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Immunology and Infection

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Abstract

Transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda ocorre de vez em quando, especialmente quando pessoas que cuidou de comida e água são infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. O método padrão-ouro para a detecção de Salmonella spp./Shigella spp. é cultura direta mas é trabalhosa e demorada. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para Salmonella spp./Shigella spp. triagem, usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) combinada com cultura guiada. Há duas fases principais: a cultura guiada e PCR em tempo real. Para a primeira fase (PCR em tempo real), vamos explicar cada passo do método: coleção, pré-enriquecimento, extração de DNA e PCR em tempo real da amostra. Se o resultado PCR em tempo real é positivo e, em seguida, é realizada a segunda fase (cultura guiada): seletiva cultura, identificação bioquímica e sorológica caracterização. Ilustraremos também resultados representativos gerados a partir dele. O protocolo descrito aqui seria uma plataforma valiosa para a seleção rápida, específica, sensível e elevado-throughput de Salmonella spp. /Shigella spp.

Introduction

Diarreia é ainda um problema de saúde comum com uma incidência elevada taxa globalmente1,2. Embora a mortalidade é relativamente baixa, alguns pacientes apresentam sintomas de várias semanas (por exemplo, solta e aguadas fezes, urgência para ir ao banheiro), que tornam o impacto sócio-econômico muito alta3,4. Mais a sério, alguns pacientes podem desenvolver até mesmo síndrome do intestino irritável se deixados sem tratamento5. Existem vários tipos de bactérias, vírus e parasitas que podem causar diarreia6. Salmonella spp. /Shigella spp. estão entre as bactérias mais comuns para a transmissão de gastroenterite aguda7,8,9,10,11. Portanto, muitos condados emitiram leis ou regulamentos para regular Salmonella spp / triagem deShigella spp. entre as pessoas que iria lidar com comida e água. Por exemplo, o governo chinês emitiu leis para obrigatório Salmonella spp / triagem deShigella spp. uma vez por ano.

O método padrão-ouro para Salmonella spp. / deteção deShigella spp. é a cultura de bactérias. Através de cultura de bactérias e sucessiva identificação bioquímica e sorológica caracterização, podemos identificar as espécies de bactérias, que podem facilitar a gestão do surto de doença e antimicrobiana de perfil para auxiliar o tratamento de pacientes 12. pode também ajudar localizar a fonte de infecção durante a Salmonella spp. /Shigella spp. surto13. No entanto, este método é trabalhosa (que exigem operação manual) e demorado (leva vários dias), especialmente para os testes de um grande número de amostras7. Além disso, viável mas não-viáveis (VBNC) Salmonella spp /pode existir em algumas amostras de fezesdeShigella spp.14. Tendo em conta essas desvantagens, muitos laboratórios tentaram desenvolver novas técnicas para a detecção de Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. todos esses métodos usam o teste de amplificação de ácido nuclear (NAAT), entre os quais a reação em cadeia do polymerase (PCR) é o mais comum. Uma grande limitação destes métodos NAAT baseado é que bactérias mortas, detritos mesmo bacteriana contendo incompleta DNA genômico, poderiam mostrar resultados positivos,26, que em grande parte poderia influenciar o diagnóstico preciso da doença. Blanco et al mostrou que aquele ensaio molecular é altamente sensível, não só viável salmonelas nas culturas, mas também para genomas parciais e bactérias mortas ou inviáveis de infecções passadas ou contaminação26. Portanto, a nova tecnologia deve ser desenvolvida.

Aqui, descrevemos um método inovador que combina o NAAT baseado método e cultivo. Como mostrado na Figura 1, este novo método se aplica a PCR em tempo real, triagem primeiro e em seguida as amostras positivas são enviadas para a identificação e a cultura de bactérias.

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Protocol

O protocolo segue as orientações definidas pelo Comitê de ética de pesquisa humana de Zhuhai International Travel Healthcare Center. Por favor, use o padrão operação estéril durante o experimento.

1. preparação e composição de meios de cultura

  1. Prepare o caldo de carne nutriente: Dissolver peptona 1%, 0,3% de extrato de carne, 0,5% de cloreto de sódio, 0,1% de glicose em H2O, ajustar o pH a 7,5 e autoclave em 121 ° C por 15 min.
  2. Prepare o suporte de Selenito cistina: dissolver 0,5% de peptona, Selenito de hidrogênio de sódio 0,4%, 0,4% à lactose, 1% Na2HCO30,001% L-Cistina em H2O, ajustar o pH a 7,0 e ferver por 5 min.
  3. Preparar a xilose, lisina, placa de ágar (XLD) Deoxycholate: extracto de levedura de dissolver 0,3%, e 0,5% de L-lisina, xilose 0.375%, 0,75% lactose, 0,75% de sacarose, 0,5% de cloreto de sódio, 0,008% de vermelho de fenol, 0,68% de tiossulfato de sódio, citrato férrico de amónio de 0,08%, 0,25% de sódio Deoxycholate do, 1,5% de ágar em H2O e ajustar o pH para 7,4. Em seguida, ferva-a por 5 min e derramá-lo em placas de 90 mm.
  4. Preparar a placa de ágar cromogênico Salmonella : dissolver o ágar 1,5%, 0,7% de peptona e levedura extrato, reagente seletivo de 1,29% em H2O. Em seguida, ferva-a por 5 min e derramá-lo em placas de 90 mm.
  5. Preparar a placa de ágar nutriente: dissolver peptona 1%, 0,3% de extrato de carne, cloreto de sódio 0,5% e 1,5% de ágar em H2O e ajustar o pH para 7,3. Então autoclave em 121 ° C durante 15 minutos e despeje-o em placas de 90 mm.
  6. Preparar a placa de MacConkey agar (MAC): dissolver 2% de peptona, 1% de lactose, cloreto de sódio 0,5%, 0,5% sais biliares de boi 0,0025% vermelho neutro, 1,5% de ágar, violeta de cristal de 0,0001% em H2O e ajustar o pH para 7.2. Então autoclave em 115 ° C por 20 min e derramá-lo em placas de 90 mm.

2. real-time PCR

  1. Coleta de amostra
    1. Introduza um swab anal no ânus do paciente 3-5 cm de profundidade e gire-o de 360° ao redor.
    2. Colocar o swab anal num tubo de colheita estéril. Identificação de amostra de Mark.
    3. Envie a amostra ao laboratório logo que possível.
      Nota: Amostras poderiam ser armazenadas a 4 ° C, para não mais de 24 h.
  2. Pré-enriquecimento
    1. Adicione 3 mL de caldo nutriente em cada amostra no tubo de coleta.
    2. Incube a 36 ° C por 6 horas na incubadora.
  3. Amostra de mistura (opcional)
    1. Coletar 100 µ l de cada cultura pré-enriquecimento e misturar amostras de 8-10 de 1 amostra em um tubo de 1,5 mL, se houver mais de 10 amostras.
    2. Marca corretamente.
  4. Extração de DNA
    1. Centrifugar a cultura pré-enriquecimento a 800 x g por 2 min permitir que partículas grandes de assentar, e transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 12.000 x g por 5 min. descartar o sobrenadante por aspiração.
    2. Adicionar 100 µ l de solução de extração de DNA (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) para a pelota. Vórtice vigorosamente durante 1 minuto.
    3. Ferva a 100 ° C por 5 min em um banho seco.
    4. Centrifugar a 12.000 x g por 5 min. recolher o sobrenadante usando um tubo novo, que será o modelo para a análise PCR em tempo real sucedendo.
  5. PCR em tempo real
    1. Configurar a mistura de reação como segue: para cada amostra, adicione 12,5 µ l de 2 x mistura reacional, 0,4 µM de cada primer, 0,2 µM de cada sonda (sequências na tabela 1)27, 5 µ l do modelo como preparado na etapa 2.4.4 e usar o ddH2O para adicionar até 25 µ l total volume.
    2. Configurar o programa ciclismo como segue: 95 ° C por 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C para 34 s. coletamos fluorescente os sinais de canais de Hexachlorofluorescein (HEX) na etapa de alongamento (72 ° C) e 6-carboxy-fluoresceína (FAM) automaticamente pela máquina fluorescente de PCR em tempo real.
    3. Realize o PCR em tempo real em uma máquina fluorescente de PCR em tempo real, de acordo com as instruções do instrumento.
    4. Vá para o passo 4 diretamente e emitir relatórios negativos se ocorrer resultados negativos nos canais de FAM/HEX, o que significa que as amostras são negativas para Salmonella spp. /Shigella spp.
    5. Vá para o passo 3.1 ou 3.2 se positivos resultados ocorrem nos canais de HEX e/ou FAM, que significa que a amostra pode ser positiva para Salmonella spp. e/ou Shigella spp., respectivamente.
      Nota: Se a mistura da amostra foi realizado na etapa 2.3, então PCR em tempo real em amostras individuais que compo o positivo que deve ser realizado para filtrar a amostra real positiva.

3. guiada cultura

  1. Salmonella spp. PCR positiva amostra
    1. Cultura seletiva em meio
      1. Adicione 100 µ l de cultura pré-enriquecimento em 5 mL de meio de Selenito cistina em um tubo de ensaio. Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.
    2. Separando a cultura em placa
      1. Coletar um loop da cultura com um micro-loop e espalhar-se para um prato XLD ou placa de ágar cromogênico de Salmonella . Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.
    3. Identificação bioquímica
      1. Selecione colônia suspeita no XLD placa (Colônia rosa com/sem coração escuro, escura colônia; colônia amarela com/sem coração escuro) ou placa de ágar cromogênico de Salmonella (roxo ou prunosus colônia, redondo e liso) (Figura 2).
      2. Colônia suspeita de assunto para identificação bioquímica no sistema automatizado de identificação microbiana, de acordo com as instruções do instrumento.
    4. Caracterização sorológica
      1. O caracterização de antígeno
        1. Adicione uma gota do sera polivalente antígeno O numa lâmina limpa.
        2. Colete um loop da colônia com uma micro-loop e moagem no sera.
        3. Vá para a etapa 3.1.4.1.4 se parece fluir a areia, o que significa que a colônia é reativa para os soros (Figura 3). Caso contrário, vá para a etapa 3.1.4.1.5.
        4. Use soros monovalentes de O antígeno para repetir passos 3.1.4.1.1 para 3.1.4.1.3 até o antígeno O específico é caracterizado.
        5. Use soros Vi para repetir passos 3.1.4.1.1 para 3.1.4.1.3. Recolher aquelas colônias de reativo de soros Vi em um tubo e ferve a 100 ° C por 5 min em um banho seco. Centrifugar a 12.000 x g por 5 min. coletar o sedimento e repita os passos de 3.1.4.1.1 para 3.1.4.1.4 até antígeno específico O é caracterizado.
      2. Caracterização de antígeno H
        1. Adicione uma gota de soros polivalentes de antígeno H numa lâmina limpa.
        2. Colete um loop da colônia com uma micro-loop e moagem no sera.
        3. Vá para a etapa 3.1.4.2.4 se parece fluir a areia, o que significa que a colônia é reativa para o sera.
        4. Use soros monovalentes de H antígeno para repetir passos 3.1.4.2.1 para 3.1.4.2.3 até o antígeno H específico é caracterizado.
          Nota: Às vezes indução de soro pode ser necessária para caracterizar o antígeno de fase H a segunda. Se assim for, as seguintes etapas opcionais devem ser executadas.
        5. (Opcional) Adicione uma gota de soros específicos do antígeno H em placa de ágar nutriente. Espere até que todos os soros são absorvidos.
        6. (Opcional) Colete um loop da colônia com uma microlaço e espalhar sobre o prato onde soros específicos do antígeno H são absorvidos. Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.
        7. (Opcional) Use soros monovalentes de H antígeno para repetir passos 3.1.4.2.1 para 3.1.4.2.3 até a segunda fase do antígeno H é caracterizada.
        8. Vá para a etapa 4.
  2. Shigella spp. PCR positiva amostra
    1. Separando a cultura em placa
      1. Coletar um loop da cultura pré-enriquecimento com um micro-loop e espalhe sobre um XLD placa ou placa de MAC. Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.
    2. Identificação bioquímica
      1. Coletar a colônia suspeita no XLD placa (liso, redondo, transparente e vermelho colônia) ou placa de MAC (Lisa, redondo, transparente e incolor colônia com 2-3 mm de diâmetro; Shigella sonnei pode ser maior e rosados à luz como o alongamento do tempo de incubação) (Figura 4).
      2. Colônia suspeita de assunto para identificação bioquímica no sistema automatizado de identificação microbiana, de acordo com as instruções do instrumento.
    3. Caracterização sorológica
      1. Adicione uma gota de soros polivalentes de Shigella spp. numa lâmina limpa.
      2. Colete um loop da colônia com uma micro-loop e moagem no sera.
      3. Vá para o passo 3.2.3.4 se parece fluir a areia, o que significa que a colônia é reativa para o sera.
      4. Use soro monovalente de Shigella spp. Repita as etapas 3.2.3.1 para 3.2.3.3 até específicas spp. Shigella é caracterizada.
      5. Vá para a etapa 4.

4. o relatório

  1. Emitir relatórios de positivos ou negativos de acordo com os resultados acima.

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Representative Results

O protocolo foi aplicado para o rastreio de Salmonella spp. / amostras deShigella spp. em fezes anal de pessoas que iria lidar com comida e água.

Na etapa PCR em tempo real, como mostrado na Figura 5A, houve uma amplificação bem-sucedida no canal de HEX, o que significava que a amostra mista era positiva para Salmonella spp. Em seguida, um mais PCR em tempo real foi realizado em amostras individuais que fizeram o positivo. Como mostrado na Figura 5B, amostra 2 foi positiva. Portanto, a amostra 2 foi escolhida para a cultura guiada de Salmonella spp. Na Figura 5C, havia uma amplificação bem-sucedida no canal FAM, que significava que a amostra mista era positiva para Shigella spp. Em seguida, foi realizado um PCR em tempo real mais e amostra 10 foi encontrada para ser positivo (Figura 5-D). Portanto, a amostra 10 foi escolhida para a cultura guiada de Shigella spp.

Na cultura guiada de Salmonella spp., havia colônias rosa e roxas colônias em XLD placa e placa de ágar cromogênico de Salmonella , separadamente, conforme mostrado na Figura 2. Então estas colônias foram submetidas à identificação bioquímica no sistema automatizado de identificação microbiana. Os resultados mostraram que era Salmonella spp., com espécies desconhecidas. Portanto, a caracterização sorológica foi realizada (Figura 3) e foi reativa para O4 O12, Hb, H1, 2. De acordo com o esquema de Kauffmann-White-Le menor, amostra 2 finalmente foi relatada como positivo para Salmonella paratyphi B. Enquanto que para a cultura guiada de Shigella spp., havia colônias rosa de vermelhas e incolores em XLD e chapa de MAC, separadamente, conforme mostrado na Figura 4. Então estas colônias também foram submetidas à identificação bioquímica no sistema automatizado de identificação microbiana. Os resultados mostraram que era Shigella sonnei. Para confirmar sua sorotipo específico, caracterização sorológica foi realizada (Figura 3) e foi reativa a sonnei fase II. Portanto, amostra 10 finalmente foi relatada como positiva para a fase de Shigella sonnei II.

Figure 1
Figura 1 : O diagrama do protocolo. Dois passos importantes foram mostrados e separados por uma linha de traço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Resultados representativos da cultura de Salmonella spp. em XLD placa e placa de ágar cromogênico salmonelas . Na placa XLD, havia colônias rosa com/sem coração escuro, enquanto na placa de ágar cromogênico de Salmonella , havia colônias púrpura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Resultado representativo caracterização sorológica. Se a colônia foi reativa para o sera, parecia fluir areia (à esquerda). Caso contrário, era turvo (direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Resultados de cultura representante de Shigella spp. em XLD e chapa de MAC. Na placa XLD, havia colônias vermelhas, enquanto que na placa de MAC, havia colônias transparentes e incolores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Resultados representativos de PCR em tempo real. (A) HEX canal para mistura de amostras. (B) HEX canal para amostras individuais. (C) FAM canal para mistura de amostras. (D) FAM canal para amostras individuais. PC: controle positivo. NC: controle negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Agente patogénico Nome Sequence(5'-3')
Salmonela Sal-F
Sal-R
Sal-sonda		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse
Shigella Shi-F
Shi-R
Shi-sonda		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse

Tabela 1: Primers e sondas utilizadas. O nome e as sequências dos primers e sondas foram fornecidas.

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Discussion

Desde Salmonella spp. /Shigella spp. são frequentemente associados com intoxicação alimentar e transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda28,29 , e o método de rotina é trabalhoso ou demorado 7, nós descrevemos uma plataforma de alta produtividade para a Salmonella spp. / rastreio deShigella spp., usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Há várias etapas que precisam de cuidados para maximizar a capacidade desta plataforma. A primeira é a etapa de pré-enriquecimento das amostras em caldo nutriente (passo 2.2). Embora nenhuma etapa pré-enriquecimento é necessário para as amostras de fezes coletadas de pacientes com sintomas evidentes, como diarreia, etc., uma etapa de pré-enriquecimento geral 6 h ainda é necessária para amostras de swab anal, quando coletados durante o pré-emprego exame físico para as pessoas que iria lidar com comida e água, como as pessoas eram principalmente adultos saudáveis ou pelo menos assintomáticos. Se o protocolo só foi aplicado para a detecção de Salmonella spp., em seguida, pré-enriquecimento poderia ser praticada num meio de Selenito cistina a fim de aumentar a sensibilidade. O segundo passo fundamental é a identificação das colônias suspeitas (etapa 3.1.3.1 e 3.2.2.1). Existem muitos interferentes flora de fundo nas amostras de fezes que podem mascarar a detecção e isolamento de patógenos de alvo30. Portanto, a característica das colônias suspeitas, como definido na etapa 3.1.3.1 e 3.2.2.1 deve ser mantida em mente durante o experimento. O terceiro passo crítico é a caracterização sorológica de Salmonella spp. Como a maioria de Salmonella spp. conter uma segunda fase para o antígeno de H31, indução de soro precisa ser executada. No entanto, a indução de soro não é sempre bem sucedida, e várias rodadas de indução podem ser necessária para determinar a correta segunda fase H.

O protocolo é altamente específico e sensível, como verificado pela nossa anterior estudo27. A alta especificidade do protocolo é demonstrada pela sua capacidade, no qual Salmonella spp. /Shigella spp. poderiam ser distinguidos de outros patógenos relacionados27. O limite inferior de detecção do protocolo é 104 UFC/mL e 103 UFC/mL para Salmonella spp. e Shigella spp.,27, respectivamente, que são comparáveis aos anteriores relatórios7,32 , 33 , 34. como dissemos acima, a sensibilidade da deteção de Salmonella spp. pode ser aumentada por pré-enriquecimento Selenito cistina se o protocolo só foi aplicado para a detecção de Salmonella spp. Além disso, o protocolo pode aumentar a taxa positiva por duas dobras e diminuir a carga de trabalho/mediana reviravolta tempo significativamente27.

Semelhante a outros ensaios NAAT, uma limitação importante do protocolo, quando comparado ao método de cultura de bactérias clássico, é que o protocolo só pôde identificar Salmonella spp. /Shigella spp., enquanto outras bactérias causadoras de diarreia comuns são omitido a7. Em contraste, durante a cultura de bactérias clássico, essas bactérias podem ser identificadas em paralelo se eles existissem. Outra limitação do protocolo é que alguns de Salmonella spp. /Shigella spp. não pôde ser identificado por PCR em tempo real devido a variações de sequência27. No entanto, se os resultados negativos de PCR em tempo real aparecem para as amostras de pacientes com sintomas clínicos evidentes, técnicos de laboratório devem prestar atenção e podem realizar outros experimentos para confirmar os resultados. Durante um grande surto, podemos utilizar uma única amostra em vez de amostras em pool para a primeira rodada de seleção de PCR.

Em conclusão, o protocolo fornecido aqui poderia servir como uma plataforma valiosa para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela ciência e tecnologia programa de Zhuhai, China (número de concessão de 20171009E030064), a ciência e tecnologia programa de Guangdong, China (número de concessão de 2015A020211004) e da ciência e tecnologia-programa de administração geral Supervisão da qualidade, inspeção e quarentena da República Popular da China (número de concessão de 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

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Imunologia e infecção edição 141 gastroenterite aguda, Salmonella spp. Shigella spp. triagem PCR em tempo real guiado a cultura
Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de <em>Salmonella</em> spp. /<em>Shigella</em> spp.
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Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

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