Summary
We beschrijven hier de in vitro generatie HBV DNA via een Hepatitis B-virus infectie-systeem en de zeer gevoelige detectie van de integratie van de (1 – 2 kopieën) met behulp van inverse genest PCR.
Abstract
Hepatitis B-Virus (HBV) is een gemeenschappelijk bloed overdraagbare pathogeen leverkanker en levercirrose ten gevolge van chronische infectie veroorzaken. Het virus repliceert in het algemeen door middel van een episomal DNA tussenliggende; echter, integratie van HBV-DNA-fragmenten in het genoom van de host geconstateerd, hoewel dit formulier niet nodig voor virale replicatie is. Het exacte doel, de timing en de mechanism(s) door welke HBV-DNA integratie plaatsvindt is nog niet duidelijk, maar recente gegevens blijkt dat het heel vroeg na de infectie plaatsvindt. Hier, worden het in vitro generatie en opsporen van HBV DNA integraties in detail beschreven. Ons protocol specifiek losse exemplaren van virus-cel DNA integraties versterkt en zowel absolute kwantificering en single-basenpaar resolutie van de junction-reeks. Deze techniek is vereffend met verschillende HBV-gevoelige celtypes (inclusief primaire menselijke hepatocyten), diverse HBV mutanten, en in combinatie met verschillende belichtingen van de drug. Wij voorzien deze techniek steeds een cruciale test om te bepalen van de moleculaire mechanismen van dit klinisch relevante fenomeen.
Introduction
HBV is een double-stranded DNA-virus dat kan leiden tot levenslang chronische infectie, leidt tot levercirrose en hepatocellulaire carcinoom (HCC)1,2,3. Hoewel er meerdere moleculaire mechanismen rijden HBV persistentie4 (bijvoorbeeld hoge stabiliteit van de epigenetische virale transcriptionele sjabloon), ontduiking van immuun toezicht, en lage omzet van hepatocyten in de lever en de bijbehorende risico van HCC Inleiding5,6 (bijvoorbeeld chronische ontsteking en activering van cellulaire benadrukken trajecten), HBV DNA integratie in het ontvangende cel genoom (een gerapporteerde mechanisme voor beide van deze verschijnselen) slecht is onderzocht . Een belangrijke reden is het gebrek aan geschikte in vitro infectie systemen voor HBV waarmee betrouwbare detectie van integratie evenementen. Hier beschrijven we een onlangs ontwikkelde protocol voor zowel in vitro generatie en opsporing van HBV-DNA-integraties die kan worden gebruikt voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen en de gevolgen daarvan.
HBV-replicatie en de vorming van HBV DNA integratie heeft eerder onderzocht in detail7. Kort, HBV treedt hepatocyten met behulp van het natrium Taurocholate Co-transporting Peptide (NTCP) als de belangrijkste cellulaire receptor voor infectie8,9. De HBV nucleocapsids het HBV-ontspannen circulaire DNA (rcDNA) met treedt genoom de kern, waar het rcDNA wordt omgezet in episomal covalent gesloten circulaire DNA (cccDNA). De nucleaire cccDNA fungeert als de transcriptionele sjabloon voor virale mRNAs en vooraf genomic RNA (pgRNA)10. HBV polymerase en pgRNA worden vervolgens verpakt in de nieuw gevormde nucleocapsids (opgebouwd uit HBV kern eiwit Dimeren). HBV pgRNA is omgekeerde-getranscribeerd binnen de nucleocapside, resulterend in het genoom van een rcDNA of een double-stranded lineaire DNA (dslDNA) genoom11,12. Deze volwassen nucleocapsids met HBV-DNA-genoom zijn definitief gehuld en geëxporteerd als virionen.
Infectie van hepatocyten door omhuld deeltjes met dslDNA moleculen kan resulteren in virale integratie in de ontvangende cel genoom13, wat leidt tot replicatie-incompetente vormen van HBV DNA7,14,15. HBV-DNA integratie vindt plaats op de site van chromosomale double-stranded DNA-einden15. Vergaren van bewijs suggereert dat elke gebeurtenis integratie in een in wezen willekeurige positie binnen de ontvangende cel genoom16,17. Daarnaast treedt HBV DNA integratie op enigszins zelden, tegen een koers van 1 per 104 cellen13,18,19,20. Belangrijke vragen met betrekking tot de integratie van het HBV DNA onbeantwoord, met name wat betreft de exacte moleculaire pathways betrokken, de afhankelijkheid van virale en gastheer factoren, de virale antigenen uitgedrukt van geïntegreerde vormen, en hun mogelijke bijdrage naar virale persistentie7. We hebben een in vitro model opgezet licht werpen op enkele van deze vragen.
De zeldzaamheid van HBV DNA integratie evenementen (zowel met betrekking tot integratie tarief per cel en het aantal van de kopie van elke unieke integratie) in in vitro HBV-infectie modellen maken hen uitdagend te detecteren. Cel mitose wordt beperkt in ons systeem in vitro als scheidslijn cellen geen efficiënte infectie ondersteunen. Dus, in tegenstelling tot in patiënt lever weefsels waar aanzienlijke klonale uitbreiding van hepatocyten18,19,plaatsvindt20, zeer dat weinig (1 tot 2) exemplaren van elke integratie aanwezig zijn in een bepaalde pool van cellen besmet in vitro . We hebben ook geconstateerd dat de integratie voornamelijk tijdens de eerste infectie van hepatocyten (en niet voortdurend in hepatocyten chronisch geïnfecteerd)13 optreedt. Dienovereenkomstig, HBV-DNA-integratie kan niet worden verhoogd door de cellen gewoon te kweken voor een langere periode.
In het algemeen, vlek eerder methoden voor het detecteren van geïntegreerde HBV-DNA, met inbegrip van zuidelijke hybridisatie21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , cassette-gemedieerde afbinding PCR28en hele genoom sequencing29,30,31,32,33, hebben niet de gevoeligheid om te detecteren single-kopieën van de integraties. Wij en andere onderzoekers hebben gebruikt inverse genest PCR (invPCR) voor het detecteren van hepadnaviral DNA integratie in eend, marmot en menselijke besmette levers13,14,18,19, 34,35,,36. Andere hebben procedurele wijzigingen aan de invPCR-techniek die kunnen veranderen van de generatie van vals-positieve signalen en beperken de mogelijkheid voor kwantificering37ingevoerd. Als de bepaling wordt uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol, vertegenwoordigt invPCR een specifieke en gevoelige test die identificeert en kwantificeert (in absolute moleculen) meerdere HBV DNA integraties. De kruising van de HBV-cel DNA is sequenced met een single-basenpaar resolutie, waardoor bioinformatical studies van virale en gastheer-DNA sequenties op de sites van integratie13.
Wij hebben eerder beschreven38 resultaten uit invPCR op DNA van HBV-geïnfecteerde weefsel geëxtraheerd uit een groot aantal bronnen, inclusief de module-bevroren lever weefsels, lever secties paraffine-ingebedde en uiterst kleine weefselsteekproeven geïsoleerd door Laser-microdissection19. Dit protocol beschrijft een bijgewerkte versie van een bepaling van de invPCR gebruikend DNA geëxtraheerd uit cel cultuur afkomstige weefsels na besmetting in vitro , in die laag kopie aantallen integraties (1 – 2 kopieën per integratie) worden gegenereerd. De HBV DNA integraties gevormd in vitro lijken op die gevonden in de weefsels van de patiënt met betrekking tot de verdeling ervan over de cellulaire genoom en de kruising binnen de virale volgorde die is geïntegreerde13,16, hetgeen wijst op een vergelijkbare weg naar binnen een besmette lever.
Protocol
1. cel infectie en DNA-extractie
- Handhaven van gekweekte Huh7-NTCP cellen8,9 in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% v/v foetale runderserum, 1 x penicilline/streptomycine, en 2 mM L-glutamine.
Opmerking: Dit is eerder gemeld in detail40. - Zaad 2 x 105 cellen/mL Huh7-NTCP cellen in een 12-well plaat met 1 mL DMEM.
- Als cel behandelingen (bijvoorbeeld HBV-remmers) wilt testen, toepassen op de cultuur supernatant 4 h na het zaaien (1 dag vóór de HBV-infectie). Voor een negatieve controle, gelden 200 nM Myrcludex B (een potente HBV vermelding remmer41).
- Heparine-kolom gezuiverd42 supernatant van HepAD3843 te gebruiken als een entmateriaal te infecteren cellen bij 1.000 VGE/cel in 500 µL van voedingsbodems (DMEM aangevuld met 10% (v/v): foetale runderserum, 1 x 2 mM L-glutamine, penicilline/streptomycine en 2,5% v/v DMSO), bevattende 4% w/v polyethyleenglycol 8000 [opgelost in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)].
- Cultuur van de cellen in een incubator van de 37 ° C (vastgesteld op 5% CO2 en 90% vochtigheid).
- Wassen van de cellen tweemaal met 1 mL steriele 1 x PBS op 16 – 24 h na infectie.
- Vervang de voedingsbodems elke 2 dagen na HBV-infectie tot oogst.
- Op dag 3 na infectie, behandelen de cellen met 5 µM Tenofovir disoproxil en 10 µM Lamivudine te beperken van de productie van HBV Dr. tussenproducten die amplifiable door invPCR.
- Op dag 5 na infectie, trypsinize van de cellen met 200 µL trypsine-EDTA en resuspendeer hen in 2 mL zuiver DMEM (aangevuld met 10% (v/v): foetale runderserum, 1 x penicilline/streptomycine, en 2 mM L-glutamine), ook met 5 µM Tenofovir disoproxil en 10 µM Lamivudine.
- De cel schorsingen overbrengen in een 6-well plaat voor het opwekken van een ronde van de mitose (die is gemeld voor het opwekken van verlies van HBV cccDNA44 en andere tussenproducten van HBV-DNA die amplifiable door invPCR).
- Op dag 7 na infectie, trypsinize de uitgebreide cellen in 400 µL trypsine-EDTA en resuspendeer de mengsel in 1 mL DMEM. Plaats de schorsing in een tube van 1,5 mL pellet de cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min en verwijder de bovendrijvende vloeistof door aspiratie.
- (Optioneel) De cel-pellets op-20 ° C worden opgeslagen totdat ze klaar voor DNA-extractie zijn.
- Pak het DNA uit de pellet van de cel met behulp van een DNA-extractie-kit, volgens de instructies van de fabrikant. De eindconcentratie van DNA met behulp van optische densitometrie schatten.
Opmerking: De opbrengst van het DNA in een 100 μl elutievolume is over het algemeen ~ 250-400 ng/μL.
2. de inversie van DNA
- Aliquot ~1.5–2.5 μg van het totale DNA halen uit stap 1 in een 200 μl PCR buis. Voeg de juiste hoeveelheid restrictie-enzym meester-mix resulteren in een 40 μL reactie volume met 1 x digest reactie buffer (bv., CutSmart buffer) en 10 U Ncoik-HF.
- Meng de reacties en de spin naar beneden in een klein buisje centrifuge. Incubeer de restrictie-enzym-reactie in een PCR machine bij 37 ° C gedurende 1 uur voor optimale spijsvertering-efficiëntie.
- Inactivering van het beperkingsenzym door broeden bij 80 ° C gedurende 20 min.
- Overdracht van de gehele restrictie-enzym-reactie op een 1,5 mL-buis. Voeg 400 l 1 x T4 DNA ligase buffer en 500 U van T4 DNA ligase en meng het. Het volume van de grote reactie moedigt intra moleculaire (in tegenstelling tot onderling moleculaire) Afbinding van de verteerd DNA-fragmenten.
- Incubeer de afbinding reactie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om ervoor te zorgen volledige afbinding.
- Inactivering van de T4 DNA-ligase bij 70 ° C gedurende 20 minuten.
- Voeg toe 10 μL van 10% w/v natrium dodecyl sulfaat om ervoor te zorgen volledige inactivering van de T4 ligase.
- Meng de buizen door pulse vortexing en kort spin down de reactie mix. NaCl met een eindconcentratie van 100 mM en dextran (35 – 45 kDa) toevoegt aan een eindconcentratie van 90 µg/mL. Meng de buizen door pulse vortexing en kort spin down de reactie mix.
- Voeg 900 l 100% ethanol en meng door inversie. Neerslag het DNA bij-20 ° C's nachts.
- Pellet geprecipiteerde DNA door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 15 min. verwijderen het supernatant door aspiratie met een pipet P200. Het wassen van de pellet met 500 μL van 70% v/v ethanol en centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 15 minuten.
- Verwijder de ethanol door aspiratie met een pipet P200. De DNA-pellet bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten drogen.
- Los van de pellet in 20 μL van H2O. toevoegen 20 μL van een restrictie-enzym meester-mix resulteren in een 40 μL reactie volume met 1 x digest reactie buffer, 5 U van BsiHKAI en 5 U van Sph-HF. Incubate de restrictie-enzym-reactie in een Heat-blok bij 37 ° C (de optimale temperatuur voor SphHF) gedurende 1 uur.
- Kort spin down de reactie mix. Incubeer de restrictie-enzym-reactie in een warmte-blok bij 65 ° C (de optimale temperatuur voor BsiHKAI) gedurende 1 h.
- Kort spin down de reactie mix.
- Het omgekeerde DNA bij-20 ° C bewaren tot de volgende stap.
3. genestelde PCR
- Verwijderen van potentiële waarbij van een herbruikbare siliconen mat seal met behulp van een oplossing van DNA afbraak, spoel de mat grondig met DNA-gratis water en het drogen bij kamertemperatuur tijdens de voorbereiding van het PCR-mengsel.
- Bereiden 1 mL van een 1 x PCR mix met de buitenste vooruit (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3') en omgekeerde (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') inleidingen bij een concentratie van 0,5 µM.
- Voeg toe 170 μL van de 1 x PCR mix aan putjes A1 en E1 in een 96-Wells PCR plaat.
- Voeg toe 120 μL van de 1 x PCR mix aan putjes B1 tot en met H1.
- Voeg toe 10 μL van de omgekeerde DNA uit stap 2 aan putjes A1 en E1 (2 verschillende omgekeerde monsters kunnen worden geanalyseerd op de dezelfde PCR-plaat). Mix de reactie in elk putje door zachtjes pipetteren elk ongeveer 10 keer met behulp van een ingesteld op 100 μl P1000.
- Serieel verdunde monsters van wells A1 tot D1 bij een verhouding van 1:3 door de overdracht van 60 μL bij elke stap. Meng de putten bij elke stap waarbij ze zachtjes over het 10 keer gebruik van een ingesteld op 100 μl P1000. Vermijd vormen van bubbels. Herhaal stap 3.6 voor goed E1, verdunnen tot goed H1.
- Aliquot 10 μl van het reactiemengsel met een meerkanaals-Pipet uit putten A1-H1 in putten A2-H2, A3-H3, enzovoort tot het bereiken van putjes A12-H12 van de 96-wells-plaat. De PCR afdekplaat met de droge silicon mat uit stap 3.1, stevig op te drukken.
- Plaats de plaat in een PCR-machine en voer het volgende programma: 10 min bij 95 ° C; 35 cycli van 15 bij 95 ° C, 15 s s op 54 ° C en 3 min bij 72 ° C; 7 min bij 72 ° C; Houd vervolgens, de plaat bij kamertemperatuur.
- Verwarm de pinnen voor een 96-pin-replicator aan gloeiende met een bunsenbrander en vervolgens afkoelen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Vul de putten van een tweede PCR-plaat met 10 μL van 1 x PCR mix (met een gel belasting-klaar buffer) en de innerlijke vooruit (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') en omgekeerde (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') op 0.5 µM.
- Verwijder voorzichtig de siliconen mat van de PCR-plaat van de 96-wells-plaat uit de eerste ronde PCR, en het voorkomen van kruisbesmetting tussen putten.
- Gebruik de afgekoelde replicator de PCR producten van de 96-wells-plaat van de eerste ronde PCR overbrengen naar de nieuw-aliquoted 96-wells-plaat. Verrichten de genestelde PCR met behulp van dezelfde voorwaarden als in stap 3.8, met uitzondering van de eerste denaturatie stap bij 95 ° C van 10 min omzetten in 2 min.
4. PCR Product isolatie en Gel extractie
- Analyseer de PCR producten door gelelektroforese een 96-Wells met 1,3% w/v agarose gel. Voor een 100 mL agarose gel, uitgevoerd bij 200 V voor 10-15 min.
- De DNA-bands uit de agarose gels wegwerp drinken rietjes met accijnzen. Voor elke PCR-product, plaatst u het stro en agarose gel sluit aan op een 1,5 mL-buis en het stro op maat knippen met een schaar.
Opmerking: Het is voldoende om te isoleren van de bands alleen uit deze verdunningen waarin één PCR producten kunnen worden opgelost. - (Optioneel) Bewaar de buizen bij-20 ° C voor later extractie.
- Werpen de agarose stekkers in elke buis door knijpen op het uiteinde van het stro fragment. 300 μL van gel extractie buffer en 5 μL van gel extractie glazen kraal drijfmest toevoegen aan elke buis.
- Pak de PCR producten volgens de instructies van de fabrikant voor de gel extractie kit (met uitzondering van half-volumes gebruiken voor het wassen van stappen) en elueer de DNA van de kralen met 30 μL van water.
- Indienen van het gezuiverde DNA voor Sanger sequencing (volgens de instructies van de leverancier) met de voorwaartse primer gebruikt in de tweede-ronde genest PCR.
5. de sequentieanalyse
- Virus-cel DNA kruispunten bevestigen door het uitvoeren van de nucleotide BLAST analyse (met behulp van standaardinstellingen uitlijnen aan de gehele nucleotide-collectie).
Opmerking: Representatieve resultaten worden gedetailleerd beschreven in Figuur 3 hieronder.- Als slechts gedeeltelijke aanpassing van de sequentie wordt waargenomen, trim de 5' HBV-DNA-sequentie voordat opnieuw een BLAST analyse worden uitgevoerd.
- Strenge selectiecriteria om te bepalen of een bepaalde reeks een echte integratie junction als volgt aangeeft van toepassing:
- Bevatten alleen sequenties met > 20 bp voor een cellulaire sequence voor vertrouwen toewijzen aan het cellulaire genoom.
- Negeer alle sequenties die beperkingsplaatsen van elke enzymen gebruikt binnen 10 bp van de vermeende virus-cel integratie junction, als zij waarschijnlijk vertegenwoordigen in vitro afbinding gebeurtenissen in plaats van echte integratie kruispunten bevatten.
- Negeren alle sequenties met duidelijk ongelijke fluorescentie pieken aan weerszijden van de kruising van de vermeende integratie in sequencing chromatografen, zoals deze waarschijnlijk artefacten gegenereerd door kruisbesmetting tijdens de sequencing-reactie zijn of capillaire chromatografie.
- Unieke integratie gebeurtenissen definiëren als die met de exacte HBV en cellulaire sequenties op de kruising van de virus-cel.
Opmerking: Herhaling van unieke integratie gebeurtenissen kan voortvloeien uit de klonale uitbreiding van cellen met deze integraties of kruisbesmetting tijdens de PCR (die kan worden getest met behulp van negatieve-control reacties, verder uitgewerkt in de representatieve resultaten Zie hieronder). Herhaalde integraties in specifieke cellulaire opeenvolgingen naar verwachting weer verschillende HBV terminal sites voor elke integratie, zoals niet-homologe einde-toetreding trajecten gebruikte15 zijn.
- Bereken de frequentie van de integratie door te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor van omgekeerde DNA sjablonen door het aantal virus-cel kruispunten gedetecteerd bij die verdunning, gevolgd door normalisatie tot het bedrag van de totale input van het DNA in de inversie-reactie. In het algemeen, de frequentie van de integratie op de orde van 1:10 is4 cellen.
Representative Results
Een schematische weergave van de invPCR-techniek is afgebeeld in Figuur 1. Een voorbeeld van een succesvolle invPCR aan de agarose gelelektroforese is afgebeeld in Figuur 2 vóór en na het PCR product isolement. Figuur 3 toont de output analyse BLAST vanaf stap 5.1 in de gevallen van (i) versterking van virus-cel DNA junction en (ii) versterking van Dr. tussenstof HBV DNA.
Verwachte resultaten van positieve controle: Huh7-NTCP-cellen geïnfecteerd met heparine-gezuiverd HBV voorraden zoals beschreven hierboven (Figuur 1) kunnen dienen als positieve controle. In dit geval moeten één PCR producten worden bereikt door de tweede of derde 1:3-verdunning van elk monster (overeenkomend met ~ 104 cel equivalenten per verdunning, Figuur 2). In deze verdunningen vertegenwoordigt ongeveer 50% van de producten waar virus-cel DNA kruispunten, terwijl de andere helft versterking van HBV DNA tussenproducten (Figuur 3 vertegenwoordigt).
In vorige studies13, hebben we enkele exemplaren van herhaalde virus-cel kruispunten, suggereren geen cellulaire genomic sites van preferentiële integratie van HBV-DNA gevonden. Ook vinden we dat 80% van de >van virus-cel kruispunten tussen nucleotiden 1732 en 1832 (volgens de nucleotide nummering van HBV genotype D, GenBank toetreding #U95551.1) optreden, waarbij de laatste staat voor de rechter eindpunt van het HBV dslDNA formulier. Sequenties van ware virus-cel kruispunten gevonden door onze methode in in vitro experimenten zijn openbaar-beschikbaar op GenBank (toetreding getallen MH057851 naar MH058006).
Verwachte resultaten van negatieve controles: niet-geïnfecteerde cellen van de Huh7-NTCP of Huh7-NTCP geënt vooraf behandeld met Myrcludex B cellen kunnen fungeren als negatieve controles. InvPCR analyse van DNA geëxtraheerd uit deze cellen moet geen PCR producten produceren. Deze negatieve controlemonsters waarop de dezelfde PCR plaat als positieve monsters zorgt voor het testen van kruisbesmetting tijdens het genest-PCR. De meest strenge test voor kruisbesmetting is het uitvoeren van een negatief-controlemonster in putten A-D en de positief monster in putten E-H op een 96-wells-plaat. In dit geval wordt de meest geconcentreerde verdunning van de positief monster uitgevoerd in een rij direct aan de minst geconcentreerde verdunning van het negatief monster. Als versterking producten worden waargenomen in negatieve controlemonsters, Instituut de maatregelen die zijn voorgesteld in de discussie om te minimaliseren van kruisbesmetting gebeurtenissen.
Figuur 1: Schematische afbeelding van het invPCR-proces te detecteren HBV DNA integraties. Nadat HBV-infectie, slechts een minderheid van Huh7-NTCP cellen bevatten HBV dslDNA (rood) geïntegreerd in het ontvangende cel genoom (rood), afgebeeld in het bovenste gedeelte. Vervolgens is totale DNA geëxtraheerd uit de cellen (stap 1), omgekeerd (stap 2) en versterkt door genestelde PCR (stap 3). Getoond worden de relatieve posities van de restrictie-enzym-sites (Ncoik en BsiHKAI) van het kruispunt dat verwijderde virus-cel DNA. De figuur wordt aangepast van een eerdere publicatie13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Agarose gel elektroforese en latere gel extractie van een succesvolle invPCR. "M" vertegenwoordigt DNA marker ladder. Elke rij van 12 geeft technische wordt gerepliceerd in een enkele verdunning op de PCR-plaat. Twee omgekeerde DNA-monsters kunnen worden uitgevoerd per PCR plaat/agarose gel. De PCR-producten voor elke verdunning moeten Titreer uit in een ~ 1:3 verhouding. Extractie van de producten van de twee minst geconcentreerde verdunningen waar enkele bands gemakkelijk geïsoleerd worden kunnen is over het algemeen voldoende, zoals HBV DNA integratie wordt bepaald door titratie van het eindpunt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: BLAST analyse van invPCR product sequenties. Zoals lange stukken volgorde worden gegenereerd vanuit Sanger sequencing, de bron van DNA-sequenties in het algemeen ondubbelzinnig is. Sterke aanpassing aan HBV en cellulaire genomen in verschillende gebieden van het FASTA reeks bestand gegenereerd op basis van Sanger wordt waargenomen in het bovenste netdeel, suggereren een kruispunt waar virus-cel DNA sequencing. In het onderste paneel lijnt de volgorde alleen naar fragmenten van het HBV genoom, een product dat is gegenereerd door de versterking van een andere volgorde HBV-DNA-genoom suggereren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Voordat u het protocol uitvoert, is het belangrijk op te merken dat deze invPCR-test een zeer gevoelige techniek, geschikt is voor losse exemplaren van DNA sjabloon frequentiebanden te versterken. Beperking van de verontreiniging van PCR producten daarom van het allergrootste belang. Algemene strategieën te beperken van PCR product verontreiniging omvatten de volgende. (i) stellen fysiek gescheiden gebieden voor de verschillende stappen van de methode. Elk gebied moeten afzonderlijke labjassen en handschoenen moeten worden gewijzigd tijdens het verplaatsen tussen deze gebieden. Wij gemaakt bben deze gebieden hieronder in volgorde van meest tot minst waarschijnlijk besmet: PCR product extractie en sequencing reactie set-up gebied (post-PCR); PCR sjabloon toevoeging en gevlamd-pins overdracht gebied (we hebben PCR afzuigkappen met een decontaminating UV-lamp met goede resultaten gebruikt); DNA-extractie en inversie gebied (pre-PCR); en een "DNA sjabloon-vrije" ruimte gebruikt uitsluitend voor het voorbereiden van de voorraad en PCR oplossingen. (ii) worden zich bewust van de luchtstroom in het lab als een potentiële bestuurder van kruisbesmetting. Met name kruisbesmetting van PCR reacties tijdens de stap van de overdracht gevlamd pin hoogstwaarschijnlijk te laten plaatsvinden en zal leiden tot onjuiste kwantificering van integratie frequentie. PCR kappen kunnen worden gebruikt om te beperken deze cross-stromingen. Negatieve controle putten (bijvoorbeeld Myrcludex-B-behandelde monsters of geen sjabloon besturingselementen) in de PCR kunnen ook worden gebruikt om te testen voor kruisbesmetting. (iii) het beperken van potentiële verontreinigingen van de PCR op pipetten en oppervlakken werken door regelmatig vegen ze neer met een DNA-afbraak-oplossing.
Het protocol is opgegeven hier gerangschikt te sporen van de integratie van een bekende besmettelijke HBV kloon gegenereerd op basis van de HepAD38 cel lijn42. Indien het entmateriaal gebruikt een verschillende HBV-DNA-sequentie (bijvoorbeeld van patiënten serum), moet vervolgens het HBV genoom worden eerst sequenced Controleer de compatibiliteit van PCR inleidingen en inversie design. In eerder gepubliceerde studies19, hebben we 3 reeksen inleidingen die binden geconserveerde HBV-DNA-sequenties flankerend de verwachte site van HBV DNA integratie kruispunten gebruikt. Andere primer sequenties en protocollen zijn beschreven om te bepalen van de genomic opeenvolging van HBV44,45,46,47,48 en met succes kunnen functioneren.
Bovendien kunnen verschillende HBV-gevoelige cellen (bijvoorbeeld primaire menselijke hepatocyten, gedifferentieerde HepaRG, HepG2-NTCP cellen) worden gebruikt; we hebben echter gevonden dat cellen van de Huh7-NTCP de grootste signal-to-noise verhouding, bieden wanneer gezien het aantal virus-cel DNA kruispunten die worden versterkt ten opzichte van het virus tussenliggende DNA dat versterkte13is. In het bijzonder, ondergaan terminaal gedifferentieerde cellen zoals primaire menselijke hepatocyten of gedifferentieerde HepaRG geen efficiënt mitose, wat resulteert in een hoog niveau van amplifiable HBV DNA Dr. tussenproducten resterende binnen de cellen. We hebben gevonden dat ~ 90% van de versterkte sequenties vertegenwoordigen HBV DNA herschikkingen (en niet integratie evenementen) in terminaal-gesplitste cellen, ten opzichte van 70-50% in hepatoma cel lijnen13. Deze producten zijn over het algemeen HBV-DNA-genoom met grote verwijderingen in het oppervlak en de kern open frames lezen, of ze kunnen vertegenwoordigen HBV quasi-soorten met een extra Ncoik voorafgaand aan de Sphik site site. De versterking van deze HBV-soorten (met inbegrip van een schematisch diagram) zijn beschreven in detail eerder13.
Er zijn verschillende nadelen aan deze methode. Vanwege de moeizame en Meerdaags aard van dit protocol, is invPCR niet geschikt voor high-throughput analyses van een groot aantal monsters. Bovendien, als het gebaseerd is op beperking van verdunning titratie, onze methode is niet zeer nauwkeurige in kwantificering; Hoewel, het moet gemakkelijk meten Logniveau veranderingen in de frequentie van de integratie.
Bovendien, onze inversie-protocol alleen geschikt is om te detecteren integraties tussen de DR2 en DR1 regio van het genoom van HBV, zoals de meerderheid van de HBV integraties binnen deze regio49 plaatsvinden. NGS analyse van HBV geduldige weefsels is gebleken dat een grote minderheid (tot ~ 50%) kan zich ook voordoen buiten deze regio49. Nieuwe invPCR ontwerpen zijn theoretisch kundig voor speurder dit andere sites van integratie, hoewel ze niet (aan onze kennis) zijn nog uitgevoerd. Relatedly, als gevolg van de nodige restrictie-enzym sites vereist stroomafwaarts van de volgorde van de virus-cel kruising voor de inversie reactie, invPCR detecteert niet alle integraties die zich voordoen binnen de DR2 en DR1 regio's van de HBV-genoom (dat wil zeggen, wij hebben naar schatting ~ 10% van alle integraties aantoonbaar met behulp van in silico simulaties13). Echter, wanneer toegepast op een gericht aantal monsters met een klein aantal verschillende behandelingen, invPCR is een van de enige praktische methoden voor het opsporen van geïntegreerde HBV-DNA in een enkele basenpaar resolutie.
Wij daarom voorzien toepassingen van deze methode dienen een belangrijke rol bij het vinden van virale (via mutaties van de HBV entmateriaal), cellulaire (via knock-out of overexpressie van specifieke cellulaire genen, of door toepassing van verschillende drugs) en milieu ( bijvoorbeeld blootstelling aan oxidatieve stress) factoren die HBV DNA integratie veroorzaken. Met deze methode en de nieuw ontwikkelde systemen van HBV-infectie kunnen we ongekende beheersing van deze factoren zodat kunnen zij goed geïsoleerd en beter gekarakteriseerd. Wij verwachten ook dat dit tot een belangrijke begrip van de cellulaire gevolgen van HBV-DNA-integratie leiden zal, met inbegrip van welke mate virale antigenen (bijvoorbeeld HBx of HBsAg50) van de geïntegreerde vorm, wat regelt deze expressie, worden uitgedrukt en al dan niet HBV integratie aanzienlijk verandert het cellulaire fenotype tot een meer pro-oncogene staat. De resultaten van deze toekomstige studies zal een diepgaande invloed hebben op het therapeutische strategieën gebruikt voor de behandeling van chronische hepatitis B en de basiskennis van het virus zelf.
Disclosures
Vinden is een mede-aanvrager en de mede-uitvinder van octrooien bescherming van Myrcludex B als een HBV/HDV-post-remmer. T.T. verklaart geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk ontvangen financiering uit het Duitse centrum voor infectie onderzoek (DZIF), TTU Hepatitis projecten 5.807 en 5.704, de TRR179 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (15 TP), en de Australian Centre voor HIV en Hepatitis Virologie onderzoek.
Wij zijn Professor William Mason dank verschuldigd voor zijn aandeel in de ontwikkeling van de oorspronkelijke methode van de invPCR en het demonstreren aan ons. We zouden graag bedanken Drs. Yi Ni en Florian A. Lempp voor reagentia (cellijnen en HBV entmateriaal). Wij erkennen Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt en Dr. Katrin Schöneweis voor technische bijstand. Wij zijn dankbaar aan Miriam Kleinig voor proeflezen, en professoren Nicholas Shackel en Ralf Bartenschlager voor continue ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15-002 | |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 41965 | |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-151 | Heat-inactivate before use |
| Penicillin, 10,000 U/mL; Streptomycin 10mg/ml, 100× | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine, 200 mM | PAA | M11-004 | |
| Trypsin, 0.5 mg/mL; EDTA, 0.22 mg/mL, 1× | PAA | L11-004 | |
| PEG, MW 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use |
| DMSO for spectroscopy | Merck | 102950 | |
| Tenofovir disoproxil | Sigma-Aldrich | CDS021622 | Dissolve in DMSO |
| Lamivudine | Sigma-Aldrich | L1295 | Dissolve in DMSO |
| NucleoSpin Tissue kit | Macherey Nagel | 740952.250 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193L | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 433209 | |
| Dextran (35-45 kDa) | Sigma-Aldrich | D1662-10G | |
| Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-1L-D | |
| BsiHKAI | NEB | R0570L | |
| SphI-HF | NEB | R3182L | |
| Amplitaq Gold Taq kit | Thermo Fisher Scientific | 4331816 | Use for first nest PCR |
| Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates | Biorad | 2239442 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9890 | |
| 96-well PCR plates | Sigma Aldrich | CLS6509 SIGMA | |
| 96-pin replicator | Thermo Fisher Scientific | 250520 | |
| GoTaq Flexi PCR kit | Promega | M8295 | Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| QIAEX II Gel extraction kit | QIAGEN | 20051 |
References
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis B virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643-3650 (2011).
- Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut. 64 (12), 1972-1984 (2015).
- Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Jilbert, A. R. Conceptual models for the initiation of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Liver International. 35 (7), 1786-1800 (2015).
- Tu, T., Buhler, S., Bartenschlager, R. Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biological Chemistry. 398 (8), 817-837 (2017).
- Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Urban, S. HBV DNA Integration: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Viruses. 9 (4), (2017).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, e00049 (2012).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Tuttleman, J. S., Pourcel, C., Summers, J. Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in hepadnavirus-infected cells. Cell. 47 (3), 451-460 (1986).
- Staprans, S., Loeb, D. D., Ganem, D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. Journal of Virology. 65 (3), 1255-1262 (1991).
- Wang, G. H., Seeger, C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. Cell. 71 (4), 663-670 (1992).
- Tu, T., Budzinska, M. A., Vondran, F. W. R., Shackel, N. A., Urban, S. Hepatitis B virus DNA integration occurs early in the viral life cycle in an in vitro infection model via NTCP-dependent uptake of enveloped virus particles. Journal of Virology. , (2018).
- Yang, W., Summers, J. Integration of hepadnavirus DNA in infected liver: evidence for a linear precursor. Journal of Virology. 73 (12), 9710-9717 (1999).
- Bill, C. A., Summers, J. Genomic DNA double-strand breaks are targets for hepadnaviral DNA integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11135-11140 (2004).
- Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Sequence Analysis of Integrated Hepatitis B Virus DNA during HBeAg-Seroconversion. Emerging Microbes and Infections. , (2018).
- Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Cellular genomic sites of HBV DNA integration. Genes. , (2018).
- Mason, W. S., Liu, C., Aldrich, C. E., Litwin, S., Yeh, M. M. Clonal expansion of normal-appearing human hepatocytes during chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 84 (16), 8308-8315 (2010).
- Tu, T., et al. Clonal expansion of hepatocytes with a selective advantage occurs during all stages of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 22 (9), 737-753 (2015).
- Mason, W. S., et al. HBV DNA Integration and Clonal Hepatocyte Expansion in Chronic Hepatitis B Patients Considered Immune Tolerant. Gastroenterology. 151 (5), 986-998 (2016).
- Shafritz, D. A., Shouval, D., Sherman, H. I., Hadziyannis, S. J., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens. New England Journal of Medicine. 305 (18), 1067-1073 (1981).
- Hino, O., et al. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas in Japan. Hepatology. 4 (1), 90-95 (1984).
- Fowler, M. J., et al. Integration of HBV-DNA may not be a prerequisite for the maintenance of the state of malignant transformation. An analysis of 110 liver biopsies. Journal of Hepatology. 2 (2), 218-229 (1986).
- Chen, J. Y., Harrison, T. J., Lee, C. S., Chen, D. S., Zuckerman, A. J. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinoma: analysis by hybridization with subgenomic DNA fragments. Hepatology. 8 (3), 518-523 (1988).
- Esumi, M., Tanaka, Y., Tozuka, S., Shikata, T. Clonal state of human hepatocellular carcinoma and non-tumorous hepatocytes. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 23 Suppl, S1-S3 (1989).
- Murakami, Y., et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas. Gut. 54 (8), 1162-1168 (2005).
- Kimbi, G. C., Kramvis, A., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B. World Journal of Gastroenterology. 11 (41), 6416-6421 (2005).
- Tamori, A., et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA. Clinical Cancer Research. 11 (16), 5821-5826 (2005).
- Sung, W. K., et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nature Genetics. 44 (7), 765-769 (2012).
- Fujimoto, A., et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nature Genetics. 44 (7), 760-764 (2012).
- Jiang, S., et al. Re-evaluation of the Carcinogenic Significance of Hepatitis B Virus Integration in Hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 7 (9), e40363 (2012).
- Jiang, Z., et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Research. 22 (4), 593-601 (2012).
- Kan, Z., et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Research. 23 (9), 1422-1433 (2013).
- Summers, J., et al. Hepatocyte turnover during resolution of a transient hepadnaviral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (20), 11652-11659 (2003).
- Mason, W. S., Jilbert, A. R., Summers, J. Clonal expansion of hepatocytes during chronic woodchuck hepatitis virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (4), 1139-1144 (2005).
- Mason, W. S., et al. Detection of clonally expanded hepatocytes in chimpanzees with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 83 (17), 8396-8408 (2009).
- Chauhan, R., Churchill, N. D., Mulrooney-Cousins, P. M., Michalak, T. I. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma. Oncogenesis. 6 (4), e317 (2017).
- Tu, T., Jilbert, A. R. Detection of Hepatocyte Clones Containing Integrated Hepatitis B Virus DNA Using Inverse Nested PCR. Methods in Molecular Biology. 1540, 97-118 (2017).
- Ni, Y., Urban, S. Hepatitis B Virus Infection of HepaRG Cells, HepaRG-hNTCP Cells, and Primary Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 15-25 (2017).
- Schulze, A., Schieck, A., Ni, Y., Mier, W., Urban, S. Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction. Journal of Virology. 84 (4), 1989-2000 (2010).
- Lempp, F. A., et al. Evidence that hepatitis B virus replication in mouse cells is limited by the lack of a host cell dependency factor. Journal of Hepatology. 64 (3), 556-564 (2016).
- Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (8), 1715-1720 (1997).
- Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. , (2017).
- Yang, Z. T., et al. Characterization of Full-Length Genomes of Hepatitis B Virus Quasispecies in Sera of Patients at Different Phases of Infection. Journal of Clinical Microbiology. 53 (7), 2203-2214 (2015).
- Chook, J. B., et al. Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G. Journal of Clinical Microbiology. 53 (6), 1831-1835 (2015).
- Li, F., et al. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing. Clinical Microbiology and Infection. 21 (3), 280-287 (2015).
- Zhou, T. C., et al. Evolution of full-length genomes of HBV quasispecies in sera of patients with a coexistence of HBsAg and anti-HBs antibodies. Scientific Reports. 7 (1), 661 (2017).
- Long, Q. X., Hu, J. L., Huang, A. L. Deep Sequencing of the Hepatitis B Virus Genome: Analysis of Multiple Samples by Implementation of the Illumina Platform. Methods in Molecular Biology. 1540, 211-218 (2017).
- Li, X., et al. The function of targeted host genes determines the oncogenicity of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 60 (5), 975-984 (2014).
- Wooddell, C. I., et al. RNAi-based treatment of chronically infected patients and chimpanzees reveals that integrated hepatitis B virus DNA is a source of HBsAg. Science Translational Medicine. 9 (409), (2017).
