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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella SPP /Shigella spp. sind häufige Erreger Durchfall zugeschrieben. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp., mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.

Abstract

Fäkal-orale Übertragung von akuter Gastroenteritis tritt von Zeit zu Zeit, vor allem, wenn Menschen, die Nahrung und Wasser behandelt von Salmonella spp./Shigella SPP infiziert sind Die Goldstandard-Methode zum Nachweis von Salmonella spp./Shigella SPP ist direkte Kultur, aber das ist arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für Salmonella spp./Shigella spp., screening, mittels Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kombiniert mit geführten Kultur. Es gibt zwei wichtige Phasen: Real-Time PCR und die geführte Kultur. Für die erste Stufe (Real-Time PCR) Wir erklären jeden Schritt der Methode: Sammlung, Voranreicherung, DNA-Extraktion und Real-Time PCR zu probieren. Wenn das Real-Time PCR-Ergebnis positiv ist, dann die zweite Stufe (geführte Kultur erfolgt): selektive Kultur, biochemische Identifizierung und serologischen Charakterisierung. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse daraus generiert. Das hier beschriebene Protokoll wäre eine wertvolle Plattform für die schnelle, konkrete, sensible und Hochdurchsatz-Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Introduction

Durchfall ist immer noch ein häufiges Gesundheitsproblem mit einer hohen Inzidenz bewerten weltweit1,2. Obwohl die Sterblichkeit relativ niedrig ist, einige Patienten zeigen verschiedene Symptome wochenlang (z. B. lose und wässrige Stühle, dringend auf die Toilette gehen), die machen die sozioökonomischen Auswirkungen sehr hoch3,4. Noch gravierender ist, können einige Patienten sogar Reizdarm-Syndrom entwickeln, bleibt unbehandelt5. Es gibt verschiedene Arten von Bakterien, Viren und Parasiten, die Durchfall6verursachen können. Salmonella SPP /Shigella spp. gehören zu den häufigsten Bakterien für die Übertragung von akuter Gastroenteritis7,8,9,10,11. Daher haben viele Landkreise veröffentlicht, Gesetze oder Verordnungen für regelmäßige Salmonella SPP /Shigella spp. screening unter Menschen, die Nahrung und Wasser umgehen würden. Zum Beispiel haben die chinesische Regierung erließ Gesetze für obligatorische Salmonella SPP /Shigella spp. screening jährlich.

Der Gold-Standard-Methode für Salmonella SPP /Shigella spp. Erkennung ist Bakterienkultur. Durch Bakterienkultur und aufeinander folgenden biochemische Identifizierung und serologischen Charakterisierung identifizieren wir die Spezies von Bakterien, die das Krankheitsmanagement Ausbruch und antimikrobielle profiling zur Unterstützung der Behandlung von Patienten erleichtert 12. es könnte auch helfen, die Quelle der Infektion während der Salmonella SPP verfolgen /Shigella spp. Ausbruch13. Diese Methode ist jedoch arbeitsintensiv (erfordern manuelle Bedienung) und zeitaufwändig (wobei mehrere Tage), vor allem für das Testen einer großen Anzahl von Proben7. Darüber hinaus lebensfähig aber nicht kultivierbarer (VBNC) Salmonella SPP /Shigella spp.möglicherweise gibt es in einigen Stuhlproben14. Angesichts dieser Nachteile haben viele Labors versucht, neue Techniken zum Nachweis von Salmonella SPP entwickeln /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. all diese Methoden verwenden nuklearen saure Verstärkung Test (NAAT), unter denen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die häufigste ist. Eine wichtige Einschränkung dieser NAAT basierte Methoden ist, dass tote Bakterien, auch bakterielle Verunreinigungen enthält unvollständige genomischer DNA, positive Ergebnisse26, zeigen konnte, die vor allem die genaue Diagnose der Krankheit beeinflussen könnten. Blanco Et Al. zeigten, dass molekulare Tests sehr empfindlich, nicht nur für tragfähige Salmonellen in Kulturen, sondern auch mit teilweise Genomen und tot oder nicht lebensfähig Bakterien aus vergangenen Infektionen oder Kontamination26ist. Daher sollten neuer Technologien entwickelt werden.

Wir hier eine neuartige Methode, verbindet die NAAT Methode und Kultivierung basiert. Wie in Abbildung 1dargestellt, diese neue Methode gilt Real-Time PCR erste screening und positive Proben werden für die Bakterienkultur und Identifikation gesendet.

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Protocol

Das Protokoll folgt die Richtlinien der Humanforschung Ethikkommission von Zhuhai International Travel Healthcare Center. Bitte verwenden Sie sterile Standardbetrieb während des Experiments.

(1) Kultur Medienkomposition und Vorbereitung

  1. Nährbouillon vorbereiten: Auflösen, 1 % Pepton, 0,3 % Rindfleisch-Extrakt, Natriumchlorid 0,5 %, 0,1 % Glukose in H2O, justieren pH 7,5 und Autoklaven in 121 ° C für 15 Minuten.
  2. Bereiten Sie Selenit Cystin Medium: auflösen 0,5 % Pepton, Wasserstoff Natriumselenit 0,4 % 0,4 % Laktose, 1 % Na2HCO30,001 % L-Cystin in H2O, pH-Wert auf 7,0 einstellen und für 5 min kochen.
  3. Vorbereiten der Xylose, Lysin, Deoxycholate Nährbodenplatte (XLD): auflösen 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % L-Lysin, 0.375 % Xylose, 0,75 % Laktose, 0,75 % Saccharose, 0,5 % Natrium-Chlorid, 0,008 % Phenol rot, 0,68 % Natriumthiosulfat, 0,08 % Ammonium ferric Citrat, Natrium 0,25 % Deoxycholate, 1,5 % Agar in H2O, und pH auf 7,4 einstellen. Dann für 5 min kochen Sie und gießen Sie sie in 90 mm Platten.
  4. Die Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte Vorbereitung: Auflösen von 1,5 % Agar, 0,7 % Pepton und Hefe-Extrakt, 1,29 % selektive Reagenzien in H2O. Dann für 5 min kochen Sie und gießen Sie sie in 90 mm Platten.
  5. Vorbereiten die Nähragar Platte: auflösen, 1 % Pepton, 0,3 % Rindfleisch-Extrakt, 0,5 % Natrium-Chlorid, 1,5 % Agar in H2O, und passen Sie pH bis 7.3. Dann Autoklav in 121 ° C für 15 min und gießen Sie sie in 90 mm Platten.
  6. Vorbereiten die MacConkey-Agar (MAC)-Platte: auflösen 2 % Pepton, 1 % Laktose, Natriumchlorid 0,5 %, 0,5 % OX Galle Salz, 0,0025 % Neutral rot, 1,5 % Agar, 0,0001 % Kristallviolett in H2O, und pH-Wert auf 7,2 einstellen. Dann Autoklav in 115 ° C für 20 min und gießen Sie sie in 90 mm Platten.

(2) Real-Time PCR

  1. Entnahme von Proben
    1. Legen Sie eine anal Tupfer in der Patientin Anus 3-5 cm tief, und drehen Sie ihn um 360°.
    2. Setzen Sie den analen Tupfer in eine sterile Sammelröhrchen. Mark Probe-ID.
    3. Senden Sie die Probe so schnell wie möglich ins Labor.
      Hinweis: Proben konnten bei 4 ° C nicht mehr als 24 Stunden gelagert werden.
  2. Voranreicherung
    1. 3 mL Nährstoff Bouillon in jeder Probe in dem Sammelrohr hinzugeben.
    2. Bei 36 ° C für 6 Stunden in einem Inkubator inkubieren.
  3. Probe mischen (optional)
    1. Sammeln Sie 100 µL jeder Voranreicherung Kultur und ein 1,5 mL-Tube untermischen Sie 8-10 Proben 1 Probe, gibt es mehr als 10 Proben.
    2. Markieren Sie richtig.
  4. DNA-Extraktion
    1. Zentrifugieren der Voranreicherung Kultur 800 X g für 2 min erlauben große Partikel, sich niederzulassen, und Übertragung der Überstand auf eine neue Röhre und Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min. verwerfen des Überstands durch Absaugen.
    2. Fügen Sie 100 µL DNA-Extraktion-Lösung (0,01 M pH 8.0 Tris-EDTA, 0,01 % Nonidet P 40 (NP40)) zum Pellet. 1 min. kräftig vortexen.
    3. Kochen Sie bei 100 ° C für 5 min auf ein Trockenbad.
    4. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min. sammeln des Überstands mit eine neue Röhre, die die Vorlage für die nachfolgenden Echtzeit-PCR-Analyse werden.
  5. Real-Time PCR
    1. Richten Sie das Reaktionsgemisch als folgen: für jede Probe hinzufügen 12,5 µL 2 x Reaktionsgemisch, 0,4 µM jeweils Fibel, 0,2 µM pro Sonde (Sequenzen in Tabelle 1)27, 5 µL der Vorlage in Schritt 2.4.4 vorbereitet und DdH2O um insgesamt bis zu 25 µL hinzuzufügen Volumen.
    2. Der Radsport Setupprogramm wie folgt: 95 ° C für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 34 S. sammeln fluoreszierende Signale aus 6-Carboxy-Fluorescein (FAM) und Hexachlorofluorescein (HEX) Kanäle bei der Dehnung Schritt (72 ° C) automatisch durch die fluoreszierenden Echtzeit-PCR-Maschine.
    3. Führen Sie Real-Time PCR auf einer fluoreszierenden Echtzeit-PCR-Maschine gemäß den Anweisungen des Gerätes.
    4. Gehen Sie direkt zu Schritt 4 und negative Berichte, wenn negative Ergebnisse, auf die FAM/HEX-Kanäle, was bedeutet auftreten, dass Proben sind negativ für Salmonella SPP /Shigella spp.
    5. Gehen Sie zu Schritt 3.1 oder 3.2, wenn positive Ergebnisse auftreten auf die HEX und/oder FAM Kanäle, was bedeutet, dass die Probe bzw. für Salmonella SPP und/oder Shigella spp., positiv sein kann.
      Hinweis: Wenn Probe mischen im Schritt 2.3 durchgeführt wurde, sollte Real-Time PCR auf einzelne Proben, die einerseits positive gebildet durchgeführt werden, die echte positive Probe auf dem Bildschirm.

(3) geführte Kultur

  1. Salmonella spp. PCR positiven Probe
    1. Selektive Kultur in medium
      1. Fügen Sie 100 µL Voranreicherung Kultur in 5 mL Medium Selenit Cystin in einem Reagenzglas. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
    2. Trennung von Kultur auf Platte
      1. Eine Schleife der Kultur mit einer Mikro-Schleife zu sammeln und auf XLD Teller oder Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte verteilt. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
    3. Biochemische Identifizierung
      1. Wählen Sie verdächtige Kolonie auf XLD-Teller (rosa Kolonie mit/ohne dunkle Herz, dunkle Kolonie, gelbe Kolonie mit/ohne dunkle Herz) oder Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte (lila oder Prunosus Kolonie, glatt und rund) (Abbildung 2).
      2. Thema verdächtige Kolonie für biochemische Identifikation auf automatisierte mikrobielle Identifikations-System gemäß den Anweisungen des Gerätes.
    4. Serologischen Charakterisierung
      1. O Antigen Charakterisierung
        1. Geben Sie einen Tropfen des O Antigen polyvalent Sera in eine saubere Folie.
        2. Eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und Schleifen im Sera zu sammeln.
        3. Gehen Sie zu 3.1.4.1.4 Schritt, wenn es wie fließenden Sand aussieht, was bedeutet, dass die Kolonie reaktiv auf die Sera (Abbildung 3). Fahren Sie andernfalls mit Schritt 3.1.4.1.5.
        4. Verwenden Sie O Antigen monovalente Seren, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.1.1, 3.1.4.1.3 bis das O Antigen gekennzeichnet ist.
        5. Verwenden Sie Vi Sera 3.1.4.1.1, 3.1.4.1.3 Schritte wiederholen. Diese Vi Sera reaktive Kolonien in einem Rohr zu sammeln und kochen bei 100 ° C für 5 min in ein Trockenbad. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min. sammeln die Pellets und wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.1.1, 3.1.4.1.4, bis O-spezifisches Antigen gekennzeichnet ist.
      2. H-Antigen-Charakterisierung
        1. Geben Sie einen Tropfen des H Antigen polyvalent Sera in eine saubere Folie.
        2. Eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und Schleifen im Sera zu sammeln.
        3. Gehen Sie zu 3.1.4.2.4 Schritt, wenn es wie fließenden Sand aussieht, was bedeutet, dass die Kolonie der Sera reaktiv ist.
        4. Verwenden Sie H Antigen monovalente Seren, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.2.1, 3.1.4.2.3 bis H-spezifisches Antigen gekennzeichnet ist.
          Hinweis: Manchmal kann Serum Induktion benötigt, um die zweite Phase H-Antigen zu charakterisieren. Wenn ja, sollten die folgenden optionalen Schritte durchgeführt werden.
        5. (Optional) Geben Sie einen Tropfen des spezifischen H Antigen Sera auf Nähragar Teller. Warten Sie, bis alle Seren absorbiert werden.
        6. (Optional) Sammeln Sie eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und die Ausbreitung auf den Teller, wo bestimmte H Antigen Sera absorbiert werden. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
        7. (Optional) Verwenden Sie H Antigen monovalente Seren, wiederholen Sie die Schritte 3.1.4.2.1, 3.1.4.2.3 bis zweite Phase H Antigen gekennzeichnet ist.
        8. Gehen Sie zu Schritt 4.
  2. Shigella spp. PCR positiven Probe
    1. Trennung von Kultur auf Platte
      1. Eine Schleife der Voranreicherung Kultur mit einer Mikro-Schleife zu sammeln und auf einem XLD Teller oder MAC Platte verteilt. Bei 36 ° C für 18-24 h in einem Inkubator inkubieren.
    2. Biochemische Identifizierung
      1. Sammeln Sie verdächtige Kolonie auf XLD Platte (glatt, rund, transparent und rote Kolonie) oder MAC Platte (glatt, rund, transparent und farblos Kolonie mit 2-3 mm im Durchmesser; Shigella Sonnei kann größer sein und schalten Licht rosa wie die Dehnung der Inkubationszeit) (Abbildung 4).
      2. Thema verdächtige Kolonie für biochemische Identifikation auf automatisierte mikrobielle Identifikations-System gemäß den Anweisungen des Gerätes.
    3. Serologischen Charakterisierung
      1. Geben Sie einen Tropfen des Shigella spp. polyvalent Sera in eine saubere Folie.
      2. Eine Schleife der Kolonie mit einem Mikro-Schleife und Schleifen im Sera zu sammeln.
      3. Gehe zu 3.2.3.4 Schritt, wenn es wie fließenden Sand aussieht, was bedeutet, dass die Kolonie der Sera reaktiv ist.
      4. Verwenden Sie Shigella spp. monovalente Seren 3.2.3.1 zu 3.2.3.3 Schritte wiederholen, bis bestimmte Shigella spp. geprägt ist.
      5. Gehen Sie zu Schritt 4.

(4) Bericht

  1. Positive oder negative Berichte nach den oben genannten Ergebnissen.

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Representative Results

Das Protokoll wurde für das Screening von Salmonella spp. angewendet /Shigella spp. in anal Hocker Beispiele von Menschen, die Nahrung und Wasser umgehen würden.

In der Real-Time PCR-Schritt wie in Abbildung 5A, gab es eine erfolgreiche Verstärkung im HEX-Kanal, was bedeutete, dass die gemischte Probe positiv für Salmonella SPP war. Dann wurde eine weitere Real-Time PCR auf einzelne Samples durchgeführt, was derjenige positiv ausmachte. Wie in Abbildung 5Bgezeigt, war Probe 2 positiv. Daher wählte man Beispiel 2 für die geführte Kultur von Salmonella spp. In Abbildung 5Cgab es eine erfolgreiche Verstärkung in der FAM-Kanal, was bedeutete, dass die gemischte Probe positiv für Shigella SPP war. Dann eine weitere Real-Time PCR durchgeführt wurde und Probe 10 erwies sich als positiv sein (Abbildung 5D). Daher wählte man Probe 10 für die geführte Kultur von Shigella spp.

In der geführten Kultur von Salmonella spp. gab es rosa Kolonien und violette Kolonien auf XLD Teller und Salmonellen chromogenen Agarplatte, separat, wie in Abbildung 2dargestellt. Dann wurden diese Kolonien biochemische Identifikation auf automatisierte mikrobielle Identifikationssystem unterzogen. Ergebnisse zeigten, dass Salmonella spp., mit unbekannten Spezies war. Daher war serologischen Charakterisierung durchgeführt (Abb. 3) und es war reaktiv, O4, O12, Hb, H1, 2. Nach dem Minor White-Kauffmann-Le Schema wurde Probe 2 schließlich als positiv für Salmonella Paratyphi Bgemeldet. Während der geführten Kultur Shigella spp., gab rosa rote und farblose Kolonien auf XLD Platte und MAC Platte separat, wie in Abbildung 4dargestellt. Diese Kolonien wurden dann auch biochemische Identifikation auf automatisierte mikrobielle Identifikationssystem unterzogen. Ergebnisse zeigten, dass es Shigella Sonnei. Zur Bestätigung seiner spezifischen Serotyp serologischen Charakterisierung wurde durchgeführt (Abb. 3) und es war reaktiv zu Sonnei Phase II. Daher wurde Probe 10 schließlich als positive Shigella SonneiPhase II gemeldet.

Figure 1
Abbildung 1 : Das Diagramm des Protokolls. Zwei wesentliche Schritte wurden gezeigt und durch gestrichelte Linie getrennt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative Kultur Ergebnisse von Salmonella spp. auf XLD Teller und Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte. Auf XLD Teller gab es rosa Kolonien mit/ohne dunkle Herz, während auf Salmonellen chromogenen Nährbodenplatte gab es violette Kolonien. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative serologischen Charakterisierung Ergebnis. Wenn die Kolonie reaktiv auf die Sera war, sah es wie fließenden Sand (links). Ansonsten war es trübe (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Repräsentative Kultur Ergebnisse von Shigella SPP auf XLD Platte und MAC Platte. Auf XLD Teller gab es rote Kolonien, während auf MAC Platte gab es transparente und farblose Kolonien. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Repräsentative Echtzeit-PCR-Ergebnisse. (A) HEX Kanal für Mischung Proben. (B) HEX-Kanal für Einzelproben. (C) FAM-Kanal für Mischung Proben. (D) FAM-Kanal für Einzelproben. PC: positiv-Kontrolle. NC: Negativkontrolle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Erreger Name Sequence(5'-3')
Salmonellen Sal-F
Sal-R
Sal-Sonde		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-Ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse
Shigella Shi-F
Shi-R
Shi-Sonde		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-Aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse

Tabelle 1: Primer und Sonden verwendet. Den Namen und die Sequenzen der Primer und Sonden wurden zur Verfügung gestellt.

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Discussion

Seit Salmonella SPP /Shigella spp. sind oft verbunden mit Lebensmittelvergiftung und fäkal-orale Übertragung von akuter Gastroenteritis28,29 und die Routine-Methode ist entweder arbeitsintensiv und zeitaufwändig 7, beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für Salmonella SPP /Shigella spp. Screening mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.

Es gibt mehrere Schritte, die Rücksicht auf die Fähigkeit, diese Plattform zu maximieren. Die erste ist die Voranreicherung Schritt der Proben in Nährstoff Brühe (Schritt 2.2). Obwohl keine Voranreicherung Schritt für Stuhlproben von Patienten mit offensichtlichen Symptomen wie Durchfall, etc., gesammelt benötigt wird ist ein allgemeine 6 h Voranreicherung Schritt noch für anal Abstrichproben erforderlich, wenn während der berufsvorbereitende gesammelt körperliche Untersuchung für Menschen, die Nahrung und Wasser, behandeln würde, wie diese Menschen vor allem gesund oder zumindest asymptomatischen Erwachsenen waren. Wenn das Protokoll nur für den Nachweis von Salmonella spp. angewendet wurde, könnte dann Voranreicherung Selenit Cystin Medium durchgeführt werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Der zweite wichtige Schritt ist die Identifizierung der verdächtigen Kolonien (Schritt 3.1.3.1 und 3.2.2.1). Gibt es viele störende Hintergrund Flora in Stuhlproben, die die Entdeckung und Isolierung von Ziel Krankheitserreger30verdecken können. Daher sollte das Merkmal der verdächtigen Kolonien in definierten Schritt 3.1.3.1 und 3.2.2.1 während des Experiments im Auge behalten werden. Der dritte entscheidende Schritt ist die serologischen Charakterisierung von Salmonella spp. Da eine Mehrheit von Salmonella spp. enthalten eine zweite Phase für H-Antigen-31, muss Serum Induktion durchgeführt werden. Jedoch die Serum-Induktion ist nicht immer erfolgreich, und mehrere Runden der Induktion erforderlich sein, um die richtige zweite H-Phase zu bestimmen.

Das Protokoll ist sehr spezifisch und sensitiv wie von unseren vorherigen Studie27überprüft. Die hohe Spezifität des Protokolls beweist durch seine Fähigkeit, in welche Salmonella SPP /Shigella spp. von anderen verwandten Erreger27unterschieden werden könnte. Die untere Grenze der Erkennung des Protokolls ist 104 KBE/mL und 103 KBE/mL für Salmonella SPP und Shigella spp., bzw.27, die vorherigen Berichte7,32 vergleichbar sind , 33 , 34. wie wir bereits erwähnt, die Nachweisempfindlichkeit Salmonella spp. konnte weiter gesteigert werden Selenit Cystin Voranreicherung wenn das Protokoll galt nur für den Nachweis von Salmonella spp. Darüber hinaus könnte das Protokoll erhöhen die positive Rate von zwei Falten und verringern den Arbeitsaufwand/Median Turnaround Zeit deutlich27.

Ähnlich wie bei anderen NAAT-Assays, eine erhebliche Einschränkung des Protokolls, wenn im Vergleich zu klassischen Bakterien-Kultur-Methode ist, dass das Protokoll nur Salmonella SPP identifizieren könnte /Shigella spp., während andere gemeinsame Durchfall verursachende Bakterien sind 7ausgelassen. Im Gegensatz dazu konnte bei klassischen Bakterienkultur, die Bakterien parallel identifiziert werden, wenn sie existierten. Eine weitere Einschränkung des Protokolls ist, dass einige der Salmonella SPP /Shigella spp. konnten nicht identifiziert werden, durch die Real-Time PCR durch Sequenz Variationen27. Jedoch wenn negative PCR-Ergebnisse in Echtzeit für die Proben von Patienten mit offensichtlichen klinischen Symptome erscheinen, Laboranten sollten darauf achten und andere Experimente um die Ergebnisse zu bestätigen. Bei einem großen Ausbruch können wir ein einzelnes Beispiel für die erste Runde der PCR-Screening statt Mischproben verwenden.

Abschließend könnte das Protokoll hier zur Verfügung gestellten dienen als wertvolle Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Wissenschaft und Technologie-Programm von Zhuhai, China (Grant Nummer 20171009E030064), die Wissenschaft und Technologie-Programm von Guangdong, China (Grant Nummer 2015A020211004) und Wissenschaft und Technologie-Programm von General Administration unterstützt. der Quality Supervision, Inspektion und Quarantäne der Volksrepublik China (Grant Nummer 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

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References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

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Immunologie und Infektion Ausgabe 141 akute Gastroenteritis, Salmonella spp. Shigella spp. screening Real-Time PCR Kultur geführt
Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von <em>Salmonella</em> spp. /<em>Shigella</em> spp.
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Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

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