Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella spp. /Shigella spp. er vanlige patogener til diaré. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming plattform for screening av Salmonella spp. /Shigella spp. bruker sanntid PCR kombinert med guidede kultur.

Abstract

Fecal-muntlige overføring av akutt gastroenteritt skjer fra tid til annen, spesielt når folk som behandlet mat og vann er smittet av Salmonella spp./Shigella spp. Metoden gullstandarden for påvisning av Salmonella spp./Shigella spp. er direkte kultur, men dette er arbeidskrevende og tidkrevende. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming plattform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, ved hjelp av sanntids polymerasekjedereaksjons (PCR) kombinert med guidede kultur. Det er to store stadier: sanntid PCR og guidede kultur. For det første trinnet (sanntid PCR) vi forklare hvert trinn av metoden: prøve samling, pre berikelse, DNA utvinning og sanntid PCR. Hvis sanntid PCR resultatet er positiv, så den andre fasen (guidet kultur) utføres: selektiv kultur, biokjemisk identifisering og serologisk karakterisering. Vi illustrerer også representant resultatene fra den. Protokoll beskrevet her kan være en verdifull plattform for rask, bestemte, følsom og høy gjennomstrømming screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Introduction

Diaré er fortsatt en vanlig sunnhet problem med en høy forekomst rate globalt1,2. Om dødeligheten er relativt lav, noen pasienter viser ulike symptomer i uker (for eksempel løs og vannaktig avføring, et haster å gå på do), som gjør sosioøkonomiske innvirkning svært høy3,4. Mer alvorlig, noen pasienter kan selv utvikle irritabel tarm hvis venstre ubehandlet5. Det finnes ulike typer bakterier, virus og parasitter som kan forårsake diaré6. Salmonella spp. /Shigella spp. er blant de vanligste bakteriene for overføring av akutt gastroenteritt,7,,8,,9,,10,,11. Derfor mange fylker har utstedt lover eller forskrifter for vanlige Salmonella spp. /Shigella spp. screening blant folk som skulle håndtere mat og vann. For eksempel den kinesiske regjeringen har utstedt lover for obligatoriske Salmonella spp. /Shigella spp. screening en gang i året.

Metoden gullstandarden for Salmonella spp. /Shigella spp. gjenkjenning er bakterier kultur. Gjennom bakterier kultur og påfølgende biokjemisk identifisering og serologisk karakterisering, kan vi identifisere arter av bakterier, som kan lette sykdom utbrudd ledelse og antimikrobielle profilering hjelp behandlingen av pasienter 12. det kan også hjelpe spore smittekilden under Salmonella spp. /Shigella spp. utbruddet13. Denne metoden er imidlertid arbeidskrevende (krever manuell drift) og tidkrevende (ta flere dager), spesielt for testing av store antall prøver7. Videre levedyktig men ikke-culturable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kan finnes i noen avføringsprøver14. I lys av disse ulempene, mange laboratorier har forsøkt å utvikle nye teknikker for påvisning av Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. alle disse metodene bruk kjernefysiske syre forsterkning testen (NAAT), blant annet polymerasekjedereaksjons (PCR) er den vanligste. Ettall større begrensningen av metodene NAAT basert er at døde bakterier, selv bakteriell rusk som inneholder ufullstendig genomisk DNA, kan positive resultater26, som kan i stor grad påvirke den nøyaktig diagnosen av sykdommen. Blanco et al. viste at molekylær analysen er svært følsom, ikke bare levedyktig Salmonella i kulturer, men også delvis genomer og død eller unviable bakterier fra siste infeksjoner eller forurensning26. Derfor bør ny teknologi utvikles.

Her beskrev vi en roman metode som kombinerer NAAT basert metode og dyrking. Som vist i figur 1, denne nye metoden gjelder sanntid PCR screening først og deretter positiv eksemplene sendes for bakterier kultur og identifikasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen følger retningslinjene som er angitt av menneskelig forskning etikk av Zhuhai International Travel Healthcare Center. Bruk standard steril operasjonen under eksperimentet.

1. kultur medier sammensetningen og utarbeidelse

  1. Forbered næringsrike kjøttkraft: Oppløse 1% pepton, 0,3% biff ekstrakt, 0,5% natriumklorid, 0,1% glukose i H2O, justere pH 7.5 og autoklav i 121 ° C i 15 min.
  2. Forberede selenitt Cystine medium: oppløse 0,5% pepton, 0,4% laktose, 1% Na2HCO3, 0,4% natrium hydrogen selenitt, 0,001% L-Cystine i H2O, justere pH 7.0 og koke den for 5 min.
  3. Forberede Xylose, lysin, Deoxycholate agar (XLD) plate: oppløsning 0,3% gjærekstrakt, 0,5% L-lysin, 0.375% xylose, 0,75% laktose, 0,75% sukrose, 0,5% natriumklorid, 0.008% fenol red, 0,68% natrium tiosulfat, 0,08% ammonium ferric citrate, 0,25% natrium deoxycholate, 1,5% agar i H2O, og justere pH 7,4. Deretter koke den for 5 min og hell den i 90 mm plater.
  4. Forbereder Salmonella kromogent agar platen: oppløse 1,5% agar, 0,7% pepton og gjær ekstrakt, 1,29% selektiv reagens i H2O. Deretter koke den for 5 min og hell den i 90 mm plater.
  5. Forbereder næringsstoffer agar platen: oppløse 1% pepton, 0,3% biff ekstrakt, 0,5% natriumklorid, 1,5% agar i H2O, og justere pH til 7.3. Deretter autoklav i 121 ° C i 15 min og hell den i 90 mm plater.
  6. Forbereder MacConkey agar (MAC) platen: oppløse 2% pepton, 1% laktose, 0,5% natriumklorid, 0,5% okse galle Salt, 0.0025% nøytral rød, 1,5% agar, 0,0001% crystal violet i H2O, og justere pH til 7.2. Deretter autoklav i 115 ° C for 20 min og hell den i 90 mm plater.

2. sanntid PCR

  1. Prøvetaking
    1. En anal vattpinne inn pasientens anus 3-5 cm dyp, og roter det 360° rundt.
    2. Sette anal vattpinnen i et sterilt samling rør. Merke eksempel ID.
    3. Send prøven til laboratoriet så snart som mulig.
      Merk: Utvalg kan lagres ved 4 ° C i mer enn 24 timer.
  2. Pre berikelse
    1. Legge 3 mL næringsstoff kjøttkraft til hvert utvalg i samlingen røret.
    2. Ruge på 36 ° C 6t i en inkubator.
  3. Eksempel blande (valgfritt)
    1. Samle 100 µL av hver pre berikelse kultur og bland 8-10 prøver av 1 til en 1,5 mL tube hvis det er mer enn 10 prøver.
    2. Merk riktig.
  4. DNA utvinning
    1. Sentrifuge pre berikelse kulturen 800 x g i 2 minutter å tillate store partikler å slå seg ned og overføre nedbryting ny tube og sentrifuge 12.000 x g for 5 min. forkaste nedbryting av aspirasjon.
    2. Legge til 100 µL av DNA utvinning løsning (0,01 M pH 8.0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) å pellet. Vortex kraftig for 1 min.
    3. Kok ved 100 ° C i 5 min på en tørr bad.
    4. Sentrifuge 12.000 x g for 5 min. samle nedbryting bruker en ny tube, som vil være malen for etterfølgende sanntid PCR analyse.
  5. Sanntid PCR
    1. Sette reaksjonsblandingen som følger: for hver prøve, legge til 12,5 µL av 2 x reaksjonsblandingen, 0.4 µM av hver primer, 0,2 µM hver probe (sekvenser i tabell 1)27, 5 µL av malen som forberedt i trinn 2.4.4, og bruk ddH2O for å legge til opptil 25 µL totalt volum.
    2. Sykling installasjonsprogram som følger: 95 ° C i 3 min, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 15 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C i 34 s. samle fluorescerende signaler fra 6-carboxy-fluorescein (FAM) og Hexachlorofluorescein (HEX) kanaler ved forlengelse trinn (72 ° C) automatisk av fluorescerende sanntid PCR maskinen.
    3. Utføre sanntid PCR på en fluorescerende sanntid PCR maskin, i henhold til instruksjonene av instrumentet.
    4. Gå til trinn 4 direkte og utstede negative rapporter om negative resultater oppstår på FAM/HEX kanaler, som betyr at prøvene er negativ for Salmonella spp. /Shigella spp.
    5. Gå til trinn 3.1 og/eller 3.2 om positive resultater oppstår på HEX og/eller FAM kanaler, som betyr at prøven kan være positivt for Salmonella spp. og/eller Shigella spp., henholdsvis.
      Merk: Hvis prøven miksing er utført i trinn 2.3, deretter sanntid PCR på individuelle prøver som består av en positiv skal utføres for å sile ut reell positiv prøven.

3. guidede kultur

  1. Salmonella spp. PCR positivt eksempel
    1. Selektiv kultur i medium
      1. Legge til 100 µL av pre berikelse kultur i 5 mL av selenitt Cystine medium i et reagensrør. Ruge på 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
    2. Skille kultur på plate
      1. Samle en løkke av kultur med en mikro-løkke og spredt på en XLD tallerken eller Salmonella kromogent agar plate. Ruge på 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
    3. Biokjemisk identifisering
      1. Velg mistenkelige kolonien på XLD plate (rosa kolonien med/uten mørke hjerte, mørk kolonien, gul kolonien med/uten mørke hjerte) eller Salmonella kromogent agar plate (lilla eller prunosus koloni, glatt og rund) (figur 2).
      2. Emnet mistenkelige koloni for biokjemisk identifisering på automatiserte mikrobiell identifikasjonssystem, i henhold til instruksjonene av instrumentet.
    4. Serologisk karakteristikk
      1. O antigen karakteristikk
        1. Legg en dråpe O antigen polyvalent sera på et rent lysbilde.
        2. Samle en løkke av kolonien med mikro-loop og grind i sera.
        3. Gå til trinn 3.1.4.1.4 Hvis det ser ut som strømmer sand, noe som betyr at kolonien reaktiv til sera (Figur 3). Ellers, gå til trinn 3.1.4.1.5.
        4. Bruk O antigen monovalent sera for å gjenta trinn 3.1.4.1.1 til 3.1.4.1.3 til bestemte O antigen er preget.
        5. Bruk Vi sera for å gjenta 3.1.4.1.1 til 3.1.4.1.3. Samle de Vi sera reaktive koloniene i et rør og kok ved 100 ° C i 5 minutter i en tørr bad. Sentrifuge 12.000 x g for 5 min. samle pellets og gjenta trinn 3.1.4.1.1 til 3.1.4.1.4 til spesifikke O antigen er preget.
      2. H antigen karakteristikk
        1. Legg en dråpe H antigen polyvalent sera på et rent lysbilde.
        2. Samle en løkke av kolonien med mikro-loop og grind i sera.
        3. Gå til trinn 3.1.4.2.4 Hvis det ser ut som strømmer sand, noe som betyr at kolonien reaktiv til sera.
        4. Bruk H antigen monovalent sera for å gjenta trinn 3.1.4.2.1 til 3.1.4.2.3 til spesifikke H antigen er preget.
          Merk: Noen ganger serum induksjon kanskje behøves å karakterisere andre fase H antigen. Hvis ja, skal deretter følgende valgfrie trinn utføres.
        5. (Valgfritt) Legge til en dråpe av bestemte H antigen sera på næringsstoffer agar tallerkenen. Vent til alle sera absorberes.
        6. (Valgfritt) Samle en løkke av kolonien med en mikro-loop og spredning på platen hvor spesielle H antigen sera absorberes. Ruge på 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
        7. (Valgfritt) Bruk H antigen monovalent sera for å gjenta trinn 3.1.4.2.1 til 3.1.4.2.3 til fase H antigen er preget.
        8. Gå til trinn 4.
  2. Shigella spp. PCR positivt eksempel
    1. Skille kultur på plate
      1. Samle en løkke av pre berikelse kultur med en mikro-løkke og spredt på en XLD tallerken eller MAC plate. Ruge på 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
    2. Biokjemisk identifisering
      1. Samle mistenkelige koloni på XLD plate (glatte, runde, gjennomsiktig og røde kolonien) eller MAC plate (glatte, runde, transparent og fargeløs kolonien med 2-3 mm i diameter; Shigella sonnei kan bli større og bli lys rosa som forlengelse av inkubasjonstiden) (Figur 4).
      2. Emnet mistenkelige koloni for biokjemisk identifisering på automatiserte mikrobiell identifikasjonssystem, i henhold til instruksjonene av instrumentet.
    3. Serologisk karakteristikk
      1. Legg en dråpe Shigella spp. polyvalent sera på et rent lysbilde.
      2. Samle en løkke av kolonien med mikro-loop og grind i sera.
      3. Gå til trinn 3.2.3.4 Hvis det ser ut som strømmer sand, noe som betyr at kolonien reaktiv til sera.
      4. Bruk Shigella spp. monovalent sera for å gjenta trinn 3.2.3.1 til 3.2.3.3 til bestemte Shigella spp. er preget.
      5. Gå til trinn 4.

4. rapporter

  1. Utstede positive eller negative rapporter etter over selve resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen ble brukt for screening av Salmonella spp. /Shigella spp. i anal krakken prøver fra mennesker som vil håndtere mat og vann.

I sanntid PCR trinn, som vist i figur 5A, var det en vellykket forsterkning i HEX kanalen, noe som betydde at blandet prøven var positivt for Salmonella spp. Deretter ble en ytterligere sanntid PCR utført på individuelle prøver som består av en positiv. Som vist i figur 5B, var eksempel 2 positiv. Derfor ble prøve 2 valgt for guidede kultur Salmonella spp. I figur 5Cvar det en vellykket forsterkning i FAM kanalen, noe som betydde at blandet prøven var positivt for Shigella spp. En ytterligere sanntid PCR ble gjennomført og prøve 10 ble funnet for å være positive (figur 5D). Derfor ble prøve 10 valgt for guidede kultur Shigella spp.

I Salmonella spp. guidede kultur var det rosa kolonier og lilla kolonier på XLD plate og Salmonella kromogent agar platen, separat, som vist i figur 2. Deretter ble disse kolonier utsatt for biokjemisk identifisering på automatiserte mikrobiell identifikasjonssystem. Resultatene viste at det var Salmonella spp., med arter ukjent. Derfor serologisk karakterisering ble utført (Figur 3), og det var reaktiv til O4, O12, Hb, H1, 2. Ifølge White-Kauffmann-Le mindre ordningen, ble eksempel 2 endelig rapportert som positivt for Salmonella paratyphi B. Mens for guidede kultur Shigella spp., var det rosa rød og fargeløs kolonier på XLD plate og MAC platen, separat, som vist i Figur 4. Deretter ble disse kolonier også utsatt for biokjemisk identifisering på automatiserte mikrobiell identifikasjonssystem. Resultatene viste at det var Shigella sonnei. For å bekrefte sin spesifikke serotype, serologisk karakterisering ble utført (Figur 3), og det var reaktiv til sonnei fase II. Derfor ble prøve 10 endelig rapportert som positive Shigella sonneifase II.

Figure 1
Figur 1 : Diagrammet protokollen. To hovedtrinn ble vist og atskilt med bindestrek linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant kultur resultatene av Salmonella spp. på XLD plate og Salmonella kromogent agar platen. På XLD plate, det var rosa kolonier med/uten mørke hjerte, mens på Salmonella kromogent agar plate, det var lilla kolonier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant serologisk karakterisering resultatet. Hvis kolonien var reaktiv til sera, det så ut som strømmer sand (til venstre). Ellers var grumset (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representant kultur resultatene av Shigella spp. på XLD plate og MAC platen. På XLD plate, var det røde kolonier, mens på MAC plate, det var gjennomsiktig og fargeløs koloniene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representant real-time PCR resultater. (A) HEX kanal for blanding prøvene. (B) HEX kanal for individuelle prøver. (C) FAM kanal for blanding prøvene. (D) FAM kanal for individuelle prøver. PC: positiv kontroll. NC: negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Patogen navn Sequence(5'-3')
Salmonella Sal-F
Sal-R
Sal-sonde		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse
Shigella Shi-F
Shi-R
Shi-sonde		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse

Tabell 1: primere og sonder brukes. Navnet og sekvenser av primere og sonder ble levert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden Salmonella spp. /Shigella spp. er ofte forbundet med matforgiftning og fecal-muntlige overføring av akutt gastroenteritt28,29 og rutinemessig metoden er arbeidskrevende eller tidkrevende 7, beskriver vi en høy gjennomstrømming plattform for Salmonella spp. /Shigella spp. screening, bruker sanntid PCR kombinert med guidede kultur.

Det er flere trinn som trenger å maksimere muligheten til denne plattformen. Den første er pre berikelse trinnet av prøver i næringsstoff kjøttkraft (trinn 2.2). Men ingen pre berikelse trinn kreves for avføringsprøver fra pasienter med åpenbare symptomer som diaré, etc., er en generell 6t pre berikelse trinn fortsatt behov for anal vattpinne prøver, når samlet under pre-sysselsetting fysisk eksamen for folk som vil håndtere mat og vann, som de var hovedsakelig sunn eller minst asymptomatisk voksne. Hvis protokollen ble bare brukt for påvisning av Salmonella spp., kunne deretter pre berikelse utføres i selenitt Cystine medium for å øke følsomhet. Det andre kritiske trinnet er identifikasjon av mistenkelig kolonier (trinn 3.1.3.1 og 3.2.2.1). Det er mange forstyrrende bakgrunn flora i avføringsprøver som kan maskere gjenkjenning og isolering av målet patogener30. Derfor bør karakteristiske mistenkelige koloniene som definert i trinn 3.1.3.1 og 3.2.2.1 holdes i bakhodet under eksperimentet. Det tredje kritiske trinnet er serologisk karakterisering av Salmonella spp. Som et flertall av Salmonella spp. inneholder en fase for H antigen31, må serum induksjon utføres. Imidlertid serum induksjon er ikke alltid heldig, og flere runder med induksjon kan være nødvendig å bestemme riktig H fase.

Protokollen er svært bestemt og følsom som bekreftet av våre tidligere studie27. Høy spesifisitet av protokollen er demonstrert av sin evne til, i som Salmonella spp. /Shigella spp. kan skilles fra andre relaterte patogener27. Nedre grense for påvisning av protokollen er 104 CFU/mL og 103 CFU/mL for Salmonella spp. og Shigella spp., henholdsvis27, som er sammenlignbare med tidligere rapporter7,32 , 33 , 34. som nevnt ovenfor, følsomheten av Salmonella spp. kan videre økes ved selenitt Cystine pre berikelse hvis protokollen ble bare brukt for påvisning av Salmonella spp. Videre protokollen kan øke positiv rate av to folder og redusere arbeidsbelastningen/median behandlingstid gang betydelig27.

I likhet med andre NAAT analyser, ettall større begrensningen av protokollen, sammenlignet med klassisk bakterier kultur metoden, er at protokollen bare kunne identifisere Salmonella spp. /Shigella spp., mens andre vanlige diaré-forårsaker bakterier utelatt7. Derimot under klassiske bakterier kultur, kan de bakteriene identifiseres parallelt hvis de eksisterte. En annen begrensning av protokollen er at noen av Salmonella spp. /Shigella spp. kan ikke identifiseres av sanntids PCR på grunn av sekvens variasjoner27. Men hvis negative sanntid PCR resultater vises for disse prøvene fra pasienter med åpenbare kliniske symptomer, laboratorium teknikere bør være oppmerksom og utføre andre eksperimenter for å bekrefte resultatene. Under en stor utbrudd, kan vi bruke et enkelt utvalg i stedet for grupperte prøver første runde av PCR screening.

Avslutningsvis protokollen her kan tjene som en verdifull plattform for screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av vitenskapen og teknologi Program av Zhuhai, Kina (gi nummer 20171009E030064), vitenskap og teknologi programmet i Guangdong, Kina (gi nummer 2015A020211004) og vitenskap og teknologi Program av General Administration Quality tilsyn, inspeksjon og karantene av Folkerepublikken Kina (nummer grant-2016IK302, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 141: akutt gastroenteritt, Salmonella spp. Shigella spp. screening sanntid PCR guidet kultur
En høy gjennomstrømming plattform for Screening av <em>Salmonella</em> spp. /<em>Shigella</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter