Summary
Salmonella spp. /Shigella spp. är vanliga patogener tillskrivs diarré. Här, vi beskriver en hög genomströmning plattform för screening av Salmonella spp. /Shigella spp. med realtids-PCR kombinerat med guidade kultur.
Abstract
Fekal-oral överföring av akut gastroenterit förekommer emellanåt, särskilt när människor som hanterade mat och vatten är smittade av Salmonella spp./Shigella spp. Den gyllene standard metoden för detektion av Salmonella spp./Shigella spp. är direkt kultur men det är arbetskrävande och tidsödande. Här beskriver vi en hög genomströmning plattform för Salmonella spp./Shigella spp. screening, med realtid polymeras-kedjereaktion (PCR) i kombination med guidade kultur. Det finns två huvudfaser: realtids-PCR och guidade kultur. För den första etappen (realtids-PCR), vi förklarar varje steg i metoden: prova samling, före berikning, DNA-extraktion och realtids-PCR. Om realtids PCR resultatet är positivt, då det andra steget (guidade kultur) utförs: selektiv kultur, biokemisk identifikation och serologiska karakterisering. Vi illustrerar också representativa resultat genereras från den. Protokollet beskrivs här skulle vara en värdefull plattform för snabb, särskilda, känsliga och high-throughput screening av Salmonella spp. /Shigella spp.
Introduction
Diarré är fortfarande ett vanligt hälsoproblem med hög incidens Betygsätt globalt1,2. Även dödligheten är relativt låg, vissa patienter uppvisar olika symtom i veckor (såsom lös och vattnig avföring, en brådska att gå på toaletten), som gör de samhällsekonomiska konsekvenser mycket hög3,4. Mer allvarligt, vissa patienter kan även utveckla colon irritabile om de lämnas obehandlade5. Det finns olika typer av bakterier, virus och parasiter som kan orsaka diarré6. Salmonella spp. /Shigella spp. är bland de vanligaste bakterierna för överföring av akut gastroenterit7,8,9,10,11. Därför många län har utfärdat lagar eller bestämmelser för regelbundna Salmonella spp. /Shigella spp. screening bland människor som skulle hantera mat och vatten. Till exempel den kinesiska regeringen har utfärdat lagar för obligatorisk Salmonella spp. /Shigella spp. screening en gång om året.
Metoden guldmyntfoten för Salmonella spp. /Shigella spp. upptäckt är bakterier kultur. Genom bakterier kultur och successiva biokemiska identifiering och serologiska karakterisering, kan vi identifiera arterna av bakterier, som kunde underlätta utbrottet sjukdomshantering och antimikrobiella profilering för att underlätta behandling av patienter 12. det kan också hjälpa spåra smittkällan under den Salmonella spp. /Shigella spp. utbrott13. Denna metod är dock arbetsintensiva (som kräver manuell drift) och tidskrävande (tar flera dagar), särskilt för testning av ett stort antal prover7. Dessutom lönsamt men icke-odlingsbara (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kan förekomma i vissa avföringsprov14. Med tanke på dessa nackdelar, många laboratorier har försökt att utveckla ny teknik för detektion av Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. alla dessa metoder använder kärnkraft acid amplification testet (Norling), bland vilka polymeras-kedjereaktion (PCR) är den vanligaste. En stor begränsning av dessa NAAT baserade metoder är att döda bakterier, även bakteriell skräp som innehåller ofullständiga genomiskt DNA, kunde visa positiva resultat26, som till stor del kan påverka korrekt diagnos av sjukdom. Blanco et al. visade att molekylär analys är mycket känsliga, inte bara lönsamt Salmonella i kulturer, men också att partiell genomen och olönsamma eller döda bakterier från tidigare infektioner eller kontaminering26. Ny teknik bör därför utarbetas.
Här, beskrivit vi ett nya metoden att kombinerar NAAT metod och odling. Som visas i figur 1, denna nya metod gäller realtids-PCR screening först och sedan positiva prover skickas för bakterier kultur och identifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer de riktlinjer som fastställts av den mänskliga forskningsetisk kommittén av Zhuhai International Travel hälso-Center. Använd sterila standarddrift under experimentet.
1. kultur Media sammansättning och förberedelse
- Förbereda näringsämne buljong: Lös upp 1% pepton, 0,3% nöt extrakt, 0,5% natriumklorid, 0,1% glukos i H2O, justera pH till 7.5 och autoklav i 121 ° C under 15 minuter.
- Förbereda selenit cystin medium: Lös upp 0,5% pepton, 0,4% laktos, 1% Na2HCO3, 0,4% natrium väte selenit, 0,001% L-cystin i H2O, justera pH till 7,0 och koka den i 5 min.
- Förbereda Xylosen, lysin, deoxicholat agarplatta (XLD): Lös upp 0,3% jästextrakt, 0,5% L-lysin, 0,375% xylos, 0,75% laktos, 0,75% sackaros, 0,5% natriumklorid, 0,008% fenolrött, 0,68% natriumtiosulfat, 0,08% ferric ammoniumcitrat, 0,25% deoxicholat, 1,5% agar i H2O, och justera pH till 7,4. Sedan koka det i 5 min och häll det i 90 mm plattor.
- Förbereda Salmonella kromogen agarplattan: Lös upp 1,5% agar, 0,7% pepton och jäst extrakt, 1,29% selektiva reagens i H2O. Sedan koka det i 5 min och häll det i 90 mm plattor.
- Förbereda näringsagar plattan: Lös upp 1% pepton, 0,3% nöt extrakt, 0,5% natriumklorid, 1,5% agar i H2O och justera pH till 7,3. Sedan autoklav i 121 ° C i 15 min och häll det i 90 mm plattor.
- Förbereda den MacConkey-agarplattan (MAC): Lös upp 2% pepton, 1% laktos, 0,5% natriumklorid, 0,5% OX galla Salt 0.0025% Neutral röd, 1,5% agar, 0,0001% kristallviolett i H2O, och justera pH till 7,2. Sedan autoklav det i 115 ° C i 20 min och häll det i 90 mm plattor.
2. realtids-PCR
- Provsamling
- Infoga en anal pinnen i patientens anus 3-5 cm djupt, och rotera den 360° runt.
- Sätta anal pinnen till en steril samling rör. Markera prov-ID.
- Skicka provet till laboratoriet så snart som möjligt.
Obs: Prover kan lagras vid 4 ° C i mer än 24 h.
- Före berikning
- Tillsätt 3 mL näringsämne buljong i varje prov i samling röret.
- Inkubera vid 36 ° C i 6 h i en inkubator.
- Provet blandas (tillval)
- Samla 100 µL av varje före berikning kultur och blanda 8-10 prover av 1 exemplar i en 1,5 mL tub om det finns mer än 10 prover.
- Markera korrekt.
- DNA-extraktion
- Centrifugera före berikning kulturen vid 800 x g i 2 min att tillåta stora partiklar att bosätta sig och överför supernatanten till en ny tub och centrifugera vid 12 000 x g i 5 min. Tag bort supernatanten genom aspiration.
- Tillsätt 100 µL av DNA extraktionslösning (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) att pelleten. Vortex kraftigt i 1 min.
- Kokar vid 100 ° C i 5 minuter på en torr bad.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 5 min. samla supernatanten med hjälp av en ny tub, som kommer att vara mallen för den efterföljande realtids PCR-analysen.
- Realtids-PCR
- Setup reaktionsblandningen som följer: för varje prov, tillsätt 12,5 µL av 2 x reaktionsblandningen, 0,4 µM varje grundfärg, 0,2 µM varje sond (sekvenser i tabell 1)27, 5 µL av mallen som bereddes i steg 2.4.4 och använda ddH2O för att lägga till upp till 25 µL totala volym.
- Den cykling installationsprogram som följer: 95 ° C i 3 min, följt av 40 cykler av 95 ° C under 15 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C för 34 s. samla fluorescerande signaler från 6-karboxi-fluorescein (FAM) och Hexachlorofluorescein (HEX) kanaler vid töjning steg (72 ° C) automatiskt av fluorescerande realtids PCR-maskinen.
- Utföra realtids-PCR på en fluorescerande realtids PCR-maskin, enligt anvisningar av instrumentet.
- Gå direkt till Steg4 och utfärda negativa rapporter om negativa resultat uppstå på FAM/HEX-kanaler, vilket innebär att prover är negativa för Salmonella spp. /Shigella spp.
- Gå till steg 3.1 eller 3.2 om positiva resultat uppstå på HEX eller FAM kanaler, vilket innebär att provet kan vara positiva för Salmonella spp. och/eller Shigella spp., respektive.
Obs: Om provet blandning har utförts i steg 2,3, sedan realtids-PCR på enskilda prover som gjorde upp det positiva som bör utföras för att sålla bort de riktigt positivt provet.
3. guidade kultur
-
Salmonella spp. PCR-positivt prov
- Selektiv kultur i medium
- Tillsätt 100 µL av före berikning kultur i 5 mL selenit cystin medium i ett provrör. Inkubera vid 36 ° C för 18 – 24 h i en inkubator.
- Separera kultur på tallrik
- Samla en slinga av kulturen med en mikro-slinga och breds på en XLD platta eller Salmonella kromogen agarplatta. Inkubera vid 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
- Biokemiska identifiering
- Välj misstänkt koloni på XLD platta (rosa koloni med/utan mörka hjärta; mörk koloni; gula kolonin med/utan mörka hjärta) eller Salmonella kromogen agarplatta (lila eller prunosus koloni, slät och rund) (figur 2).
- Angående misstänkt koloni för biokemiska identifiering på automatiserade mikrobiell identifieringssystem, enligt anvisningar av instrumentet.
- Serologiska karakterisering
- O antigen karakterisering
- Tillsätt en droppe av O antigen polyvalenta sera på ett rent objektglas.
- Samla en slinga av kolonin med mikro-loop och grind i sera.
- Gå till steg 3.1.4.1.4 om det ser ut som flödar sand, vilket innebär att kolonin är reaktiva att sera (figur 3). Gå annars till steg 3.1.4.1.5.
- Använd O antigen monovalenta sera för att upprepa steg 3.1.4.1.1 till 3.1.4.1.3 tills den specifika O-antigenen kännetecknas.
- Använd Vi sera för att upprepa steg 3.1.4.1.1 till 3.1.4.1.3. Samla de Vi sera reaktiva kolonierna i ett rör och koka vid 100 ° C i 5 minuter i en torr bad. Centrifugera vid 12 000 x g i 5 min. samla pellet och upprepa steg 3.1.4.1.1 till 3.1.4.1.4 tills specifika O antigen kännetecknas.
- H-antigen karakterisering
- Tillsätt en droppe av H-antigen polyvalenta sera på ett rent objektglas.
- Samla en slinga av kolonin med mikro-loop och grind i sera.
- Gå till steg 3.1.4.2.4 om det ser ut som flödar sand, vilket innebär att kolonin är reaktiva till sera.
- Använd H antigen monovalenta sera för att upprepa steg 3.1.4.2.1 till 3.1.4.2.3 tills specifika H-antigenen kännetecknas.
Obs: Ibland serum induktion kan behövas att karakterisera den andra fas H-antigenen. Om så är fallet, bör sedan följande valfria steg utföras. - (Valfritt) Tillsätt en droppe av specifika H antigenet serum på näringsagar plattan. Vänta tills alla serum absorberas.
- (Valfritt) Samla en slinga av kolonin med en mikro-loop och spridning på plattan där specifika H antigenet serum absorberas. Inkubera vid 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
- (Valfritt) Använd H antigen monovalenta sera för att upprepa steg 3.1.4.2.1 till 3.1.4.2.3 tills andra fasen H-antigen kännetecknas.
- Gå till steg 4.
- O antigen karakterisering
- Selektiv kultur i medium
-
Shigella spp. PCR-positivt prov
- Separera kultur på tallrik
- Samla en slinga av före berikning kulturen med en mikro-slinga och breds på en XLD platta eller MAC platta. Inkubera vid 36 ° C för 18 – 24 h i en inkubator.
- Biokemiska identifiering
- Samla in misstänkta koloni på XLD platta (släta, runda, genomskinliga och röda koloni) eller MAC platta (släta, runda, genomskinliga och färglösa koloni med 2-3 mm i diameter; Shigella sonnei kan vara större och bli till ljus rosa som förlängning av inkubationstiden) (figur 4).
- Angående misstänkt koloni för biokemiska identifiering på automatiserade mikrobiell identifieringssystem, enligt anvisningar av instrumentet.
- Serologiska karakterisering
- Tillsätt en droppe av Shigella spp. polyvalenta sera på ett rent objektglas.
- Samla en slinga av kolonin med mikro-loop och grind i sera.
- Gå till steg 3.2.3.4 om det ser ut som flödar sand, vilket innebär att kolonin är reaktiva till sera.
- Använd Shigella spp. monovalenta sera för att upprepa steg 3.2.3.1 till 3.2.3.3 tills särskilda Shigella spp. kännetecknas.
- Gå till steg 4.
- Separera kultur på tallrik
4. rapport
- Utfärda positiva eller negativa rapporter enligt ovanstående resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet har tillämpats för screening av Salmonella spp. /Shigella spp. i anal pall prover från människor som skulle hantera mat och vatten.
I real-time PCR-steg, som visas i figur 5A, var det en framgångsrik amplifiering i HEX kanal, vilket innebar att blandade provet var positiva för Salmonella spp. Sedan utfördes en realtids-PCR på enskilda prover som gjorde upp en positiv. Som visas i figur 5B, var prov 2 positiv. Därför valdes prov 2 för guidade kulturen av Salmonella spp. I figur 5Cfanns det en framgångsrik amplifiering i FAM kanalen, vilket innebar att blandade provet var positivt för Shigella spp. Då en realtids-PCR utfördes och prov 10 befanns vara positiv (figur 5D). Därför valdes prov 10 för den guidade kulturen av Shigella spp.
I guidade kultur av Salmonella spp. fanns rosa kolonier och lila kolonier på XLD och Salmonella kromogen agar plåt, separat, som visas i figur 2. Sedan utsattes dessa kolonier för biokemiska identifiering på automatiserade mikrobiell identifieringssystem. Resultaten visade att det var Salmonella spp., med arter okänd. Serologiska karakterisering var därför utförs (figur 3) och det var reaktiv till O4, O12, Hb, H1, 2. Enligt White-Kauffmann-Le mindre schema, var prov 2 slutligen rapporteras positiva för Salmonellaparatyphi B. Medan för de guidade kulturen av Shigella spp., fanns det rosa röd och färglösa kolonier på XLD och MAC plåt, separat, som visas i figur 4. Sedan utsattes dessa kolonier också för biokemiska identifiering på automatiserade mikrobiell identifieringssystem. Resultaten visade att det var Shigella sonnei. För att bekräfta dess specifika serotyp, serologiska karakterisering var utförda (figur 3) och det var reaktiv till sonnei fas II. Därför var prov 10 slutligen rapporteras som positiva för Shigella sonnei fas II.
Figur 1 : Diagrammet av protokollet. Två stora steg var visas och avgränsade med streckad linje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa kultur resultat av Salmonella spp. på XLD och Salmonella kromogen agar plåt. På XLD tallrik, det fanns rosa kolonier med/utan mörka hjärta, medan på Salmonella kromogen agarplatta, fanns det lila kolonier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativ serologisk karakterisering resultatet. Om kolonin var reaktiv till sera, det såg ut som flödar sand (vänster). Annars var det grumligt (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa kultur resultaten av Shigella spp. på XLD och MAC plåt. På XLD plattan, var det röd kolonier, medan på MAC tallrik, fanns det genomskinliga och färglösa kolonier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa realtids PCR resultat. (A), HEX kanal för blandning prover. (B), HEX kanal för enskilda prover. (C), FAM kanal för blandning prover. (D), FAM kanal för enskilda prover. PC: positiv kontroll. NC: negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Patogenen | Namn | Sequence(5'-3') |
| Salmonella | Sal-F Sal-R Sal-probe |
gctcatattaattccggcatttac caggtcaatagccagaaagg HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse |
| Shigella | Shi-F Shi-R Shi-probe |
ccgggataaagtcagaactc cagtggagagctgaagtttc FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse |
Tabell 1: Primers och sonder används. Namn och sekvenser av primers och sonder tillhandahölls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sedan Salmonella spp. /Shigella spp. förknippas ofta med matförgiftning och fekal-oral överföring av akut gastroenterit28,29 och rutinmetoden är antingen arbetsintensiva eller tidskrävande 7, beskriver vi en hög genomströmning plattform efter Salmonella spp. /Shigella spp. screening, med realtids-PCR kombinerat med guidade kultur.
I området i närheten finns det flera åtgärder som måste beaktas att maximera kapaciteten hos denna plattform. Den första är steget före berikning av prover i näringsämne buljong (steg 2.2). Även om ingen före berikning steg som behövs för avföringsprov samlas in från de patienterna med tydliga symtom, såsom diarré, etc., behövs en allmän 6 h före berikning steg fortfarande för anal svabbar, när samlas in under före anställningen fysisk undersökning för människor som vill hantera mat och vatten, som dessa människor var främst frisk eller åtminstone asymtomatiska vuxna. Om protokollet tillämpades endast för detektion av Salmonella spp., kunde sedan före berikning genomföras i selenit cystin medium för att öka känsligheten. Den andra kritiska steget är identifiering av misstänkta kolonier (steg 3.1.3.1 och 3.2.2.1). Det finns många störande bakgrund flora i de avföringsprov som kan maskera detektering och isolering av målet patogener30. Kännetecken av de misstänkta kolonierna som definieras i steg 3.1.3.1 och 3.2.2.1 bör därför hållas i åtanke under experimentet. Den tredje kritiska steget är serologisk karakterisering av Salmonella spp. Eftersom en majoritet av Salmonella spp. innehåller en andra fas för H-antigen31, behöver serum induktion utföras. Dock serum induktion är inte alltid framgångsrik, och flera omgångar av induktion kan behövas för att avgöra den rätta andra H-fasen.
Protokollet är mycket specifika och känsliga som kontrolleras av vår tidigare studie27. Hög specificitet i protokollet framgår av sin förmåga, i vilken Salmonella spp. /Shigella spp. kan särskiljas från andra relaterade patogener27. Den nedre detektionsgräns av protokollet är 104 CFU/mL och 103 CFU/mL för Salmonella spp. och Shigella spp., respektive27, som är jämförbara med tidigare rapporter7,32 , 33 , 34. som vi sagt ovan, Salmonella spp. upptäckt känslighet kan ökas ytterligare med selenit cystin före berikning om protokollet tillämpades endast för detektion av Salmonella spp. Dessutom protokollet kunde öka andelen positiva av två veck och minska arbetsbelastningen/medianen turnaround tid betydligt27.
Liknar andra NAAT analyser, en stor begränsning av protokollet, jämfört med klassiska bakterier kultur metod, är att protokollet bara kunde identifiera Salmonella spp. /Shigella spp., medan andra vanliga diarré-bakterier är utelämnas7. Under klassiska bakterier kultur, kunde däremot dessa bakterier identifieras parallellt om de fanns. En annan begränsning i protokollet är att några av Salmonella spp. /Shigella spp. kunde inte identifieras av realtids PCR på grund av sekvens variationer27. Men om negativa realtids PCR-resultat visas för dessa prover från patienter med tydliga kliniska symtom, laboratorietekniker bör uppmärksamma och kan utföra andra experiment för att bekräfta resultaten. Under ett stort utbrott, kan vi använda ett enda prov istället för samlingsprover för den första omgången av PCR-screening.
Sammanfattningsvis, det protokoll som anges här kan tjäna som en värdefull plattform för screening av Salmonella spp. /Shigella spp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av vetenskapen och teknik programmet i Zhuhai, Kina (grant nummer 20171009E030064), vetenskapen och teknik programmet av Guangdong, Kina (grant nummer 2015A020211004) och vetenskap och teknik programmet av allmän Administration av Quality Supervision, Inspection and Quarantine av folkets republik av Kina (grant nummer 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
References
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
