Kornblum til bestemmelse af HK301 og HK157 cellelinjer. Vi takker også UCLA væv patologi Core Laboratory (TPCL) for cryosectioning, avanceret lys mikroskopi/spektroskopi core facilitet (ALMS) i Californien nanosystemer Institute (CNSI) på UCLA for brug af en Konfokal mikroskop, UCLA Crump Institut for Molekylær billeddannelse til at bruge IVIS billedbehandlingssystem, UCLA molekylære Instrumentation Center (MIC) for at give Kernemagnetisk resonans-spektroskopi, og Flow flowcytometri kerne i Jonsson omfattende Cancer Center (JCCC) på UCLA for at levere instrumenterne til flow flowcytometri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Holland, E. C.
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
- Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
- Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
- Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
- Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H.
- Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
- Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
- Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
- Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
- Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
- Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
- Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
- Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
- Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
- Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
- Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
- Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).
