Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Oppdagelse av lavt kopi nummer integrert virus-DNA dannet av In Vitro hepatitt B-smitte

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58202
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory, Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Vi beskriver her i vitro generering av HBV DNA via en hepatitt B virus infeksjon system og svært følsom påvisning av (1-2 eksemplarer) integrasjon med inverse nestede PCR.

Abstract

Hepatitt B-viruset (HBV) er en vanlig blodbårne patogen som forårsaker leverkreft og levercirrhose skyldes kronisk infeksjon. Viruset vanligvis replikerer gjennom en episomal DNA mellomliggende; Imidlertid er integrering av HBV DNA i vert genomet observert, selv om skjemaet ikke er nødvendig for viral replikasjon. Den eksakte formålet, tidsberegning og mechanism(s) av hvilken HBV DNA skjer er ennå ikke klart, men nyere data viser at det skjer veldig tidlig etter infeksjon. Her, er i vitro generasjon og påvisning av HBV DNA integrasjoner beskrevet i detalj. Våre protokollen spesielt forsterker enkelt kopier av virus-celle DNA integrasjoner og tillater både absolutt kvantifisering og enkelt-base par oppløsning av krysset sekvensen. Denne teknikken er brukt til ulike HBV-følsomme celletyper (inkludert primære menneskelige hepatocytter), ulike HBV mutanter, og i forbindelse med ulike narkotika eksponeringer. Vi forutse denne teknikken blir en nøkkel analysen å avgjøre de underliggende molekylære mekanismene av fenomenet klinisk relevant.

Introduction

HBV er en double-strandet DNA virus som kan forårsake livslang kronisk infeksjon, fører til skrumplever og hepatocellulært karsinom (HCC)1,2,3. Mens det er flere molekylære mekanismer HBV utholdenhet4 (f.eks høy stabilitet av epigenetic viral transcriptional malen), unndragelse av immun overvåking og lav omsetning av hepatocytter i leveren og assosierte risiko HCC innvielsen5,6 (f.eks kronisk betennelse og aktivering av mobilnettet stress veier), HBV DNA integrering i verten celle genomet (en rapportert mekanisme for begge disse fenomenene) har blitt dårlig undersøkt . En hovedgrunn er mangelen på passende i vitro infeksjon systemer for HBV at pålitelig påvisning av integrering hendelser. Her beskriver vi en nylig utviklet protokoll for både i vitro generasjon og påvisning av HBV DNA integrasjoner som kan brukes til å belyse den underliggende molekylære mekanismer og følgene av dette.

HBV replikering og dannelsen av HBV DNA integrering er anmeldt tidligere i detalj7. Kort, HBV inn hepatocytter med natrium Taurocholate Co-transporting peptid (NTCP) som den viktigste cellulære reseptoren for infeksjon8,9. HBV-nucleocapsids som inneholder HBV-avslappet sirkulær DNA (rcDNA) inn genomet kjernen, hvor rcDNA konverteres til episomal covalently lukket sirkulær DNA (cccDNA). Den kjernefysiske cccDNA fungerer som transcriptional mal for viral mRNAs og pre genomisk RNA (pgRNA)10. HBV utvalg og pgRNA er så pakket inn nye nucleocapsids (bestående av HBV kjernen protein dimers). HBV pgRNA er omvendt-transkribert i nucleocapsid, noe som resulterer i en rcDNA genomet eller en double-strandet lineær DNA (dslDNA) genomet11,12. Disse eldre nucleocapsids som inneholder HBV DNA genomer er endelig innhyllet og eksporteres som virions.

Infeksjon av hepatocytter av innhyllet partikler som inneholder dslDNA molekyler kan føre viral integrering i verten celle genomet13, fører til replikering-inkompetente former for HBV DNA7,14,15. HBV DNA skjer på stedet av chromosomal double-strandet DNA bryter15. Samler bevis antyder at integrering hendelsene oppstår i hovedsak tilfeldig stilling innen verten celle genomet16,17. I tillegg HBV DNA skjer noe sjelden, med en hastighet på 1 per 104 celler13,18,19,20. Viktige spørsmål om HBV DNA integrering forblir ubesvart, spesielt om nøyaktig molekylær trasé involvert, avhengigheten av viral og vert faktorer, viral antigener uttrykt fra integrert skjemaer og deres mulige bidrag viral utholdenhet7. Vi har satt opp en i vitro modell å kaste lys over noen av disse spørsmålene.

Sjeldenhet av HBV DNA integrering hendelser (både med hensyn til integrering rate per celle og kopien antall hver integrasjon) i i vitro HBV-infeksjon modeller gjør dem vanskelig for å oppdage. Cellen mitose er begrenset i våre in vitro -system som dele celler ikke støtter effektiv infeksjon. Dermed smittet i motsetning til pasienten leveren vev hvor betydelig klonal ekspansjon av hepatocytter oppstår18,19,20, svært få (1 til 2) eksemplarer av hver integrering finnes i en gitt celleområde i vitro . Vi har også funnet at hovedsakelig skjer under første infeksjonen hepatocytes (og ikke kontinuerlig i kronisk infisert hepatocytter)13. Følgelig kan ikke HBV DNA integrering økes ved bare dyrking celler for en lengre periode.

Generelt, blot tidligere brukes til å oppdage integrert HBV-DNA, inkludert sørlige hybridisering21,22,23,24,25, Alu PCR26,27 , kassett-mediert ligation PCR28, og hele genomet sekvensering29,30,31,32,33, har ikke følsomheten å oppdage Single-kopier av integrasjoner. Vi og andre forskere har brukt inverse nestede PCR (invPCR) for å oppdage hepadnaviral DNA integrering i duck og hakkespett menneskelige infiserte lever13,14,18,19, 34,35,36. Andre har innført prosessuelle endringer invPCR teknikken som kan endre generering av falske positive signaler og begrense muligheten for kvantifisering37. Hvis analysen utføres som beskrevet i denne protokollen, representerer invPCR en bestemt og følsom analysen som identifiserer og kvantifiserer (i absolutt kopi tall) flere HBV DNA integrasjoner. HBV-cell DNA krysset er sekvensielt på en enkelt-base par oppløsning, slik at bioinformatical studier av viral og vert DNA sekvenser ved integrering13.

Vi har tidligere beskrevet38 resultater fra invPCR på DNA av HBV-infiserte vev Hentet fra en rekke kilder, inkludert snapin-frosne leveren vev, parafin-embedded leveren inndelinger og ekstremt liten vevsprøver isolert av laser-microdissection19. Denne protokollen skisserer en oppdatert versjon av invPCR analysen ved hjelp av DNA utvunnet fra celle kultur-avledet vev etter i vitro infeksjon, der lav kopi antall integrasjoner (1-2 eksemplarer per integrering) er generert. Den HBV DNA integrasjoner dannet i vitro ligner de som finnes i pasienten vev med hensyn til deres distribusjon over mobilnettet genomet og krysset i viral sekvensen som er integrert13,16, antyder en sammenlignbare vei til innenfor en infisert leveren.

Protocol

1. celle infeksjon og DNA utvinning

  1. Opprettholde kulturperler Huh7-NTCP celler8,9 i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 10% v/v fosterets bovin serum, 1 x Penicillin/Streptomycin og 2 mM L-glutamin.
    Merk: Dette er tidligere rapportert i detalj40.
  2. Frø 2 x 105 celler/mL Huh7-NTCP celler i en 12-vel plate med 1 mL av DMEM.
  3. Hvis du tester cellen behandlinger (f.eks HBV hemmere), bruke dem på kultur supernatant 4 h etter seeding (1 dag før HBV-infeksjon). For en negativ kontroll, gjelder 200 nM Myrcludex B (en potent HBV oppføring hemmer41).
  4. Bruke heparin-kolonne renset42 nedbryting fra HepAD3843 som en inoculum for å infisere cellene på 1000 VGE/cell i 500 µL av kultur medier (DMEM med 10% v/v fosterets bovin serum, 1 x Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-glutamin og 2,5% v/v DMSO) som inneholder 4% w/v polyetylenglykol 8000 [oppløst i 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS)].
  5. Kultur cellene i en 37 ° C inkubator (angitt ved 5% CO2 og 90% fuktighet).
  6. Vask cellene to ganger med 1 mL steril 1 x PBS på 16-24 h etter infeksjon.
  7. Erstatte kultur media hver 2 dager etter HBV-infeksjon før innhøsting.
  8. På dag 3 etter infeksjon, behandle cellene med 5 µM Tenofovir disoproxil og 10 µM lamivudin begrense produksjonen av HBV replicative mellomprodukter som er amplifiable av invPCR.
  9. På dag 5 etter infeksjon, trypsinize cellene med 200 µL av Trypsin-EDTA og resuspend dem i 2 mL DMEM (supplert med 10% v/v fosterets bovin serum, 1 x Penicillin/Streptomycin og 2 mM L-glutamin), som også inneholder 5 µM Tenofovir disoproxil og 10 µM Lamivudin.
  10. Overføring av cellen suspensjon til en 6-vel plate å indusere en runde med mitose (som har blitt rapportert å indusere HBV cccDNA44 og andre HBV DNA mellomprodukter som er amplifiable av invPCR).
  11. På dag 7 etter infeksjon, trypsinize utvidet cellene i 400 µL av Trypsin-EDTA og resuspend blandingen i 1 mL av DMEM. Plasser suspensjon i en 1,5 mL tube, pellets cellene med sentrifugering på 500 x g i 5 min og fjerne nedbryting av aspirasjon.
  12. (Valgfritt) Lagre celle pellets på 20 ° C til de er klare for DNA utvinning.
  13. Pakk ut DNA fra cellen pellet bruker en DNA utvinning kit, ifølge instruksjonene fra produsenten. Anslå siste DNA konsentrasjonen bruker optisk densitometry.
    Merk: DNA avkastningen i et 100 μL elueringsrør volum er vanligvis ~ 250-400 ng/μL.

2. inversjon av DNA

  1. Aliquot ~1.5–2.5 μg av totale DNA utdrag fra trinn 1 i en 200 μL PCR rør. Legge til riktig mengde begrensning enzym master-blanding vil resultere i et 40 μL reaksjon volum som inneholder 1 x ufullstendig reaksjon buffer (f.eks., CutSmart buffer) og 10 U Ncojeg HF.
  2. Bland reaksjonene grundig og spinne ned i en liten tube sentrifuge. Inkuber begrensning enzym reaksjonen i en PCR maskin på 37 ° C 1t for optimal fordøyelse effektivitet.
  3. Deaktiver begrensingen enzymet av rugende ved 80 ° C i 20 min.
  4. Overføre hele begrensning enzym reaksjonen på en 1,5 mL tube. Legg 400 μL 1 x T4 DNA ligase buffer og 500 U T4 DNA ligase og bland det godt. Stor reaksjon volumet oppfordrer intra molekylær (i motsetning til Inter molekylær) ligation av fordøyd DNA fragmenter.
  5. Inkuber ligation reaksjonen ved romtemperatur for 2t å sikre fullstendig hemorroider.
  6. Deaktiver T4 DNA ligase på 70 ° C for 20 min.
  7. Tilsett 10 μL av 10% w/v natrium dodecyl sulfate å sikre fullstendig inaktivering av T4-ligase.
  8. Bland rør av puls vortexing og kort Nedspinning reaksjonen blanding. Legge til NaCl en siste konsentrasjon 100 mM og dekstran (35-45 kDa) til en siste konsentrasjon av 90 µg/mL. Bland rør av puls vortexing og kort Nedspinning reaksjonen blanding.
  9. Legge til 900 μL av 100% etanol og bland ved inversjon. Utløse DNA på 20 ° C over natten.
  10. Pellet utfelt DNA med sentrifugering 14.000 x g i 15 min. fjerne nedbryting av aspirasjon med en P200 pipette. Vask pellets med 500 μL 70% v/v etanol og sentrifugering 14.000 x g i 15 min.
  11. Fjerne etanol ved aspirasjon med en P200 pipette. Air-Dry DNA pellet ved romtemperatur for 20 min.
  12. Oppløse pellet i 20 μL H2O. legge til 20 μL en begrensning enzym master-blanding vil resultere i et 40 μL reaksjon volum som inneholder 1 x ufullstendig reaksjon buffer, 5 U av BsiHKAI og 5 U Sph-HF. Incubate begrensning enzym reaksjonen i en varme-blokk på 37 ° C (den optimale temperaturen for Sphjeg-HF) 1t.
  13. Kort Nedspinning reaksjonen blanding. Inkuber begrensning enzym reaksjonen i en varme-blokk ved 65 ° C (den optimale temperaturen for BsiHKAI) i 1 time.
  14. Kort Nedspinning reaksjonen blanding.
  15. Lagre invertert DNA på 20 ° C til neste trinn.

3. nestede PCR

  1. Fjerne potensielle amplicons fra en gjenbrukbare silikon mat sel bruker en DNA fornedrelse løsning, skyll matten grundig med DNA-fritt vann og air-dry det ved romtemperatur mens du forbereder PCR blandingen.
  2. Forberede 1 mL av en 1 x PCR blanding som inneholder den ytre fram (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3) og bakover (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3) primere i en konsentrasjon på 0,5 µM.
  3. Legge til 170 μL 1 x PCR blandingen brønner A1 og E1 i en 96-brønns PCR plate.
  4. Legge til 120 μL 1 x PCR blandingen brønner B1 til H1.
  5. Tilsett 10 μL av invertert DNA fra trinn 2 brønner A1 og E1 (2 forskjellige invertert prøver kan analyseres på samme PCR plate). Mix reaksjonen i hver brønn ved forsiktig pipettering hvert omtrent 10 ganger bruker en P1000 satt til 100 μL.
  6. Serielt fortynne prøver fra brønnene A1 til D1 i 1:3 forholdet ved å overføre 60 μL på hvert trinn. Bland brønnene på hvert trinn ved forsiktig pipettering dem 10 ganger bruke en P1000 satt til 100 μL. Unngå danner bobler. Gjenta trinn 3.6 for godt E1, fortynne ned godt H1.
  7. Aliquot 10 μL reaksjonsblandingen bruke en flerkanals pipette fra brønner A1-H1 i brønner A2-H2, A3-H3, og så videre fram brønner A12-H12 av 96-brønns plate. Dekk PCR platen med tørr silikon mat fra trinn 3.1, trykke fast.
  8. Plasser platen i en PCR-maskin og kjøre følgende program: 10 minutter til 95 ° c. 35 sykluser av 15 s på 95 ° C, 15 s på 54 ° C og 3 min ved 72 ° C; 7 min ved 72 ° C; Trykk hold platen ved romtemperatur.
  9. Varme pinnene av en 96-pinners replikator glødende med en Bunsen brenner og deretter avkjøles i minst 5 minutter ved romtemperatur.
  10. Fylle brønnene av en annen PCR-plate med 10 μL 1 x PCR mix (inneholder en gel belastning-klar buffer) og den indre fram (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3) og bakover (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3) på 0,5 µM.
  11. Nøye fjerne silikon mat fra PCR plate av 96-brønns plate fra første runde PCR, og unngå kryss-kontaminering mellom brønner.
  12. Bruk avkjølt Replikatoren overføre PCR produkter av 96-brønns platen fra første runde PCR til nylig aliquoted 96-brønns plate. Utføre den nestede PCR bruker de samme betingelsene som i trinn 3.8, bortsett fra endre det første rødsprit trinnet på 95 ° C fra 10 min til 2 min.

4. PCR produktet isolasjon og Gel utvinning

  1. Analysere PCR produktene av gel geleelektroforese bruker en 96-brønnen med 1,3% w/v agarose gel. For en 100 mL agarose gel, kjøre 200 V i 10-15 min.
  2. Avgiftsdirektoratet DNA bandene fra agarose geléer bruke engangs sugerør. For hver PCR vare, plasser halm og agarose gel plugg i en 1,5 mL tube og trim halm til størrelse med saks.
    Merk: Det er tilstrekkelig å isolere band fra disse fortynninger som enkeltprodukter PCR kan løses.
  3. (Valgfritt) Lagre rør på 20 ° C for senere utvinning.
  4. Løse ut agarose pluggene til hver rør ved å klemme på slutten av halm fragment. Legge til 300 μL gel utvinning buffer og 5 μL gel utvinning glass bead slurry til hver tube.
  5. Ekstra PCR produktene etter produsentens instruksjoner for gel utvinning kit (bortsett fra benytter halv-volumer for vask trinnene) og elute DNA fra perler med 30 μL vann.
  6. Sende renset DNA for Sanger sekvensering (i leverandørens instruksjoner) med fremover primer brukes i andre-runde nestede PCR.

5. sequence Analysis

  1. Bekreft virus-celle DNA veikryss ved nukleotid BLAST analyse (med standardinnstillingene justere til hele nukleotid samlingen).
    Merk: Representant resultater er beskrevet i Figur 3 nedenfor.
    1. Hvis bare delvis justering av sekvensen er observert, trimme den 5' HBV DNA sekvensen før re-kjører en BLAST analyse.
  2. Bruke strenge utvalgskriteriene for å fastslå om en bestemt sekvens representerer en sann integrering krysset som følger:
    1. Inkluderer bare sekvenser som inneholder > 20 bp en mobilnettet sekvens for trygg tilordning til mobilnettet genomet.
    2. Se bort fra alle sekvenser som inneholder begrensningen områder av noen enzymer brukes innen 10 bp av antatte virus-celle integrering krysset, som de sannsynligvis representerer in vitro ligation hendelser i stedet for sann integrering veikryss.
    3. Ignorere alle sekvenser med åpenbare ulik topp fluorescens nivå på hver side av antatte integrering krysset i sekvensering chromatographs, da disse er sannsynlig artefakter genereres av kryssforurensning under sekvensering reaksjonen eller kapillær kromatografi.
    4. Definere integrasjon hendelser som de med nøyaktig HBV og mobilnettet sekvenser i virus-celle krysset.
      Merk: Repetisjon av integrasjon hendelser kan skyldes klonal ekspansjon av celler som inneholder disse integrasjoner eller krysskontaminering under PCR (som kan testes med negative-kontroll reaksjoner, mer detaljert i representant resultatene nedenfor). Gjentatte integrasjoner i bestemte mobilnettet sekvenser forventes å vise forskjellige HBV terminal områder for hver integrering hendelse, som ikke-homologe slutten-bli veier er brukt15.
  3. Beregne integrering frekvensen ved å multiplisere fortynningsfaktoren invertert DNA maler på antall virus-celle veikryss oppdaget på at fortynning, etterfulgt av normalisering til mengden totalt DNA inngang til inversjon reaksjonen. Vanligvis integrering frekvensen er på 1:104 celler.

Representative Results

En skjematisk fremstilling av invPCR teknikken er vist i figur 1. Et eksempel agarose gel geleelektroforese av en vellykket invPCR er vist i figur 2 før og etter PCR produktet isolasjon. Figur 3 viser BLAST analyse utdataene fra trinn 5.1 i tilfeller av (i) forsterkning av virus-celle DNA krysset og (ii) forsterkning av mellomprodukt HBV DNA replicative.

Forventet resultater fra positiv kontroller: Huh7-NTCP-celler som er infisert med heparin-renset HBV aksjer som beskrevet ovenfor (figur 1) kan tjene som en positiv. I dette tilfellet bør PCR enkeltprodukter oppnås ved andre eller tredje 1:3 fortynning av hvert utvalg (tilsvarende ~ 104 celle ekvivalenter per fortynning, figur 2). På disse fortynninger, vil ca 50% av produkter representere sanne virus-celle DNA veikryss, mens den andre halvparten representerer forsterkning av HBV DNA mellomprodukter (Figur 3).

I tidligere studier13, har vi funnet noen forekomster av gjentatte virus-celle veikryss, antyder ingen mobilnettet genomisk områder av fortrinnsrett HBV DNA integrering. Vi finner også at >80% av virus-celle veikryss oppstår mellom nukleotider 1732 og 1832 (ifølge nukleotid nummereringen av HBV genotype D, GenBank tiltredelse #U95551.1), hvor sistnevnte representerer den høyre endestasjonen for HBV dslDNA form. Sekvenser av ekte virus-celle veikryss funnet gjennom vår metode i vitro eksperimenter er offentlig tilgjengelig på GenBank (tiltredelse tall MH057851 til MH058006).

Forventet resultater fra negative kontroller: infisert Huh7-NTCP celler eller inokulert Huh7-NTCP celler pre-behandlet med Myrcludex B kan fungere som negative kontroller. InvPCR analyse av DNA utvunnet fra disse cellene skal produsere PCR produkter. Kjører prøvene negative-kontroll på samme PCR plate som positive eksempler kan for testing av kryssforurensning under nestede PCR prosessen. Den strengeste testen for kryssforurensning er driften av en negativ-kontroll prøven i brønner A-D og positiv prøven i brønner eh på en 96-brønns plate. I dette tilfellet kjøres mest konsentrerte fortynning av positiv utvalget på rad direkte tilknytning til minst konsentrert fortynning av negative utvalget. Hvis forsterkning produkter er observert i negativ-kontroll prøver, instituttet tiltak som foreslås i diskusjonen å minimere kryssforurensning hendelser.

Figure 1
Figur 1: skjematisk figur av invPCR prosessen å oppdage HBV DNA integrasjoner. Etter HBV-infeksjon, bare et mindretall av Huh7-NTCP celler inneholder HBV dslDNA (rød) integrert i vert celle genomet (rød), avbildet i den øverste delen. Totalt DNA er deretter trukket ut fra cellene (trinn 1), invertert (trinn 2) og forsterket av nestede PCR (trinn 3). Vises de relative plasseringene til webområdene begrensning enzym (Ncojeg og BsiHKAI) i forbrukeravgift virus-celle DNA krysset. Figuren er tilpasset fra en tidligere publikasjon13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Agarose gel gelelektroforese og påfølgende gel utvinning av en vellykket invPCR. "M" representerer DNA markør stigen. Hver rad 12 representerer tekniske gjentak på en enkelt fortynning på PCR tallerkenen. To invertert DNA-prøver kan kjøres per PCR plate/agarose gel. PCR produktene for hver fortynning skal sjarmere ut i en ~ 1:3 forholdet. Utvinning av produktene fra de to minste konsentrert fortynninger hvor enkelt band kan lett isolert er vanligvis tilstrekkelig, som HBV DNA integrering hastighet bestemmes av end-point titrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: BLAST analyse av invPCR produktet sekvenser. Som lang landområder sekvens genereres fra Sanger sekvensering, kilden til DNA-sekvenser er generelt entydig. Sterk justering HBV og mobilnettet genomer er observert i ulike områder av FASTA sekvens filen genereres fra Sanger sekvensering i toppanelet, antyder en ekte virus-celle DNA knutepunkt. I det nedre panelet justerer rekkefølgen kun for fragmenter av HBV genomet, foreslå et produkt som er generert av forsterkning av en omlegge HBV DNA genom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Før du utfører protokollen, er det viktig å merke seg at denne invPCR analysen er en høylig følsom teknikk, kan forsterke enkelt kopier av DNA mal. Derfor er begrense forurensning fra PCR produkter av største betydning. De generelle strategier for å begrense PCR kontaminering av produktet omfatter følgende: (i) opprette fysisk separate områder for fremgangsmåten av metoden. Hvert område må separat labfrakker, og hansker bør endres når du flytter mellom disse områdene. Vi har listet opp disse områdene nedenfor i rekkefølge fra mest til minst sannsynlig å være forurenset: PCR utvinning og sekvensering reaksjon oppsett produktområdet (post-PCR); PCR mal tillegg og flammet-pin overføre området (vi har brukt PCR hetter med en decontaminating UV-lampe med gode resultater). DNA utvinning og inversjon området (pre-PCR); og "DNA mal-fri" utelukkende for tilberedning lager og PCR løsninger. (ii) være klar over luftstrømmen i laboratoriet som potensialet sjåfør av kryss-kontaminering. Kryssforurensning PCR reaksjoner under flammet pin overføring trinnet er spesielt passende og føre til unøyaktig kvantifisering av integrasjon frekvens. PCR hetter kan brukes til å begrense disse cross-strøm. Negativ kontroll brønner (f.eks Myrcludex B-behandlet prøver eller ingen mal-kontroller) i PCR kan også brukes til å teste kryssforurensning. (iii) begrense potensielle PCR forurensninger på Pipetter og arbeid overflater av regelmessig tørke dem med en DNA fornedrelse løsning.

Protokollen som er angitt her arrangeres å oppdage integrering av en kjent smittsomme HBV klone generert fra HepAD38 celle linje42. Hvis inoculum brukes av en annen HBV DNA sekvens (f.eks fra pasienten serum), deretter HBV genomet bør være først i rekkefølge for å bekrefte kompatibilitet PCR primere og inversjon design. I tidligere publiserte undersøkelser19, har vi brukt 3 sett med primer som binder bevarte HBV DNA-sekvenser flankert forventet stedet for HBV DNA integrering veikryss. Andre primer sekvenser og protokoller har blitt beskrevet for å fastslå genomisk sekvensen av HBV44,45,46,47,48 , og kan fungere.

Videre kan ulike HBV-følsomme celler (f.eks primære menneskelige hepatocytter, differensiert HepaRG, HepG2-NTCP celler) brukes; Vi har imidlertid funnet at Huh7-NTCP celler gir det største signal-til-støy-forholdet, når de vurderer hvor mange virus-celle DNA veikryss som er forsterket i forhold til det mellomliggende DNA som er forsterket13. Spesielt gjennomgår terminalt differensierte celler som primære menneskelige hepatocytter eller differensiert HepaRG ikke effektivt mitose, noe som resulterer i høy amplifiable HBV DNA replicative mellomprodukter gjenværende i cellene. Vi har funnet at ~ 90% av forsterket sekvenser representerer HBV DNA rearrangements (og ikke integrering hendelser) i terminalt-differensiert celler, sammenlignet med 70-50% i hepatoma cellen linjer13. Disse produktene er vanligvis HBV DNA genomer inneholder store slettinger i overflaten og kjernen åpne lesing rammer, eller de kan representere HBV kvasi arter med en ekstra Ncojeg området før Sphjeg området. Forsterkning av disse HBV arter (inkludert en skjematisk diagram) har blitt beskrevet i detalj tidligere13.

Det er flere ulemper til denne metoden. På grunn av arbeidskrevende og flerdags natur denne protokollen, er invPCR ikke egnet for høy gjennomstrømming analyser av mange eksempler. Videre, som det begrense fortynning titrering, vår metode er ikke veldig presis i kvantifisering; Selv om det bør lett måler loggnivå endringer i integrering frekvens.

Dessuten er våre inversjon protokollen bare egnet til å oppdage integrasjoner oppstår mellom DR2 og DR1 regionen HBV genomet, som fleste av HBV integrasjoner forekommer i denne regionen49. NGS analyse av HBV pasienten vev har vist at et stort mindretall (opp til ~ 50%) kan også oppstå utenfor denne regionen49. Nye invPCR design er teoretisk kunne oppdage disse andre integrering nettsteder, men de har ikke (til vår kunnskap) vært utført ennå. Relatedly, på grunn av de nødvendige begrensning enzym nettstedene kreves nedstrøms fra virus-celle krysset sekvensen for inversjon reaksjonen, invPCR oppdager ikke alle integrasjoner innenfor regionene DR2 og DR1 av HBV genomet (dvs. vi har anslått at ~ 10% av alle integrasjoner er synlig bruker i sili simuleringer13). Men når den brukes til en fokusert gruppe av prøver med lite antall forskjellige behandlinger, er invPCR en av de eneste praktiske metodene for å oppdage integrert HBV DNA på én base par oppløsning.

Vi ser derfor anvendelser av denne metoden serverer en nøkkelrolle i å finne viral (via mutasjoner av HBV-inoculum), mobil (gjennom knockout eller overuttrykte bestemt cellulære gener, eller gjennom bruk av ulike stoffer) og miljømessige ( f.eks eksponering for oksidativt stress) faktorer som induserer HBV DNA integrering. Med denne metoden og nyutviklet HBV-infeksjon systemer aktivere vi uovertruffen kontroll av disse faktorene slik at de kan være godt isolert og bedre preget. Vi forventer at dette vil føre til en nøkkel forståelse av mobilnettet konsekvensene av HBV DNA integrasjon, inkludert hvilken grad viral antigener (f.eks HBx eller HBsAg50) uttrykkes fra integrert skjemaet hva styrer denne uttrykket og om HBV integrering endrer mobilnettet fenotypen mot en mer pro-kreftfremkallende tilstand. Resultatene av disse fremtidige studier vil ha en betydelig innflytelse på strategiene brukes til behandling av kronisk hepatitt B og grunnleggende forståelse av selve viruset.

Disclosures

S.U. er en co søkeren og oppfinnerne av patenter beskytter Myrcludex B som en HBV/HDV oppføring inhibitor. T.T. erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet mottatt finansiering fra tysk sentrum for infeksjon forskning (DZIF), TTU hepatitt prosjekter 5.807 og 5.704, den tyske Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15), og australske sentrum for HIV og hepatitt virologi forskning.

Vi er gjeld til Professor William Mason for sin del i å utvikle den opprinnelige invPCR metoden og demonstrere det til oss. Vi vil gjerne takke Dr. Yi Ni og Florian A. Lempp for reagenser (linjer og HBV inoculum). Vi erkjenner Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt og Dr. Katrin Schöneweis for teknisk assistanse. Vi er takknemlige til Miriam Kleinig for korrekturlesing og professorer Nicholas Shackel og Ralf Bartenschlager for kontinuerlig støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s PBS PAA H15-002
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 41965
Fetal bovine serum PAA A15-151 Heat-inactivate before use
Penicillin, 10,000 U/mL; Streptomycin 10mg/ml, 100× PAA P11-010
L-glutamine, 200 mM PAA M11-004
Trypsin, 0.5 mg/mL; EDTA, 0.22 mg/mL, 1× PAA L11-004
PEG, MW 8000 Sigma-Aldrich 89510 Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy Merck 102950
Tenofovir disoproxil Sigma-Aldrich CDS021622 Dissolve in DMSO
Lamivudine Sigma-Aldrich L1295 Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit Macherey Nagel 740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NcoI-HF NEB R3193L
T4 DNA ligase NEB M0202T
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 433209
Dextran (35-45 kDa) Sigma-Aldrich D1662-10G
Absolute Ethanol Sigma-Aldrich 32205-1L-D
BsiHKAI NEB R0570L
SphI-HF NEB R3182L
Amplitaq Gold Taq kit Thermo Fisher Scientific 4331816 Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates Biorad 2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution Thermo Fisher Scientific AM9890
96-well PCR plates Sigma Aldrich CLS6509 SIGMA
96-pin replicator Thermo Fisher Scientific 250520
GoTaq Flexi PCR kit Promega M8295 Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose Biozym 840004
QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN 20051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, X., et al. Chronic hepatitis B virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  2. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  3. Huang, Y. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643-3650 (2011).
  4. Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut. 64 (12), 1972-1984 (2015).
  5. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Jilbert, A. R. Conceptual models for the initiation of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Liver International. 35 (7), 1786-1800 (2015).
  6. Tu, T., Buhler, S., Bartenschlager, R. Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biological Chemistry. 398 (8), 817-837 (2017).
  7. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Urban, S. HBV DNA Integration: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Viruses. 9 (4), (2017).
  8. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, e00049 (2012).
  9. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  10. Tuttleman, J. S., Pourcel, C., Summers, J. Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in hepadnavirus-infected cells. Cell. 47 (3), 451-460 (1986).
  11. Staprans, S., Loeb, D. D., Ganem, D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. Journal of Virology. 65 (3), 1255-1262 (1991).
  12. Wang, G. H., Seeger, C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. Cell. 71 (4), 663-670 (1992).
  13. Tu, T., Budzinska, M. A., Vondran, F. W. R., Shackel, N. A., Urban, S. Hepatitis B virus DNA integration occurs early in the viral life cycle in an in vitro infection model via NTCP-dependent uptake of enveloped virus particles. Journal of Virology. , (2018).
  14. Yang, W., Summers, J. Integration of hepadnavirus DNA in infected liver: evidence for a linear precursor. Journal of Virology. 73 (12), 9710-9717 (1999).
  15. Bill, C. A., Summers, J. Genomic DNA double-strand breaks are targets for hepadnaviral DNA integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11135-11140 (2004).
  16. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Sequence Analysis of Integrated Hepatitis B Virus DNA during HBeAg-Seroconversion. Emerging Microbes and Infections. , (2018).
  17. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Cellular genomic sites of HBV DNA integration. Genes. , (2018).
  18. Mason, W. S., Liu, C., Aldrich, C. E., Litwin, S., Yeh, M. M. Clonal expansion of normal-appearing human hepatocytes during chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 84 (16), 8308-8315 (2010).
  19. Tu, T., et al. Clonal expansion of hepatocytes with a selective advantage occurs during all stages of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 22 (9), 737-753 (2015).
  20. Mason, W. S., et al. HBV DNA Integration and Clonal Hepatocyte Expansion in Chronic Hepatitis B Patients Considered Immune Tolerant. Gastroenterology. 151 (5), 986-998 (2016).
  21. Shafritz, D. A., Shouval, D., Sherman, H. I., Hadziyannis, S. J., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens. New England Journal of Medicine. 305 (18), 1067-1073 (1981).
  22. Hino, O., et al. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas in Japan. Hepatology. 4 (1), 90-95 (1984).
  23. Fowler, M. J., et al. Integration of HBV-DNA may not be a prerequisite for the maintenance of the state of malignant transformation. An analysis of 110 liver biopsies. Journal of Hepatology. 2 (2), 218-229 (1986).
  24. Chen, J. Y., Harrison, T. J., Lee, C. S., Chen, D. S., Zuckerman, A. J. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinoma: analysis by hybridization with subgenomic DNA fragments. Hepatology. 8 (3), 518-523 (1988).
  25. Esumi, M., Tanaka, Y., Tozuka, S., Shikata, T. Clonal state of human hepatocellular carcinoma and non-tumorous hepatocytes. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 23 Suppl, S1-S3 (1989).
  26. Murakami, Y., et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas. Gut. 54 (8), 1162-1168 (2005).
  27. Kimbi, G. C., Kramvis, A., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B. World Journal of Gastroenterology. 11 (41), 6416-6421 (2005).
  28. Tamori, A., et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA. Clinical Cancer Research. 11 (16), 5821-5826 (2005).
  29. Sung, W. K., et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nature Genetics. 44 (7), 765-769 (2012).
  30. Fujimoto, A., et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nature Genetics. 44 (7), 760-764 (2012).
  31. Jiang, S., et al. Re-evaluation of the Carcinogenic Significance of Hepatitis B Virus Integration in Hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 7 (9), e40363 (2012).
  32. Jiang, Z., et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Research. 22 (4), 593-601 (2012).
  33. Kan, Z., et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Research. 23 (9), 1422-1433 (2013).
  34. Summers, J., et al. Hepatocyte turnover during resolution of a transient hepadnaviral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (20), 11652-11659 (2003).
  35. Mason, W. S., Jilbert, A. R., Summers, J. Clonal expansion of hepatocytes during chronic woodchuck hepatitis virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (4), 1139-1144 (2005).
  36. Mason, W. S., et al. Detection of clonally expanded hepatocytes in chimpanzees with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 83 (17), 8396-8408 (2009).
  37. Chauhan, R., Churchill, N. D., Mulrooney-Cousins, P. M., Michalak, T. I. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma. Oncogenesis. 6 (4), e317 (2017).
  38. Tu, T., Jilbert, A. R. Detection of Hepatocyte Clones Containing Integrated Hepatitis B Virus DNA Using Inverse Nested PCR. Methods in Molecular Biology. 1540, 97-118 (2017).
  39. Ni, Y., Urban, S. Hepatitis B Virus Infection of HepaRG Cells, HepaRG-hNTCP Cells, and Primary Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 15-25 (2017).
  40. Schulze, A., Schieck, A., Ni, Y., Mier, W., Urban, S. Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction. Journal of Virology. 84 (4), 1989-2000 (2010).
  41. Lempp, F. A., et al. Evidence that hepatitis B virus replication in mouse cells is limited by the lack of a host cell dependency factor. Journal of Hepatology. 64 (3), 556-564 (2016).
  42. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  43. Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. , (2017).
  44. Yang, Z. T., et al. Characterization of Full-Length Genomes of Hepatitis B Virus Quasispecies in Sera of Patients at Different Phases of Infection. Journal of Clinical Microbiology. 53 (7), 2203-2214 (2015).
  45. Chook, J. B., et al. Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G. Journal of Clinical Microbiology. 53 (6), 1831-1835 (2015).
  46. Li, F., et al. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing. Clinical Microbiology and Infection. 21 (3), 280-287 (2015).
  47. Zhou, T. C., et al. Evolution of full-length genomes of HBV quasispecies in sera of patients with a coexistence of HBsAg and anti-HBs antibodies. Scientific Reports. 7 (1), 661 (2017).
  48. Long, Q. X., Hu, J. L., Huang, A. L. Deep Sequencing of the Hepatitis B Virus Genome: Analysis of Multiple Samples by Implementation of the Illumina Platform. Methods in Molecular Biology. 1540, 211-218 (2017).
  49. Li, X., et al. The function of targeted host genes determines the oncogenicity of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 60 (5), 975-984 (2014).
  50. Wooddell, C. I., et al. RNAi-based treatment of chronically infected patients and chimpanzees reveals that integrated hepatitis B virus DNA is a source of HBsAg. Science Translational Medicine. 9 (409), (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 141: HBV DNA integrasjon Myrcludex B leverkreft double-strandet lineær DNA inverse nestede PCR virus oppføring viral utholdenhet
Oppdagelse av lavt kopi nummer integrert virus-DNA dannet av <em>In Vitro</em> hepatitt B-smitte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tu, T., Urban, S. Detection of Low… More

Tu, T., Urban, S. Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection. J. Vis. Exp. (141), e58202, doi:10.3791/58202 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter