Summary
Avα β3 integrina é um tipo de proteína de adesão que é altamente expressa em células endoteliais ativadas submetidos a angiogênese. Assim, avaliar a integridade da integrina é de grande interesse em Oncologia. Aqui, apresentamos um método para preparar radiopeptides Ga-rotulado de 68e um método para avaliar sua eficácia biológica.
Abstract
Avα β3 integrina é uma molécula de adesão heterodimérica envolvidos na angiogênese e migração de células do tumor. A integrina é overexpressed em células endoteliais tumor angiogênico, onde normalmente tem uma baixa concentração. Esta expressão específica de αvβ3 torna um biomarcador válido para antiangiogênica e drogas de imagem. Como uma modalidade de imagem funcional, tomografia por emissão de pósitrons (PET) fornece informações sobre bioquímicos e fisiológicos muda na vivo, devido a sua alta sensibilidade única na escala nanomolar. Daí, baseada em radiometal radiofármacos de PET recebeu grande atenção para a quantificação não-invasivo de angiogênese do tumor. Este artigo fornece um protocolo sistêmico para preparar um novo peptídeo radiometal-etiquetados para a avaliação da angiogênese. Este protocolo contém informações sobre confiabilidade radioquímica, Lipofilicidade, absorção celular, estabilidade de soro e propriedades farmacocinéticas. A 68Ga-RGD-peptídeo é um dos ligantes PET representativas em direção αvβ3 integrina. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar um 68Ga-RGD-peptídeo e a avaliação da sua eficácia biológica.
Introduction
Angiogênese é um processo biológico que é caracterizado pelo desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. Entre muitos fatores angiogenetic, αvβ3 integrina está associada a invasividade, porque a integrina é altamente expressa em vasos de tumor angiogênico mas está ausente no tecido normal1.
Radiolabeled peptídeos de ligação ao receptor, com domínio de aspartato (RGD) glicina de arginina, que tem uma elevada afinidade para os receptores integrinas αvβ3 , são considerados promissores angiogênese agentes2,3 de imagem , 4 , 5 , 6 , 7. foram criados vários radiofármacos para PET e suas propriedades biológicas foram validadas em vários modelos animais8,9,10,11. Em termos de um radionuclídeo, 68Ga tem várias vantagens sobre outros radioisótopos. Em primeiro lugar, tem uma elevada acessibilidade para utilizadores e é economicamente vantajoso porque um ciclotron não é necessária. Em segundo lugar, 68Ga-baseado os medicamentos radiofarmacêuticos produzem alta resolução espacial comparada com a tomografia por emissão de fóton único computadorizada (SPECT), permitindo a quantificação mais precisa. Por último, o Half-Life 67,71 minutos de 68Ga pode ser suficiente para a preparação de pequenos peptídeos ou proteínas.
Para produzir um complexo estável com 68Ga, foram desenvolvidos muitos quelantes. Quelantes representativas são o ácido 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic (Roberta), ácido 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-etilenodiaminotetracético (DOTA), ácido 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic ácido (DTPA) e N, N'-di(2-hydroxybenzyl) etilenodiamina-N, N'-ácido diacetic (HBED). NOTA tem sido relatado para formar um complexo altamente estável com 68Ga (log estabilidade constante 30.98)12,13,14.
O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo conciso para o desenvolvimento de um novo radiopeptide (Figura 1). Por exemplo, preparamos 68Ga-rotulado RGD-peptídeos e presentes métodos de avaliação biológica destes análogos em um modelo de transplante.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de pesquisa em protocolos aprovados pelo Instituto de Coreia de radiológica e Comitê de estudos médico Ciências Animal. Todos os reagentes e solventes foram comprados e utilizados sem mais purificação. NOTA-RGD-peptídeos foram preparadas de acordo com a literatura métodos15.
Cuidado: 68Ga emite tanto pósitrons e raios gama. Todos os experimentos, incluindo contacto directo ou indirecto com substâncias radioactivas, devem ser efectuados por treinados e autorizados pelo pessoal. Ao manusear materiais radioativos, devem ser usados equipamento de proteção adequado, blindagem, distintivo do dosímetro de radiação e anéis e um medidor de pesquisa.
1. radioativos RGD-peptídeos com 68GaCl3
Nota: 68Ga (t1/2 = 68 min, β+ = 89% e CE = 11%) foi obtido o 68Ga / gerador de Ge de68.
- Eluir a 68GaCl3 do gerador com 4 mL de 0,05 M de HCl.
- Purga com nitrogênio a 80 ° C por 30 min secar 68GaCl3 (333 kBq, 1 mL) em um frasco de reação de 5 mL.
- Adicionar uma solução de peptídeo-RGD (100 µ g) em 1 M de acetato de sódio (100 µ l, pH 5-6) para o frasco de reação contendo 68GaCl3 da etapa 1.2.
- Aqueça a mistura de reação a 80 ° C por 5 min. Então, acalme-se até à temperatura.
- Purifica o produto bruto com a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Use o seguinte sistema: uma coluna de C-18, uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, um declive gradiente de acetonitrilo de 1.17%/min (5% - 40% em 30 min) e componentes de eluição: A = 0,1% ácido trifluoroacético (TFA) em acetonitrila, B = 0,1% TFA na água.
Nota: O HPLC é equipado com um fotodiodo matriz e um detector de radioatividade. A 68Ga-RGD-peptídeo foi coletado em um tempo de retenção de 12,5 min (Figura 2). - Purifica o resultante 68Ga-RGD-peptide usando um sistema de extração de fase sólida.
- Transferir a solução através de um cartucho de fase reversa C18 e lave com 2 mL de solução salina.
- Eluir 68Ga-RGD-peptídeo com 0,7 mL de etanol a 95%. Remover o solvente a 80 ° C sob gás nitrogênio por 20 min e reconstituir com fosfato salino (PBS) antes do uso.
- Filtrar o radiolabeled do produto através de um filtro de 0,22 µm estéril e formular em 1 mL de solução salina estéril.
- Verificar o rendimento de radioquímica por cromatografia de camada fina rádio (TLC).
- Spot 1 µ l sobre uma placa de cromatografia de camada fina instantânea (ITLC, 10 cm de comprimento). Desenvolva a placa em uma câmara contendo o eluente (ácido cítrico em solução aquosa 0,1 M, pH 5,0) até 9 cm de distância do local.
Nota: O fator de retenção para 68Ga-RGD-peptide é 0 e o factor de retenção não tenha reagido 68Ga3 + é 1.
- Spot 1 µ l sobre uma placa de cromatografia de camada fina instantânea (ITLC, 10 cm de comprimento). Desenvolva a placa em uma câmara contendo o eluente (ácido cítrico em solução aquosa 0,1 M, pH 5,0) até 9 cm de distância do local.
- Calcule a atividade final específica da relação de radioatividade correspondente para a não-radioactividade como nmol/MBq.
Nota: Após a injeção de 100 µ l de formulado 68Ga-RGD-peptide para HPLC, a quantidade de componente não-radioativo foi calculada a partir da curva de calibração padrão usando nonradioactive Ga-RGD-peptídeo.
2. in Vitro absorção celular
Nota: Células de glioblastoma humano Uppsala 87 Glioma maligno (U87MG) foram cultivadas em meios da águia modificados de Dulbecco (DMEM), suplementados com 10% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina. As células foram cultivadas em pratos de 150 mm a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO2umidificada. As células foram colhidas ou dividir por tripsinização: tripsina 0,25% (p/v) e 0,02% (p/v) ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS a 37 ° C, por 3-5 min.
- Células de U87MG sementes em placas de 6-poços em uma densidade de 1 x 106 células/poço.
- Incube as celulas com 68Ga-RGD-peptide (111 kBq) a 37 ° C para 30, 60, 90 e 120 min. preparar as amostras em triplicata.
- Lavar as células 2 x com 2 mL de PBS e colheita por tripsinização. Use tripsina 0,25% (p/v) e 0,02% (p/v) o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS a 37 ° C por 3-5 min.
- Recolha a suspensão de células (500 µ l) e medida em um contador-γ.
- Calcule a porcentagem absorção do composto pelas células por % (contagens nas contagens de células/total).
3. in Vitro estabilidade de soro
- Adicione 500 µ l de soro rato recentemente preparada, 500 µ l de soro humano e 500 µ l de PBS. Incube a mistura a 37 ° C por 2 h.
- Avaliar por ITLC os intervalos de tempo especificado (30, 60, 90 e 120 min). Manchar a alíquota de 1-2 µ l da mistura para a placa ITLC (fase móvel: ácido cítrico de 0,1 M). Desenvolva a placa como na etapa 1.7.
Nota: 68Ga3 + é esperado para mover-se com a frente do solvente, Considerando que o composto rotulado permanecerá na origem.
4. determinação da Lipofilicidade
- Adicionar 68Ga-RGD-peptide (3,7 MBq, 3,7 µ l) para o sistema de octanol-PBS (1:1, v/v, total 1 mL).
- Misture os frascos vigorosamente durante 5 min à temperatura ambiente e centrifugar 10.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Tirar 100 µ l amostras de cada camada e medir a radioatividade com um contador de γ. O valor relatado log P baseia-se na média das três amostras.
5. tumor modelo
Nota: Camundongos BALB/c (6-8 semanas velho, fêmea, n = 23) foram utilizados para este estudo. Os ratos foram posteriormente utilizados para estudos de PET (n = 3) e biodistribuição (n = 20) quando os volumes de tumor chegaram a 200-300 mm3 (1-2 semanas após o implante).
- Carrega pilhas do tumor em 28 G, seringas de insulina 1/2 polegada.
- Injete células de U87MG (5 x 106) em 100 µ l de PBS para a região do braço esquerdo.
- Anestesia o mouse com 2% de isoflurano em gás oxigênio durante a injeção de célula.
- Certifique-se de que o mouse tem sido anestesiado pela perda do pedal retirada reflexa seguir beliscar com a pinça entre os dedos do pé direito traseiro. Não abandone um animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
6. quantificação in Vivo de αvβ3 integrina usando PET
- Anestesia os ratos com 2% de isoflurano em oxigênio.
- Certifique-se de que o mouse tem sido anestesiado pela perda do pedal retirada reflexa seguir beliscar com a pinça entre os dedos do pé direito traseiro. Não abandone um animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
- Coloque a cabeça no centro do pórtico do PET.
- Administre por via intravenosa solução Ga-RGD-peptide (MBq 7.4, 200 µ l) a 68para o enxerto do mouse modelo através da veia da cauda para 1 min.
- Ao mesmo tempo, realizar um PET scan no modo de lista (análise dinâmica) para 150 min.
Nota: Os dados brutos de PET foram reconstruídos por um frame de tempo definido pelo usuário (isto é, cada 30 min). Após a verificação do animal de estimação, uma varredura de microtomografia computadorizada (CT) (50 kVp de raios-x, 0.16 mA) foi conduzido para a correção da atenuação.
7. biodistribuição Ex Vivo
- Injete a veia da cauda do modelo do rato de xenoenxertos 68Ga-RGD-peptide (0.37 MBq, 200 µ l). Anestesia o mouse com 2% de isoflurano em gás oxigênio durante as injeções.
Nota: Camundongos BALB/c, conforme descrito na seção 5, foram divididos em quatro grupos e sacrificados em pontos de tempo diferente (n = 5 por grupo). - Acorda os ratos imediatamente após a administração de 68Ga-RGD-peptídeo e sacrificá-los em 30, 60, 90 e 120 min postinjection com a eutanásia de dióxido de carbono.
Nota: Os tecidos de interesse foram extraídos. Alvos selecionados foram o sangue, músculo, coração, pulmão, fígado, baço, estômago, intestino, rins, ossos e tumor. - Pesar o tecido e medir a radioatividade com um contador de γ.
Nota: Os resultados foram expressos como a percentagem de dose injetada por grama de tecido (% ID/g).
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Representative Results
A quelação de 68GaCl3 com o NOTA-RGD-peptide era simples, sendo o rendimento radiolabeling 99%. Impurezas de reação foram removidas com êxito como mostrado na Figura 2. A pureza radioquímica de 68Ga-RGD-peptídeo era superior a 99%, sendo atividade específica ao final da síntese 90-130 MBq/nmol (Figura 3).
A absorção de célula valores para 68Ga-RGD-peptídeo foram de 1,49%, 0,85%, 0,36% e 0,39% aos 30, 60, 90 e 120 min, respectivamente. Estabilidade de soro mostrou que 68Ga-RGD-peptide permaneceu quase intacto após 2 h de incubação com humanos ou soro de rato, bem como a PBS (> 92% estabilidade a 2 h). O coeficiente de partição (log P) foi de 2,96, indicando alta Lipofilicidade. PET mostrou uma absorção elevada inicial nos órgãos principais, incluindo o fígado, rim, coração, músculo e tumor. No entanto, no final do período (90-150 min), a região do tumor foi visualizada claramente. A relação tumor-à-músculo em 90 min foi 17.57 e permaneceu inalterada, indicando estabilidade cinética. A biodistribuição ex vivo mostrou que a radioatividade acumulada no tumor 6.19, 4.96, 4.44 e 4.39 (% ID/g) em 30, 60, 90 e 120 min, respectivamente. Os resultados do experimento ex vivo estavam em conformidade com o no vivo conclusões PET (Figura 4).
Figura 1 : Diagrama de fluxo dos procedimentos experimentais. Esta figura mostra uma visão esquemática do desenvolvimento de radiofarmacêutico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Purificação de 68Ga-RGD-peptide por HPLC. Azul é sinal de radioactividade e preto é sinal de ultravioleta (UV). O comprimento de onda UV é 314 nm. O eixo x é o tempo e o eixo y é unidade de absorvância (AU). A 68Ga-RGD-peptídeo tem 12,4 min de tempo de retenção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Estrutura de 68Ga-RGD-peptídeo e sua pureza radioquímica. O ITLC de 68Ga-RGD-peptide mostrou alta pureza radioquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : PET imagem latente (superior) e ex vivo dados de biodistribuição para 68 Ga-RGD-peptide (baixa). Dados de animais foram expressos na escala de SUV de 0 a 5. Dados de biodistribuição mostrados são a média ± o desvio-padrão de cinco ratos em cada ponto de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No presente estudo, apresentamos um protocolo para preparar um radiopeptide visando αvβ3 integrina e sua avaliação biológica. Desenvolvimento de drogas tradicional envolve um procedimento complicado. Requer uma grande quantidade de material de referência e um tempo relativamente longo de avaliação. Embora a metodologia sugerida não pode substituir o processo de avaliação delicado, este sistema pode ser usado para fins de triagem. Esta proposta sistema reduziria consideravelmente o tempo e custo.
Na última década, muitos radiolabeled RGD-peptídeos têm sido muito estudados como radiotracers para tumores16de imagem. Para obter os medicamentos radiofarmacêuticos promissoras para ensaios clínicos, abordagens sistêmicas para o desenvolvimento de drogas devem ser fornecidas. Viabilidade de radioquímica, alta seletividade-afinidade para o alvo, estabilidade metabólica e farmacocinética adequada são quatro grandes preocupações. Para um estudo de PET de rotina, um rendimento razoável de radioquímica garante a confiabilidade dos radiofármacos. As questões de alta afinidade (> nM) e seletividade (> 100 x) para o destino proteína também sejam preenchidas. Em termos de farmacocinética, o palpador de PET do candidato é rapidamente excretado do tecido não-alvo e tem um tempo de retenção longa no tumor, permitindo uma relação elevada do alvo-de-referência. Os medicamentos radiofarmacêuticos candidato não devem ter metabólitos problemático na vivo que poderia aumentar a ligação não-específica e fornecer imagens de baixo contraste. É importante avaliar as características abrangentes, porque cada termo influencia as outras propriedades, que não são independentes.
O radiopeptide introduzido nesta pesquisa tem propriedades de drogas, como apropriadas. A 68Ga-RGD-peptídeo tem um alto rendimento de radioquímica de 99%, estabilidade metabólica e Lipofilicidade adequada. No experimento em vivo , a radiopeptide exibiu alta seletividade (relação de tumor-de-referência = 17.57), e os dados de biodistribuição ex vivo também mostraram absorção significativa do tumor (até 6.19% ID/g).
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um programa de desenvolvimento da pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF) subvenção financiada pelo governo coreano (n º 2017M2A2A6A02019904) e pesquisa Nuclear.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 68Ga/68Ge generator | ITG Company | - | 10 mCi |
| Hydrogen chloride solution | Sigma-aldrich | 84429 | |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich | S2889 | |
| C18 reverse-phase cartridge | Waters | WAT020515 | |
| 0.22-μm sterile filter | Milllipore | SLGV033RS | |
| Radio-TLC scanner | Bioscan | AR2000 | |
| ITLC paper | Agilent | SGI001 | |
| Citric acid | Sigma-aldrich | 251275 | |
| HPLC | Waters | - | Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi) |
| Acetonitrile | J.T. Baker | 14-650-359 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031 | |
| Dulbecco's modified Eagle media | Thermo fisher scientific | 11965092 | |
| fetal bovine serum | Thermo fisher scientific | 16000044 | |
| T175 flasks | Corning | CLS431080 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200072 | |
| penicillin-streptomycin | Thermo fisher scientific | 15240112 | |
| γ-counter | Perkin Elmer | - | 1480 Wizard 3 |
| Insunlin syringe | Becton Dickinson | 326105 | |
| Synringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| micro-PET/CT | Siemens Inveon | - |
References
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