Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella spp. /Shigella spp. ortak patojenler için ishal atfedilen. Burada, biz yüksek üretilen iş platformu Salmonella spp. testi ile taranması için tarif / gerçek zamanlı PCR kullanarakShigella spp. rehberli kültürü ile kombine.

Abstract

Akut gastroenterit fekal-oral iletim zaman zaman, özellikle gıda ve su ele insanlar Salmonella spp./Shigella spp. tarafından enfekte oluşur Salmonella spp./Shigella spp. tespiti için altın standart yöntem doğrudan kültür ama bu emek yoğun ve zaman alıcı. Burada, tarama, gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) destekli kültürü ile kombine kullanarak Salmonella spp./Shigella spp. için bir yüksek-den geçerek platform açıklayın. İki büyük aşama vardır: gerçek zamanlı PCR ve Rehberli kültür. İlk aşama (gerçek zamanlı PCR), biz her adım yöntemi açıklamak: örnek toplama, ön zenginleştirme, DNA ekstraksiyon ve gerçek zamanlı PCR. Gerçek zamanlı PCR sonucu olumlu ise, o zaman ikinci aşama (Rehberli kültür) gerçekleştirilir: seçici kültür, biyokimyasal tanımı ve serolojik karakterizasyonu. Biz de bundan oluşturulan temsilcisi sonuçları göstermektedir. Burada açıklanan protokol Salmonella spp. hızlı, belirli, hassas ve yüksek işlem hacmi ile taranması için değerli bir platform olur /Shigella spp.

Introduction

İshal hala yaygın bir sağlık sorunu ile yüksek görülme oranı genel olarak1,2olduğunu. Ölüm oranı nispeten düşük olsa da, bazı hastalarda hafta (örneğin, gevşek ve sulu dışkılama, tuvalete gitmek için bir aciliyet), çeşitli belirtileri göstermek hangi sosyo-ekonomik etkisi çok yüksek3,4yapmak. Daha ciddi, bazı hastalar bile irritabl barsak sendromu tedavi edilmezse5yaptı geliştirmek. Bakteri, virüs ve parazitler ishal6neden olabilir çeşitli türleri vardır. Salmonella spp. /Shigella spp. Akut gastroenterit7,8,9,10,11iletimi için en yaygın bakteriler arasında yer alıyor. Bu nedenle, birçok ilinden yasalar veya yönetmelikler düzenli Salmonella spp. için verilen /Shigella spp. eleme yiyecek ve su ele alabileceğinizi insanlar arasında. Örneğin, Çin hükümeti yasalar zorunlu Salmonella spp. için yayınladık /Shigella spp. eleme yılda bir kez.

Salmonella spp. için altın standart yöntem /Shigella spp. algılama bakteri kültürü. Bakteri kültürü ve art arda gelen biyokimyasal kimlik ve serolojik karakterizasyonu, bakteriler, hastalık salgını yönetimi ve antimikrobiyal hastaların tedavisi yardım için profil oluşturma kolaylaştırabilir tür belirlemek için 12. aynı zamanda Salmonella spp. sırasında enfeksiyon kaynağı iz yardımcı /Shigella spp. salgını13. Ancak, bu yöntem emek yoğun (gerektiren el ile işlem) ve zaman alıcı (birkaç gün) daha az çekici, özellikle örnekleri7çok sayıda test etmek içindir. Ayrıca, culturable (VBNC) Salmonella spp. ama /Shigella spp.14bazı dışkı örnekleri var olabilir. İçinde görüş-in bu sakıncaları,-si olmak güvenilir birçok laboratuar Salmonella spp. algılanması için yeni teknikler geliştirmek /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. aralarında polimeraz zincir tepkimesi (PCR) en yaygın olan nükleer asit amplifikasyon testi (NAAT), tüm bu yöntemleri kullanın. Bir büyük NAAT dayalı yöntemlerin ölü bakteriler, hatta bakteriyel enkaz içeren eksik genomik DNA, olumlu sonuçlar26doğru tanı hastalığın büyük ölçüde etkileyebilir, gösterebilirim kısıtlamasıdır. Blanco ve ark. Bu moleküler tahlil son derece hassas, sadece uygun Salmonella kültürlerde, aynı zamanda kısmi genleri ve son enfeksiyonlar ya da kirlenme26ölü ya da kamunun bakteri olduğunu gösterdi. Bu nedenle, yeni teknoloji geliştirilmelidir.

Burada, birleştirir NAAT yönteme ve kültür göre bir roman yöntemi açıklanmıştır. Şekil 1' de gösterildiği gibi bu yeni yöntem gerçek zamanlı PCR ilk eleme uygular ve sonra olumlu örnekler bakteri kültür ve kimlik için gönderilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol Zhuhai Uluslararası seyahat sağlık merkezi insan Araştırma Etik Komitesi tarafından kuralları izler. Lütfen deneme sırasında standart steril işlemini kullanın.

1. Kültür medya kompozisyon ve hazırlık

  1. Besin et suyu hazırlayın: Erimesi %1 pepton, % 0.3 sığır eti özü, % 0.5 sodyum klorür, % 0,1 glikoz H2O, pH 7.5 ve basınçlı kap ayarlamak 121 ° C 15 dakika içinde.
  2. Selenit sistin orta hazırlamak: % 0.5 pepton, %0,4 laktoz, % 1'na2HCO3, %0,4 sodyum hidrojen selenit, % 0.001 dağıtılması L-sistin H2O ve pH 7.0 ayarlamak için 5 dakika kaynatın.
  3. Ksiloz hazırlamak lizin, Deoxycholate agar (XLD) plaka: erime % 0,3 maya ekstresi, %0,5 L-lizin, %0.375 ksiloz, % 0.75 laktoz, % 0.75 sükroz, % 0.5 sodyum klorür, %0.008 fenol red, %0,68 sodyum thiosulfate, %0,08 amonyum ferrik nitrat, % 0.25 sodyum deoxycholate, H2O, %1,5 agar ve pH 7.4 için ayarlayın. Sonra 5 dakika kaynatın ve 90 mm tabak dökün.
  4. Salmonella chromogenic agar plaka hazırlamak: Dissolve %1,5 agar, % 0,7 pepton ve maya ekstresi, %1.29 seçici reaktif H2O. Sonra 5 dakika kaynatın ve 90 mm tabak dökün.
  5. Besin agar plaka hazırlamak: % 1 pepton, % 0.3 sığır eti özü, % 0.5 sodyum klorür, % 1.5 agar H2O içinde dağıtılması ve pH 7,3 için ayarlayın. O zaman basınçlı kap 15dk için 121 ° C içinde ve 90 mm kalıplara dökmek.
  6. MacConkey agar (MAC) plaka hazırlamak: % 2 pepton, % 1 laktoz, % 0.5 sodyum klorür, % 0.5 dağıtılması öküz safra tuzu, %0.0025 tarafsız kırmızı, %1,5 agar, %0,0001 kristal violet H2O ve pH 7.2 için ayarlayın. O zaman Otoklav içinde 20 dk için 115 ° C ve 90 mm kalıplara dökmek.

2. gerçek zamanlı PCR

  1. Örnek koleksiyonu
    1. Anal bir çubukla hastanın anüs Ekle 3-5 cm derinliğinde ve etrafında 360 ° döndürün.
    2. Anal çubukla steril toplama tüp içine koymak. Mark örnek kimliği
    3. Örnek en kısa zamanda laboratuvara gönderin.
      Not: Örnekleri için en fazla 24 h 4 ° C'de saklanan olabilir.
  2. Ön zenginleştirme
    1. Besin et suyu 3 mL içine her örnek koleksiyon tüpte ekleyin.
    2. 36 ° c 6 h bir kuluçka için kuluçkaya.
  3. Örnek (isteğe bağlı) karıştırma
    1. Her ön zenginleştirme Kültür 100 µL toplamak ve 10'dan fazla örnekleri varsa 1 numune örnekleri 8-10 1,5 mL tüp içine karıştırın.
    2. Düzgün işaretleyin.
  4. DNA ekstraksiyon
    1. Ön zenginleştirme kültür vasıl 800 x g büyük parçacıklar yerleşmek izin vermek 2 dk santrifüj kapasitesi ve yeni tüp ve 5 dakika süreyle 12.000 x g, santrifüj süpernatant transfer aspirasyon tarafından süpernatant atın.
    2. DNA ekstraksiyon çözeltinin 100 µL ekleyin (0.01 M pH 8.0 Tris-EDTA, %0.01 Nonidet P 40 (NP40)) için Pelet. 1 dk. için şiddetle girdap.
    3. Kuru banyo üzerinde 5 min için 100 ° C'de kaynatın.
    4. 5 dakika süreyle 12.000 x g, santrifüj şablonu izleyen gerçek zamanlı PCR analizi için yeni bir tüp kullanarak süpernatant toplamak.
  5. Gerçek zamanlı PCR
    1. Reaksiyon karışımı olarak Kurulum izleyin: her örnek için 2 x reaksiyon karışımı, her astar 0.4 µM, 0.2 µM her sonda ( Tablo 1' deki dizileri)27, 5 µL 2.4.4 adımda hazırlanan şablonun 12.5 µL ekleyip 25 µL toplam eklemek için GKD2O kullanabilirsiniz birim.
    2. Kur Bisiklete binme programı aynı derecede izlemek: 95 ° C 3 dk, ardından 40 devredir 15 95 ° c s, 30 55 ° C s, 34 s. toplamak floresan sinyallerini 6-carboxy-floresein (FAM) ve Hexachlorofluorescein (onaltılık) kanalları uzama adımda (72 ° C) için 72 ° C otomatik olarak floresan gerçek zamanlı PCR makine tarafından.
    3. Gerçek zamanlı PCR floresan gerçek zamanlı PCR üstünde a makine, alet yönergelerine göre gerçekleştirin.
    4. Adım 4'e doğrudan gidin ve yayın olumsuz raporlar negatif sonuç örnekleri Salmonella spp. için olumsuz olduğu anlamına gelir FAM/HEX kanallarda oluşursa /Shigella spp.
    5. 3.1 ve/veya 3.2 adıma olumlu sonuçlar HEX ve/veya FAM kanallarda örnek sırasıyla Salmonella spp. ve/veya Shigella spp., olumlu olabilir anlamına gelir ortaya gidin.
      Not: örnek karıştırma 2.3 adımda gerçekleştirilen Eğer, o zaman pozitif olan yapılan bireysel örnekleri üzerinde gerçek zamanlı PCR çok olumlu örnek ekran için yapılmalıdır.

3. güdümlü kültür

  1. Salmonella spp. PCR olumlu örnek
    1. Seçmeli Orta kültüründe
      1. Ön zenginleştirme Kültür 100 µL 5 mL tüp bebek ortamda selenit sistin de içine ekleyin. 18-24 h bir kuluçka için 36 ° C'de kuluçkaya.
    2. Kültür plaka üzerinde ayıran
      1. Bir mikro-döngü ile kültürünün bir döngü toplamak ve bir XLD plaka veya Salmonella chromogenic agar levha yayıldı. 18-24 h bir kuluçka için 36 ° C'de kuluçkaya.
    3. Biyokimyasal tanımlama
      1. XLD plaka (pembe koloni karanlık kalp olmadan/ile; koyu koloni; sarı koloni ile/karanlık kalp olmadan) veya Salmonella chromogenic agar plaka üzerinde select şüpheli kolonisi (mor veya prunosus koloni, düzgün ve yuvarlak) (Şekil 2).
      2. Konu şüpheli colony enstrümanın talimatlara göre otomatik mikrobiyal tanımlama sisteminde biyokimyasal kimlik için.
    4. Serolojik karakterizasyonu
      1. Ey antijen karakterizasyonu
        1. O antijen polivalan sera temiz bir slayt üzerine bir damla ekleyin.
        2. Bir mikro-döngü ve sera taneler koloninin bir döngü toplamak.
        3. Eğer kum, akan gibi görünüyor 3.1.4.1.4 adım git hangi koloni sera (Şekil 3) reaktif olduğu anlamına gelir. Aksi takdirde, 3.1.4.1.5 adıma gidin.
        4. O antijen monovalent sera spesifik O antijen ile karakterize 3.1.4.1.1-3.1.4.1.3 tamamlayana dek için kullanın.
        5. VI sera adımları 3.1.4.1.1-3.1.4.1.3 yinelemek için kullanın. Bu VI sera reaktif koloniler halinde bir tüp toplamak ve kuru bir banyoda 5 min için 100 ° C'de kaynatın. 5 dakika süreyle 12.000 x g, santrifüj toplamak Pelet ve 3.1.4.1.1-3.1.4.1.4 arasındaki adımları yineleyin kadar spesifik O antijen ile karakterizedir.
      2. H antijeni karakterizasyonu
        1. H antijeni polivalan sera temiz bir slayt üzerine bir damla ekleyin.
        2. Bir mikro-döngü ve sera taneler koloninin bir döngü toplamak.
        3. Eğer kum, akan gibi görünüyor 3.1.4.2.4 adım git hangi koloni sera için reaktif olduğu anlamına gelir.
        4. H antijeni monovalent sera spesifik H antijen ile karakterize 3.1.4.2.1-3.1.4.2.3 tamamlayana dek için kullanın.
          Not: Bazen serum indüksiyon ikinci aşama H antijen karakterize etmek için gerekli olabilir. Eğer öyleyse, o zaman aşağıdaki isteğe bağlı adımlar gerçekleştirilmelidir.
        5. (İsteğe bağlı) Belirli H antijen sera besin agar plaka üzerine bir damla ekleyin. Tüm sera emilir kadar bekleyin.
        6. (İsteğe bağlı) Bir döngü bir mikro-döngü ve plaka üzerine yayılmış koloninin nerede belirli H antijen sera emilir toplamak. 18-24 h bir kuluçka için 36 ° C'de kuluçkaya.
        7. (İsteğe bağlı) H antijeni monovalent sera ikinci aşama H antijeni ile karakterize 3.1.4.2.1-3.1.4.2.3 tamamlayana dek için kullanın.
        8. Adım 4'e gidin.
  2. Shigella spp. PCR olumlu örnek
    1. Kültür plaka üzerinde ayıran
      1. Bir mikro-döngü ile ön zenginleştirme kültürünün bir döngü toplamak ve XLD tabak ya da MAC levha yayıldı. 18-24 h bir kuluçka için 36 ° C'de kuluçkaya.
    2. Biyokimyasal tanımlama
      1. Şüpheli koloni XLD plaka (düz, yuvarlak, şeffaf ve kırmızı koloni) veya MAC plaka (düz, yuvarlak, renksiz ve şeffaf koloni ile 2-3 mm çapında; toplamak Shigella sonnei daha büyük ve ışık için kuluçka süresinin uzaması pembe çevirmek) (Şekil 4).
      2. Konu şüpheli colony enstrümanın talimatlara göre otomatik mikrobiyal tanımlama sisteminde biyokimyasal kimlik için.
    3. Serolojik karakterizasyonu
      1. Shigella spp. polivalan sera temiz bir slayt üzerine bir damla ekleyin.
      2. Bir mikro-döngü ve sera taneler koloninin bir döngü toplamak.
      3. Eğer kum, akan gibi görünüyor 3.2.3.4 adım git hangi koloni sera için reaktif olduğu anlamına gelir.
      4. Shigella spp. monovalent sera belirli Shigella spp. karakterize 3.2.3.1 3.2.3.3 tamamlayana dek için kullanın.
      5. Adım 4'e gidin.

4. rapor

  1. Olumlu ya da olumsuz haberlere göre yukarıdaki sonuçları yayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Salmonella spp. tarama için uygulanan protokol /Shigella spp. anal dışkıda örnekleri yiyecek ve su ele alabileceğinizi kişilerden.

Gerçek zamanlı PCR adımda, Şekil 5'A, gösterildiği gibi vardı karışık örnek Salmonella spp. için pozitif olduğu anlamına geliyordu HEX kanaldaki başarılı bir amplifikasyon Sonra bir daha da gerçek zamanlı PCR pozitif olan yapılan bireysel örnekleri yapılmıştır. Şekil 5' teBgösterilen, örnek 2 olumlu oldu. Bu nedenle, örnek 2 Salmonella spp. Rehberli kültür için seçildi Şekil 5' teC, başarılı bir amplifikasyon karışık örnek Shigella spp. için pozitif olduğu anlamına geliyordu FAM kanal vardı Sonra bir daha da gerçek zamanlı PCR yapılmıştır ve örnek 10 pozitif olarak bulundu (Şekil 5D). Bu nedenle, Shigella spp. rehberli kültürü için örnek 10 seçildi

Salmonella spp. Rehberli kültür, pembe kolonileri ve vardı XLD plaka ve Salmonella chromogenic agar plaka, mor koloniler ayrı olarak, Şekil 2' de gösterildiği gibi. O zaman bu koloniler mikrobiyal otomatik tanımlama sistemi biyokimyasal hattın numarasını gösterme tabi tutuldu. Sonuçları Salmonella spp., bilinmeyen türler ile olduğunu gösterdi. Bu nedenle, gerçekleştirilen (Şekil 3) ve serolojik karakterizasyonu oldu O4, O12, sert kapak ciltli, H1, reaktif oldu 2. Beyaz-Kauffmann-Le küçük şemasına göre örnek 2 nihayet olumlu olarak Salmonella paratyphi Biçin bildirildi. Rehberli kültürünü Shigella spp. iken için vardı pembe kırmızı ve renksiz kolonileri XLD plaka ve MAC plaka, ayrı ayrı, Şekil 4' te gösterildiği gibi. Sonra bu koloniler Ayrıca otomatik mikrobiyal tanımlama sistemi biyokimyasal kimliğine tabi tutuldu. Sonuçları Shigella sonneiolduğunu gösterdi. Onun belirli serotip onaylamak için serolojik karakterizasyonu gerçekleştirilen (Şekil 3) ve o da sonnei faz II reaktif yapıldı. Bu nedenle, örnek 10 sonunda olumlu olarak Shigella sonnei faz IIiçin bildirildi.

Figure 1
Resim 1 : Diyagramı Protokolü'nün. İki önemli adım gösterilen ve kesik çizgi ile ayrılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Salmonella spp. XLD plaka ve Salmonella chromogenic agar plaka sonuçlarını temsilcisi kültür. XLD tabakta ile pembe kolonileri olduğunu/karanlık kalp Salmonella chromogenic agar plaka iken, orada yanlış mor koloniler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Temsilcisi serolojik karakterizasyonu sonuç. Koloni için sera reaktif, kum akan gibi (solda) görünüyordu. Aksi takdirde, bulanık (sağ) idi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Shigella spp. XLD plaka ve MAC plaka temsilcisi kültür sonuçlarını. XLD plaka üzerinde kırmızı kolonileri vardı MAC plaka üzerinde şeffaf ve renksiz kolonileri vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Temsilcisi gerçek zamanlı PCR sonuçları. (A) HEX kanal mix örnekleri için. (B) HEX kanal bireysel örnekleri için. (C) FAM kanal mix örnekleri için. (D) FAM kanal bireysel örnekleri için. PC: pozitif kontrol. NC: negatif kontrol. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Patojen Adı Sequence(5'-3')
Salmonella Sal-F
Sal-R
Sal-sonda		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse
Shigella Shi-F
Shi-R
Shi-sonda		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse

Tablo 1: astar ve kullanılan problar. Astar ve sondalar dizileri ve adı verilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Salmonella spp. beri /Shigella spp. kez gıda zehirlenmesi ve fekal-oral iletim Akut gastroenterit28,29 ile ilişkili ve emek yoğun veya zaman alıcı rutin yöntemdir 7, biz yüksek üretilen iş platformu Salmonella spp. için tarif /Shigella spp. tarama, gerçek zamanlı PCR kullanarak rehberli kültürü ile kombine.

Dikkate bu platform kapasitesini en üst düzeye çıkarmak için gereken birkaç adım vardır. İlki besin suyu (adım 2.2) örneklerinde ön zenginleştirme adımdır. Hiçbir ön zenginleştirme adım dışkı örneği bu hastalarda ishal, vb, gibi belirgin semptomlar ile toplanan için gerekli olsa da genel 6 h ön zenginleştirme adım hala anal çubukla örnekleri için ön çalışma sırasında toplanan gerekli olduğu Bu insanlar çoğunlukla sağlıklı ya da en azından asemptomatik yetişkin olduğu gibi yiyecek ve su, ele alabileceğinizi insanlar için fizik muayene. Protokol yalnızca Salmonella spp. tespiti için uygulandıysa, sonra ön zenginleştirme selenit sistin ortamda duyarlılığı artırmak amacıyla yürütülen. İkinci önemli adım şüpheli koloniler (adım 3.1.3.1 ve 3.2.2.1) tanımlamasıdır. Algılama ve yalıtım hedef patojenler30maskeleyebilir dışkı örneklerinde çok müdahaleci arka plan flora vardır. Bu nedenle, şüpheli koloniler özelliği içinde tanımlı adım 3.1.3.1 ve 3.2.2.1 olarak deneme sırasında göz önünde tutulmalıdır. Salmonella spp. serolojik karakterizasyonu üçüncü en önemli adımdır Salmonella spp. çoğunluğu içeren H antijen31için ikinci faz serum indüksiyon yapılması gerekiyor. Ancak, serum indüksiyon her zaman başarılı değildir ve indüksiyon birkaç tur doğru ikinci H faz belirlemek için gerekli olabilir.

Son derece özel ve hassas olarak bizim önceki çalışma27tarafından doğrulanmadı protokolüdür. Protokolü'nün yüksek özgüllük onun yetenek, hangi Salmonella spp. gösterdiği /Shigella spp. diğer ilgili patojenler27dan ayırt. 10 Algılama Protokolü'nün alt sınırıdır4 CFU/mL ve 103 CFU/mL Salmonella spp. ve Shigella spp., sırasıyla27, önceki raporlar7,32 ile karşılaştırılabilir , 33 , 34. yukarıda belirtildiği gibi protokol Salmonella spp. tespiti için sadece uygulandıysa Salmonella spp. algılama hassasiyeti daha fazla selenit sistin ön zenginleştirme tarafından artış Ayrıca, protokol tarafından iki kıvrımları pozitiflik oranı artırmak olabilir ve iş yükü/medyan azaltmak dönüş zamanı önemli ölçüde27.

Diğer NAAT deneyleri, bir büyük sınırlama zaman klasik bakteri kültürü yöntemine göre iletişim kuralı, iletişim kuralı yalnızca Salmonella spp. teşhis edebilir benzer /Shigella spp., diğer ortak ishal neden olan bakteriler iken 7atlanmış. Onlar varsa buna ek olarak, klasik bakteri kültürü sırasında bu bakteri paralel olarak belirlenmiştir. Başka bir iletişim kuralının bu kısıtlamadır bazı Salmonella spp. /Shigella spp. tespit sıra varyasyonları27nedeniyle gerçek zamanlı PCR tarafından. Ancak, negatif gerçek zamanlı PCR sonuçları belirgin klinik semptomları olan hastaların bu örnekleri için görüntüleniyorsa, Laboratuvar teknisyenleri özen ve diğer deney sonuçları onaylamak için. Büyük bir salgını sırasında tek bir örnek yerine havuza alınan örnekleri PCR tarama ilk turu için kullanabiliriz.

Sonuç olarak, burada sağlanan iletişim kuralı Salmonella spp. testi ile taranması için değerli bir platform olarak hizmet verebilir /Shigella spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser bilim ve teknoloji programı Zhuhai, Çin (grant sayı 20171009E030064), bilim ve teknoloji programı Guangdong, Çin (grant sayı 2015A020211004) ve bilim ve teknoloji programı genel yönetim tarafından desteklenmiştir Kalite gözetim, denetim ve karantina (grant numara 2016IK302, 2017IK224) Çin Halk Cumhuriyeti in.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 141 Akut gastroenterit, Salmonella spp. Shigella spp. gerçek zamanlı PCR eleme kültür destekli
<em>Salmonella</em> spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /<em>Shigella</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter