Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच./शिगेला एसपीपी.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

साल्मोनेला एसपीपी./शिगेला एसपीपी. आम रोगज़नक़ों दस्त के लिए जिंमेदार ठहराया है । यहां, हम साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच का वर्णन ।/शिगेला एसपीपी. निर्देशित संस्कृति के साथ संयुक्त वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करना ।

Abstract

मल-मौखिक संचरण तीव्र आंत्रशोथ का समय-समय पर होता है, खासकर जब लोग जो भोजन और पानी संभाला साल्मोनेला एसपीपी./Shigella एसपीपी द्वारा संक्रमित हैं । साल्मोनेला एसपीपी./Shigella एसपीपी. का पता लगाने के लिए स्वर्ण मानक विधि प्रत्यक्ष संस्कृति है, लेकिन यह श्रम प्रधान और समय लेने वाली है । यहां, हम साल्मोनेला एसपीपी./Shigella एसपीपी. स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच का वर्णन, निर्देशित संस्कृति के साथ संयुक्त वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) का उपयोग कर । वहां दो प्रमुख चरणों: वास्तविक समय पीसीआर और निर्देशित संस्कृति हैं । नमूना संग्रह, पूर्व संवर्धन, डीएनए निष्कर्षण और वास्तविक समय पीसीआर: पहले चरण (रीयल-टाइम पीसीआर) के लिए, हम विधि के प्रत्येक कदम की व्याख्या । यदि वास्तविक समय पीसीआर परिणाम सकारात्मक है, तो दूसरा चरण (निर्देशित संस्कृति) किया जाता है: चयनात्मक संस्कृति, जैव रासायनिक पहचान और सीरम वैज्ञानिक लक्षण वर्णन । हम इसे से उत्पंन प्रतिनिधि परिणामों को भी वर्णन करते हैं । यहां वर्णित प्रोटोकॉल साल्मोनेला एसपीपी की तीव्र, विशिष्ट, संवेदनशील और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए एक मूल्यवान मंच होगा ।/शिगेला एसपीपी.

Introduction

दस्त अभी भी एक उच्च घटना दर दुनिया भर में1,2के साथ एक आम स्वास्थ्य समस्या है । हालांकि मृत्यु दर अपेक्षाकृत कम है, कुछ रोगियों (जैसे ढीले और पानी मल, बाथरूम में जाने के लिए एक तात्कालिकता) है, जो सामाजिक प्रभाव बहुत उच्च3,4बनाने के लिए सप्ताह के लिए विभिन्न लक्षण दिखाते हैं । अधिक गंभीरता से, कुछ रोगियों को भी चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम विकसित हो सकता है अगर अनुपचारित5छोड़ दिया है । वहां बैक्टीरिया, वायरस और परजीवी है कि6दस्त पैदा कर सकता है के विभिंन प्रकार हैं । साल्मोनेला एसपीपी./शिगेला एसपीपी. तीव्र आंत्रशोथ7,8,9,10,11के संचरण के लिए सबसे आम बैक्टीरिया के बीच में हैं । इसलिए, कई काउंटियों को नियमित साल्मोनेला एसपीपी के लिए कानून या विनियम जारी किए गए हैं./शिगेला एसपीपी. जो लोग भोजन और पानी संभाल जाएगा के बीच स्क्रीनिंग । उदाहरण के लिए, चीनी सरकार ने अनिवार्य साल्मोनेला एसपीपी के लिए कानून जारी किए हैं ।/शिगेला एसपीपी. स्क्रीनिंग साल में एक बार ।

साल्मोनेला एसपीपी के लिए स्वर्ण मानक पद्धति./शिगेला एसपीपी. डिटेक्शन बैक्टीरिया कल्चर है । बैक्टीरिया संस्कृति और लगातार जैव रासायनिक पहचान और सीरम वैज्ञानिक लक्षण वर्णन के माध्यम से, हम बैक्टीरिया की प्रजातियों की पहचान कर सकते हैं, जो रोगियों के उपचार के लिए सहायता के लिए रोग प्रकोप प्रबंधन और रोगाणुरोधी रूपरेखा की सुविधा सकता है 12. यह भी साल्मोनेला एसपीपी के दौरान संक्रमण के स्रोत का पता लगाने में मदद कर सकता है ।/शिगेला एसपीपी. प्रकोप13. हालांकि, इस विधि श्रम गहन है (मैनुअल आपरेशन की आवश्यकता होती है) और समय लेने वाली (कई दिन लेने), विशेष रूप से नमूनों की बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए7. इसके अलावा, व्यवहार्य लेकिन गैर culturable (VBNC) साल्मोनेला एसपीपी./शिगेला एसपीपीकुछ स्टूल नमूने 14 में मौजूद हो सकताहै । इन कमियों को ध्यान में रखते हुए कई प्रयोगशालाओं ने साल्मोनेला एसपीपी का पता लगाने के लिए नई तकनीक विकसित करने की कोशिश की है ।/शिगेला एसपीपी.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. इन सभी पद्धतियों में नाभिकीय अम्ल प्रवर्धन परीक्षण (NAAT) का प्रयोग होता है, जिसके बीच में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) सबसे आम है । इन NAAT आधारित तरीकों में से एक प्रमुख सीमा है कि मृत बैक्टीरिया, भी बैक्टीरियल अपूर्ण जीनोमिक डीएनए युक्त मलबे, सकारात्मक परिणाम26दिखा सकता है, जो काफी हद तक रोग के सही निदान को प्रभावित कर सकता है । Blanco एट अल. ने दिखाया है कि आणविक परख अत्यधिक संवेदनशील है, न केवल संस्कृतियों में व्यवहार्य साल्मोनेला के लिए, लेकिन यह भी आंशिक जीनोम और मृत या व्यवहार्य बैक्टीरिया को पिछले संक्रमण या26प्रदूषण से । इसलिए नई तकनीक विकसित की जानी चाहिए ।

यहाँ, हम एक उपंयास विधि है कि NAAT आधारित विधि और संवर्धन को जोड़ती है वर्णित है । जैसा चित्र 1में दिखाया गया है, यह नई विधि पहले रीयल-टाइम पीसीआर स्क्रीनिंग लागू करती है और फिर बैक्टीरिया कल्चर और पहचान के लिए पॉजिटिव नमूने भेजे जाते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल Zhuhai अंतर्राष्ट्रीय यात्रा स्वास्थ्य केंद्र की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों का पालन करता है । प्रयोग के दौरान मानक बाँझ आपरेशन का उपयोग करें ।

1. संस्कृति मीडिया संरचना और तैयारी

  1. पोषक तत्व शोरबा तैयार: 1% peptone भंग, ०.३% बीफ़ निकालने, ०.५% सोडियम क्लोराइड, ०.१% एच2ओ में ग्लूकोज, ७.५ के लिए पीएच समायोजित और 15 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस में आटोक्लेव ।
  2. तैयार Selenite Cystine माध्यम: भंग ०.५% peptone, ०.४% लैक्टोज, 1% Na2HCO3, ०.४% सोडियम हाइड्रोजन Selenite, ०.००१% एल-Cystine एच2ओ में, पीएच को ७.० में समायोजित करें और इसे 5 मिनट के लिए उबाल लें ।
  3. तैयार Xylose, Lysine, Deoxycholate आगर (XLD) प्लेट: भंग ०.३% खमीर निकालने, ०.५% एल-Lysine, ०.३७५% Xylose, ०.७५% लैक्टोज, ०.७५% सुक्रोज, ०.५% सोडियम क्लोराइड, ०.००८% phenol लाल, ०.६८% सोडियम thiosulfate, ०.०८% अमोनियम घाट साइट्रेट, ०.२५% सोडियम deoxycholate, एच2ओ में १.५% आगर, और ७.४ के लिए पीएच समायोजित । फिर इसे 5 मिनट के लिए उबाल लें और इसे ९० mm प्लेट्स में डाल दें ।
  4. तैयार साल्मोनेला chromogenic आगर प्लेट: भंग १.५% आगर, ०.७% peptone और खमीर निकालने, १.२९% एच2ओ में चुनिंदा एजेंट । फिर इसे 5 मिनट के लिए उबाल लें और इसे ९० mm प्लेट्स में डाल दें ।
  5. पोषक तत्व आगर थाली तैयार: 1% peptone भंग, ०.३% बीफ़ निकालने, ०.५% सोडियम क्लोराइड, १.५% एच2ओ में आगर, और पीएच ७.३ करने के लिए समायोजित करें । फिर इसे 15 मिनट के लिए १२१ ° c में आटोक्लेव और इसे ९० mm प्लेट्स में डाल दीजिये ।
  6. MacConkey आगर (MAC) प्लेट तैयार करें: 2% peptone भंग, 1% लैक्टोज, ०.५% सोडियम क्लोराइड, ०.५% बैल पित्त नमक, ०.००२५% तटस्थ लाल, १.५% आगर, ०.०००१% क्रिस्टल वायलेट एच2ओ में, और पीएच समायोजित करने के लिए ७.२ । फिर इसे 20 मिनट के लिए ११५ ° c में आटोक्लेव और इसे ९० mm प्लेट्स में डाल दीजिये ।

2. रीयल टाइम पीसीआर

  1. नमूना संग्रह
    1. रोगी के गुदा में एक गुदा झाड़ू डालें 3-5 सेमी गहरी, और इसे घुमाएं ३६० ° चारों ओर ।
    2. एक बाँझ संग्रह ट्यूब में गुदा झाड़ू रखो । नमूना ID चिह्नित करें ।
    3. जितनी जल्दी हो सके सैंपल को लेबोरेटरी में भेजें ।
      नोट: नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक 24 एच के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. पूर्व संवर्धन
    1. संग्रह ट्यूब में प्रत्येक नमूने में पोषक तत्व शोरबा के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. एक मशीन में 6 घंटे के लिए ३६ ° c पर मशीन ।
  3. नमूना मिश्रण (वैकल्पिक)
    1. प्रत्येक पूर्व संवर्धन संस्कृति के १०० µ एल लीजिए और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 1 नमूना के 8-10 नमूने मिश्रण अगर वहां 10 से अधिक नमूने हैं ।
    2. ठीक से चिह्नित करें ।
  4. डीएनए निष्कर्षण
    1. 2 मिनट के लिए ८०० एक्स जी में पूर्व संवर्धन संस्कृति केंद्रापसारक बड़े कणों को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए, और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । आकांक्षा द्वारा supernatant त्यागें.
    2. डीएनए निष्कर्षण समाधान के १०० µ एल जोड़ें (०.०१ एम पीएच ८.० Tris-EDTA, ०.०१% Nonidet पी ४० (NP40)) गोली करने के लिए । 1 मिनट के लिए जोरदार भंवर ।
    3. एक सूखी स्नान पर 5 मिनट के लिए १०० ° c पर उबाल लें ।
    4. 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । एक नई ट्यूब का उपयोग कर supernatant लीजिए, जो सफल वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए टेम्पलेट होगा ।
  5. रीयल टाइम पीसीआर
    1. सेटअप प्रतिक्रिया मिश्रण के रूप में पालन करें: प्रत्येक नमूने के लिए, 2x प्रतिक्रिया मिश्रण के १२.५ µ एल जोड़ें, प्रत्येक प्राइमरी के ०.४ µ मीटर, प्रत्येक जांच के ०.२ µ मीटर ( तालिका 1में अनुक्रम)27, 5 µ एल के रूप में कदम 2.4.4 में तैयार टेंपलेट के, और उपयोग ddH2हे 25 µ एल को जोड़ने के लिए कुल वॉल्यूम.
    2. सेटअप सायक्लिंग कार्यक्रम के रूप में पालन करें: 3 मिनट के लिए ९५ ° c, ९५ ° c के ४० चक्र के बाद के लिए 15 s, ५५ ° c के लिए 30 s, ७२ ° c के लिए ३४ s. 6 से फ्लोरोसेंट संकेतों लीजिए-carboxy-fluorescein (FAM) और Hexachlorofluorescein (हेक्स) चैनल बढ़ाव कदम (७२ डिग्री सेल्सियस) फ्लोरोसेंट वास्तविक समय पीसीआर मशीन द्वारा स्वचालित रूप से ।
    3. यंत्र के निर्देशों के अनुसार, एक फ्लोरोसेंट वास्तविक समय पीसीआर मशीन पर वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन ।
    4. सीधे चरण 4 पर जाएं और नकारात्मक परिणाम FAM/हेक्स चैनलों, जिसका अर्थ है कि नमूने साल्मोनेला एसपीपी के लिए ऋणात्मक है पर हो, तो ऋणात्मक रिपोर्ट इश्यू ।/शिगेला एसपीपी.
    5. यदि हेक्स और/या FAM चैनल, जिसका अर्थ है कि नमूना साल्मोनेला एसपीपी के लिए सकारात्मक हो सकता है और/या शिगेला एसपीपी., क्रमशः के लिए चरण ३.१ और/या ३.२ पर जाएं ।
      नोट: अगर नमूना मिश्रण कदम २.३ में किया गया है, तो वास्तविक सकारात्मक नमूना बाहर स्क्रीन करने के लिए किया जाना चाहिए जो सकारात्मक एक को बनाया व्यक्तिगत नमूनों पर असली समय पीसीआर.

3. निर्देशित संस्कृति

  1. साल्मोनेला एसपीपी. पीसीआर पॉजिटिव सैंपल
    1. माध्यम में चुनिंदा संस्कृति
      1. एक टेस्ट ट्यूब में Selenite Cystine माध्यम के 5 मिलीलीटर में पूर्व संवर्धन संस्कृति के १०० µ एल जोड़ें । ३६ डिग्री सेल्सियस पर 18 के लिए मशीन-24 एक मशीन में एच ।
    2. थाली पर संस्कृति को अलग
      1. एक माइक्रो पाश के साथ संस्कृति के एक पाश लीजिए और एक XLD प्लेट या साल्मोनेला chromogenic आगर प्लेट पर फैल. ३६ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 18-24 एच के लिए मशीन ।
    3. जैव रासायनिक पहचान
      1. XLD प्लेट पर संदेहास्पद कॉलोनी का चयन करें (डार्क हार्ट के साथ गुलाबी कॉलोनी; डार्क कॉलोनी; डार्क हार्ट के साथ पीली कॉलोनी) या साल्मोनेला chromogenic आगर प्लेट (बैंगनी या prunosus कॉलोनी, चिकना और गोल) (चित्रा 2).
      2. उपकरण के निर्देशों के अनुसार, स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली पर जैव रासायनिक पहचान के लिए विषय संदिग्ध कॉलोनी ।
    4. सीरम वैज्ञानिक लक्षण वर्णन
      1. O प्रतिजन लक्षण वर्णन
        1. O antigen polyvalent सीरा की एक ड्रॉप एक साफ़ स्लाइड पर जोड़ें ।
        2. एक माइक्रो लूप के साथ कॉलोनी के एक पाश ले लीजिए और सीरा में पीसने ।
        3. स्टेप 3.1.4.1.4 पर जाएं अगर यह बहकर रेत जैसा दिखता है, जिसका मतलब है कि कॉलोनी में सीरा (चित्रा 3) को रिएक्टिव कर देता है । अंयथा, चरण 3.1.4.1.5 पर जाएं ।
        4. का उपयोग करें o antigen monovalent सीरा विशिष्ट हे antigen विशेषता है जब तक 3.1.4.1.3 करने के लिए 3.1.4.1.1 चरणों को दोहराने के लिए ।
        5. 3.1.4.1.3 करने के लिए कदम 3.1.4.1.1 दोहराने के लिए छठी सीरा का प्रयोग करें । एक ट्यूब में उन छठी सीरा प्रतिक्रियाशील कालोनियों लीजिए और एक सूखी स्नान में 5 मिनट के लिए १०० डिग्री सेल्सियस पर फोड़ा । 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । गोली ले लीजिए और जब तक विशिष्ट हे प्रतिजन विशेषता है 3.1.4.1.4 करने के लिए कदम 3.1.4.1.1 दोहराएँ.
      2. एच प्रतिजन लक्षण वर्णन
        1. H प्रतिजन polyvalent सीरा की एक बूंद एक साफ स्लाइड पर जोड़ें ।
        2. एक माइक्रो लूप के साथ कॉलोनी के एक पाश ले लीजिए और सीरा में पीसने ।
        3. स्टेप 3.1.4.2.4 पर जाएं अगर यह बहकर रेत जैसा दिखता है, जिसका मतलब है कि कॉलोनी के सीरा को रिएक्टिव करना है ।
        4. h antigen monovalent सीरा विशिष्ट h antigen विशेषता है जब तक 3.1.4.2.3 करने के लिए 3.1.4.2.1 चरणों को दोहराने के लिए उपयोग करें ।
          नोट: कई बार सीरम प्रेरण दूसरे चरण एच प्रतिजन विशेषताएं करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यदि ऐसा है, तो निंन वैकल्पिक चरणों किया जाना चाहिए ।
        5. वैकल्पिक विशिष्ट एच प्रतिजन सीरा की एक बूंद पोषक आगर प्लेट पर जोड़ें । सभी सीरा अवशोषित कर रहे है जब तक रुको ।
        6. वैकल्पिक एक माइक्रो पाश के साथ कॉलोनी के एक पाश लीजिए और जहां विशिष्ट एच प्रतिजन सीरा अवशोषित कर रहे हैं प्लेट पर फैल. ३६ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 18-24 एच के लिए मशीन ।
        7. वैकल्पिक दूसरा चरण h antigen विशेषता है जब तक 3.1.4.2.3 करने के लिए 3.1.4.2.1 चरणों को दोहराने के लिए h antigen monovalent सीरा का उपयोग करें ।
        8. चरण 4 पर जाएं ।
  2. शिगेला एसपीपी. पीसीआर पॉजिटिव सैंपल
    1. थाली पर संस्कृति को अलग
      1. एक माइक्रो पाश के साथ पूर्व संवर्धन संस्कृति के एक पाश लीजिए और एक XLD प्लेट या मैक प्लेट पर फैल. ३६ डिग्री सेल्सियस पर 18 के लिए मशीन-24 एक मशीन में एच ।
    2. जैव रासायनिक पहचान
      1. (चिकनी, गोल, पारदर्शी और लाल कॉलोनी) या मैक प्लेट (चिकनी, गोल, पारदर्शी और बेरंग कॉलोनी व्यास में 2-3 मिमी के साथ) XLD प्लेट पर संदिग्ध कॉलोनी ले लीजिए; शिगेला sonnei बड़ा हो सकता है और गर्मी के समय के बढ़ाव के रूप में प्रकाश गुलाबी करने के लिए बारी) (चित्रा 4) ।
      2. उपकरण के निर्देशों के अनुसार, स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली पर जैव रासायनिक पहचान के लिए विषय संदिग्ध कॉलोनी ।
    3. सीरम वैज्ञानिक लक्षण वर्णन
      1. एक साफ स्लाइड पर शिगेला एसपीपी. polyvalent सीरा की एक बूंद जोड़ें ।
      2. एक माइक्रो लूप के साथ कॉलोनी के एक पाश ले लीजिए और सीरा में पीसने ।
      3. स्टेप 3.2.3.4 पर जाएं अगर यह बहकर रेत जैसा दिखता है, जिसका मतलब है कि कॉलोनी के सीरा को रिएक्टिव करना है ।
      4. उपयोग शिगेला एसपीपी. monovalent सीरा दोहराने के लिए कदम 3.2.3.1 3.2.3.3 तक विशिष्ट शिगेला एसपीपी. विशेषता है ।
      5. चरण 4 पर जाएं ।

4. रिपोर्ट

  1. उपरोक्त परिणामों के अनुसार सकारात्मक या नकारात्मक रिपोर्ट जारी करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए प्रोटोकॉल लागू किया गया ।/शिगेला एसपीपी. गुदा स्टूल नमूने में जो लोग भोजन और पानी संभालना होगा ।

वास्तविक समय पीसीआर कदम में, के रूप में चित्रा 5एमें दिखाया गया है, वहां हेक्स चैनल, जिसका अर्थ है कि मिश्रित नमूना साल्मोनेला एसपीपी के लिए सकारात्मक था में एक सफल प्रवर्धन था । फिर एक और वास्तविक समय पीसीआर व्यक्तिगत नमूनों जो सकारात्मक एक बना दिया पर आयोजित किया गया । जैसा चित्र 5Bमें दिखाया गया है, नमूना 2 धनात्मक था । इसलिए, नमूना 2 साल्मोनेला एसपीपी की निर्देशित संस्कृति के लिए चुना गया था । चित्रा 5सीमें, FAM चैनल में एक सफल प्रवर्धन था, जिसका मतलब था कि मिश्रित नमूना शिगेला एसपीपी के लिए सकारात्मक था । इसके बाद एक और रीयल टाइम पीसीआर का संचालन किया गया और 10 सैंपल पॉजिटिव पाए गए (चित्रा 5डी) । इसलिए शिगेला एसपीपी के गाइडेड कल्चर के लिए सैंपल 10 चुना गया ।

साल्मोनेला एसपीपी के मार्गदर्शन संस्कृति में, वहां XLD प्लेट और साल्मोनेला chromogenic आगर प्लेट पर गुलाबी कालोनियों और बैंगनी कालोनियों थे, अलग से, जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है । फिर इन कालोनियों में स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली पर जैव रासायनिक पहचान के अधीन किया गया । परिणाम से पता चला कि यह साल्मोनेला एसपीपी., प्रजातियों के साथ अज्ञात था । इसलिए, सीरम वैज्ञानिक लक्षण वर्णन किया गया था (चित्रा 3) और यह O4, O12, एचबी, H1, 2 के लिए प्रतिक्रियाशील था । व्हाइट-Kauffmann-Le माइनर स्कीम के अनुसार, सैंपल 2 को अंतत: साल्मोनेला paratyphi बीके लिए पॉजिटिव बताया गया । जबकि, शिगेला एसपीपी की निर्देशित संस्कृति के लिए, XLD प्लेट और मैक प्लेट पर गुलाबी लाल और बेरंग कालोनियां थीं, अलग से, जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है । फिर इन कॉलोनियों में भी स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली पर जैव रासायनिक पहचान के अधीन थे । परिणाम से पता चला कि यह शिगेला sonneiथा । इसकी विशिष्ट सीरोटाइप की पुष्टि करने के लिए, सीरम वैज्ञानिक लक्षण वर्णन किया गया था (चित्रा 3) और यह sonnei चरण द्वितीय करने के लिए प्रतिक्रियाशील था. इसलिए शिगेला sonnei फेज IIके लिए सैंपल 10 को अंतत: पॉजीटिव बताया गया ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रोटोकॉल का आरेख । दो प्रमुख कदम दिखाया और डैश रेखा से अलग कर दिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि संस्कृति के परिणाम साल्मोनेला एसपीपी. on XLD प्लेट और साल्मोनेला chromogenic आगर प्लेट. XLD प्लेट पर, अंधेरे दिल के साथ गुलाबी कालोनियों थे, जबकि साल्मोनेला chromogenic आगर प्लेट पर, वहां बैंगनी कालोनियों थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रतिनिधि सीरम वैज्ञानिक लक्षणीय परिणाम । अगर कॉलोनी के सीरा को रिएक्टिव किया गया तो यह बहते हुए रेत (बाएं) की तरह लग रही थी । अंयथा, यह पंकिल (सही) था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रतिनिधि कल्चर का परिणाम शिगेला एसपीपी. XLD प्लेट और मैक प्लेट पर। XLD प्लेट पर, वहां लाल कालोनियों थे, जबकि मैक प्लेट पर, वहां पारदर्शी और बेरंग कालोनियों थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : प्रतिनिधि वास्तविक समय पीसीआर परिणाम । (क) मिश्रण नमूनों के लिए हेक्स चैनल । (ख) व्यक्तिगत नमूनों के लिए हेक्स चैनल । (ग) मिश्रण नमूनों के लिए FAM चैनल । (घ) व्यक्तिगत नमूनों के लिए FAM चैनल. पीसी: सकारात्मक नियंत्रण । नेकां: नकारात्मक नियंत्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

रोगज़नक़ नाम अनुक्रम (5 '-3 ')
साल्मोनेला साल-एफ
साल-R
साल-जांच		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
हेक्स-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-ग्रहण
शिगेला शि-च
शि-नि
शि-जांच		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-ग्रहण

तालिका 1: प्राइमरों और जांच का इस्तेमाल किया । प्राइमरी व जांच के नाम व जुगाड़ की वीडियोग्राफी कराई गई ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

जबसे साल्मोनेला एसपीपी./शिगेला एसपीपी. अक्सर खाद्य विषाक्तता के साथ जुड़े रहे हैं और तीव्र आंत्रशोथ के मल-मौखिक संचरण28,29 और नित्य विधि या तो श्रम-प्रधान या समय लेने वाली है 7, हम साल्मोनेला एसपीपी./शिगेला एसपीपी. स्क्रीनिंग, निर्देशित संस्कृति के साथ संयुक्त वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर के लिए एक उच्च प्रवाह मंच का वर्णन ।

इस मंच की क्षमता को अधिकतम करने के लिए विचार की जरूरत है कि कई कदम उठाए हैं । पहले एक पोषक तत्व शोरबा में नमूनों की पूर्व संवर्धन कदम है (२.२ कदम) । हालांकि कोई पूर्व संवर्धन कदम स्टूल ऐसे दस्त के रूप में स्पष्ट लक्षण, आदि, के साथ उन रोगियों से एकत्र नमूनों के लिए आवश्यक है, एक सामांय 6 एच पूर्व संवर्धन कदम अभी भी गुदा झाड़ू नमूनों के लिए आवश्यक है, जब पूर्व रोजगार के दौरान एकत्र जो लोग भोजन और पानी संभाल लेंगे के लिए शारीरिक परीक्षा, के रूप में उन लोगों को मुख्य रूप से स्वस्थ थे या कम से स्पर्शोन्मुख वयस्कों । यदि प्रोटोकॉल केवल साल्मोनेला एसपीपी का पता लगाने के लिए लागू किया गया था, तो पूर्व संवर्धन Selenite Cystine माध्यम में आयोजित किया जा सकता है ताकि संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए । दूसरा अहम कदम संदिग्ध कालोनियों की पहचान (स्टेप 3.1.3.1 और 3.2.2.1) है । वहां कई मल नमूने है कि पता लगाने और लक्ष्य रोगजनकों के अलगाव30मुखौटा मई में पृष्ठभूमि वनस्पतियां हैं । इसलिए प्रयोग के दौरान चरण 3.1.3.1 और 3.2.2.1 में निर्धारित के अनुसार संदिग्ध कालोनियों की विशेषता को ध्यान में रखना चाहिए । तीसरा महत्वपूर्ण कदम साल्मोनेला एसपीपी के सीरम वैज्ञानिक लक्षण वर्णन है । साल्मोनेला एसपीपी के बहुमत के रूप में । एच प्रतिजन31के लिए एक दूसरे चरण होते हैं, सीरम प्रेरण प्रदर्शन किया जाना चाहिए । हालांकि, सीरम प्रेरण हमेशा सफल नहीं है, और प्रेरण के कई दौर सेकंड एच चरण सही निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

प्रोटोकॉल अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील के रूप में हमारे पिछले अध्ययन27द्वारा सत्यापित है । प्रोटोकॉल की उच्च विशिष्टता को अपनी क्षमता से प्रदर्शित किया जाता है, जिसमें साल्मोनेला एसपीपी./शिगेला एसपीपी. अंय संबंधित रोगजनकों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है27। प्रोटोकॉल का पता लगाने की निचली सीमा है 104 CFU/एमएल और साल्मोनेला एसपीपी के लिए 103 CFU/एमएल और शिगेला एसपीपी., क्रमशः27, जो पिछली रिपोर्ट के तुलनीय हैं7,३२ , ३३ , ३४. जैसा कि हम ऊपर कहा गया है, साल्मोनेला एसपीपी. डिटेक्शन की संवेदनशीलता आगे Selenite Cystine पूर्व संवर्धन द्वारा बढ़ाया जा सकता है अगर प्रोटोकॉल केवल साल्मोनेला एसपीपी का पता लगाने के लिए लागू किया गया था । इसके अलावा, प्रोटोकॉल दो परतों से सकारात्मक दर बढ़ सकता है और कार्यभार/औसत बदलाव समय काफी27।

अंय NAAT परख, प्रोटोकॉल का एक प्रमुख सीमा के समान है, जब क्लासिक बैक्टीरिया संस्कृति विधि की तुलना में, यह है कि प्रोटोकॉल केवल साल्मोनेला एसपीपी की पहचान सकता है ।/शिगेला एसपीपी., जबकि अंय आम दस्त-बैक्टीरिया पैदा कर रहे है लोप7। इसके विपरीत, क्लासिक बैक्टीरिया संस्कृति के दौरान, उन बैक्टीरिया समानांतर में पहचाना जा सकता है अगर वे अस्तित्व में । प्रोटोकॉल की एक और सीमा है कि कुछ साल्मोनेला एसपीपी./शिगेला एसपीपी. अनुक्रम रूपांतरों के कारण रीयल-टाइम पीसीआर द्वारा पहचान नहीं की जा सकी27. हालांकि, अगर नकारात्मक वास्तविक समय पीसीआर परिणाम स्पष्ट नैदानिक लक्षणों के साथ रोगियों से उन नमूनों के लिए दिखाई देते हैं, प्रयोगशाला तकनीशियनों पर ध्यान देना चाहिए और परिणामों की पुष्टि करने के लिए अन्य प्रयोगों का संचालन कर सकते हैं । एक बड़े प्रकोप के दौरान हम पीसीआर स्क्रीनिंग के पहले राउंड के लिए परित के नमूनों की बजाय एक-एक सैंपल का इस्तेमाल कर सकते हैं ।

अंत में, यहां प्रदान की प्रोटोकॉल साल्मोनेला एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक मूल्यवान मंच के रूप में सेवा कर सकता है ।/शिगेला एसपीपी.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम Zhuhai के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम, चीन (अनुदान संख्या 20171009E030064), गुआंग्डोंग, चीन (अनुदान संख्या 2015A020211004) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम और सामान्य प्रशासन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम का समर्थन किया गया था की गुणवत्ता पर्यवेक्षण, निरीक्षण और संगरोध के पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना (अनुदान संख्या 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४१ तीव्र आंत्रशोथ, साल्मोनेला एसपीपी. शिगेला एसपीपी. स्क्रीनिंग वास्तविक समय पीसीआर निर्देशित संस्कृति
<em>साल्मोनेला</em> एसपीपी की स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह मंच./<em>शिगेला</em> एसपीपी.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter