Summary
غالباً ما تتم دراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع تسجيل التصحيح-المشبك. مع ذلك، يمكن النتائج المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون تبعاً للبروتوكول التجريبي، والخاطئة. هنا، نحن نقدم طرق لمنع وتصحيح مثل هذه الأخطاء مع أساس نظري.
Abstract
تدفق السائل هو حافز بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية إلى قوة تدفق السائل/الإمالة ليست مفهومة تماما، قد تساهم السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة خطيرة. ولذلك، درست حساسية قوة تدفق السائل/القص قنوات أيون استخدام تقنية المشبك التصحيح. ومع ذلك، اعتماداً على البروتوكول التجريبي، والنتائج وتفسير البيانات يمكن الخاطئة. وهنا نقدم الأدلة التجريبية والنظرية للأخطاء المتعلقة بتدفق السوائل، وتوفير أساليب لتقدير ومنع وتصحيح هذه الأخطاء. التغييرات في مفرق المحتملة بين القطب مرجع Ag/AgCl وسوائل الاستحمام قيست مع ماصة مفتوحة مليئة 3 م بوكل. يمكن تدفق السائل ثم تحول mV تقاطع السائل/المعادن المحتملة إلى حوالي 7. على العكس من ذلك، عن طريق قياس الجهد التحول الناجم عن تدفق السوائل، قمنا بتقدير تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيريد. في حالة ثابتة، يمكن أن تصل إلى تركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي أو أيون قناة المدخل على سطح غشاء الخلية منخفضة حوالي 30% من أن في حالة تدفق. وضع [اغروس] 3 م بوكل جسر بين مسرى السائل ومرجع الاستحمام قد حالت هذه المشكلة من مفرق التحول المحتملة. ومع ذلك، يمكن أن لا ثابتة تأثير الطبقة أونستيريد متجاورة على سطح غشاء الخلية بهذه الطريقة. هنا، نحن نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة، مؤكدا على أهمية استخدام ملح على [اغروس]-جسر أثناء دراسة تنظيم السوائل الناجم عن تدفق التيارات أيون. ولذلك، هذا النهج المبتكر، الذي يأخذ في الاعتبار الحقيقي تركيزات الأيونات في طبقة الحدود أونستيريد، قد توفر نظرة مفيدة على التصميم التجريبي وتفسير البيانات المتصلة بتنظيم السوائل القص إجهاد قنوات أيون .
Introduction
تدفق السائل هو جديلة بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والباثولوجيه مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية والقص السائل تعتمد على قوة الأوعية الدموية يعيد البناء والتنمية1،2، 3،،من45. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل ليست مفهومة تماما، هو يعتقد أن السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة قد تسهم حاسمة في الاستجابات الناجمة عن تدفق السوائل5 , 6 , 7 , 8. على سبيل المثال، تنشيط مقوم إلى الداخل بطانية Kir2.1 و Ca2 +-تنشيط ك+ (2.3 كالمرجع المصدق، KCNN3) القنوات بعد قد اقترح Ca2 + تدفق بتدفق السوائل للمساهمة في السوائل توسع الأوعية الناجمة عن تدفق6،،من78. لذلك، العديد من القنوات الأيونية، قنوات خاصة تنشيط ميكانيكيا أو-تحول دون، وقد درست من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع التصحيح-المشبك تقنية6،،من910 , 11-ومع ذلك، تبعاً للبروتوكول التجريبية التي يتم إجراؤها أثناء تسجيل التصحيح المشبك، النتائج وتفسير البيانات المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون يمكن أن تكون الخاطئة10،11.
مصدر واحد من التحف التي يسببها تدفق السائل في تسجيل التصحيح-المشبك من مفترق الطرق المحتملة بين السوائل حمام و القطب مرجع Ag/AgCl11. ويعتقد عموما أن تقاطع السائل/المعادن المحتملة بين سائل الاستحمام والقطب Ag/AgCl ثابت كما أن تركيز Cl– من سائل الاستحمام تظل ثابتة، النظر في الاستجابة الكيميائية بين الحل الاستحمام وقطب Ag/AgCl لتكون:
Ag + Cl–↔ AgCl + إلكترون (e–) (المعادلة 1)
ومع ذلك، في حالة حيث رد فعل الكهروكيميائية عموما بين حل الاستحمام والقطب مرجع Ag/AgCl (المعادلة 1) ينطلق من اليسار إلى اليمين، تركيز Cl– من سائل الاستحمام المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي (طبقة الحدود أونستيريد12،13،،من1415) قد تكون أقل بكثير من ذلك في الجزء الأكبر من الاستحمام الحل، ما لم تضمن ما يكفي النقل كونفيكشونال. استخدام قطب Ag/AgCl القديمة أو غير المثالية مع عدم كفاية كلورة Ag قد يزيد هذا خطر. ويمكن استبعاد هذه الأداة المتعلقة بتدفق السوائل في مسرى الإشارة، في الواقع، بمجرد وضع جسر [اغروس]-الملح تقليدية بين سائل الاستحمام ومرجع القطب، قطعة أثرية مبنية على التعديلات في Cl الحقيقي– تركيز المتاخمة ل القطب Ag/AgCl11. البروتوكول الواردة في هذه الدراسة، توضح هذه المقالة كيفية منع التغييرات المحتملة المتصلة بتدفق مفرق وقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيريد.
بعد وضع [اغروس] بوكل جسر بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl، هناك عامل حاسم آخر ينبغي النظر فيه: قطب Ag/AgCl فقط كالمرجع أعمال مثل قطب Cl– ، قنوات أيون أيضا يمكن أن تعمل مثل قطب الأيوني انتقائي. تنشأ حالة طبقة الحدود أونستيريد بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl أثناء حركة الأيونات بين الحلول خارج الخلية وداخل الخلية عن طريق قنوات أيون الغشاء. وهذا يعني أنه ينبغي توخي الحذر عند تفسير اللائحة لايون القنوات بتدفق السائل. كما نوقش في أعمالنا السابقة دراسة11، حركة الأيونات من خلال حل موجود تدرج الكهروكيميائية التي يمكن أن تحدث عن طريق ثلاث آليات متميزة: نشر، والهجرة، والحمل الحراري، حيث يتم نشر الحركة الناجمة عن الانحدار تركيز، الهجرة هي حركة يقودها التدرج الكهربائية، والحمل الحراري هو الحركة من خلال تدفق السائل. بين هذه الآليات النقل الثلاثة، يساهم الوضع الحراري معظمها إلى حركة أيونات11 (000 1 > مرة أكبر من نشرها أو الهجرة ضمن إعدادات التصحيح-المشبك المعتاد). وهذا يشكل الأساس النظري للسبب في مفرق المحتملة بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl يمكن جداً تحت ظروف ثابتة وتدفق السوائل المختلفة11.
حسب الفرضية المقترحة أعلاه، يمكن الاستدلال بعض الآثار مسهل لتدفق السوائل على قناة أيون الحالية من إعادة الحمل الحراري بتركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لمدخل القناة على سطح غشاء (طبقة الحدود أونستيريد) 10. في هذه الحالة، الآثار الناجمة عن تدفق السائل على أيون قناة التيارات نشأت من أحداث الكهروكيميائية، ليس من تنظيم أيون قناة النابضة ببساطة. واقترح باري والزملاء12،13،،من1415 استناداً إلى اعتبارات نظرية صارمة والأدلة التجريبية، والمعروف أيضا طبقة أونستيريد سابقا فكرة مماثلة أو تأثير عدد النقل. إذا كان بعض القنوات أيون كافية قد تنشأ الموصلية قناة واحدة وطويلة بما يكفي فتح الوقت لتوفير معدلات النقل كافية من خلال القنوات (أسرع معدل نقل في الغشاء من سطح غشاء أونستيريد،) تأثير طبقة الحدود . وهكذا، يمكن أن يسهم النقل الحراري-تعتمد على التسهيلات التي يسببها تدفق السائل في نهاية المطاف لايون الحالية10،،من1213،،من1415.
في هذه الدراسة، ونشدد على أهمية استخدام أجار أو [اغروس] الملح-جسر أثناء دراسة تنظيم التيارات أيون الناجم عن تدفق السائل. كما نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في أونستيريد الطبقة الحدودية المتاخمة لقنوات أيون Ag/AgCl القطب والغشاء مرجع. وعلاوة على ذلك، تفسير نظري للتحوير السوائل الناجم عن تدفق التيارات قناة أيون (أي فرضية الحراري أو تأثير طبقة أونستيريد النقل رقم) يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تصميم وتفسير الدراسات في القص القوة-تنظيم قنوات أيون. وفقا لتأثير طبقة الحدود أونستيريد رقم النقل، ونتوقع أن أيون قناة التيارات من خلال جميع أنواع غشاء أيون قنوات يمكن أن تيسره تدفق السوائل، مستقلة عن الحساسية البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل، ولكن فقط إذا قنوات أيون لها كافية قناة واحدة الموصلية وفتح-منذ وقت طويل. قد تزيد من أعلى الكثافات الحالية قناة أيون تأثير طبقة الحدود أونستيريد على سطح غشاء الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة كونكوك المؤسسية.
1-[اغروس] الملح الجسور بين حل حمام وقطب مرجعي Ag/AgCl
ملاحظة: [اغروس] 3 م بوكل تنتج الملح الجسور كما سبق وصف12 مع وجود اختلافات طفيفة.
- تشكيل الجسور
- ثني الأنابيب الشعرية الزجاج النار شكل U-شكل حسب الاقتضاء. القطر الداخلي الشعيرات الدموية ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لخفض المقاومة سلسلة عند تسجيل التيارات أيون الكبيرة. أنابيب بقطر داخلي من 2-5 مم عادة مقبولة.
- إعداد حل بوكل م 3 [اغروس]
- تحضير 100 مل من محلول بوكل م 3 (أيضا مقبول م 1 أو 2 م).
- وزن 3 غرام من [اغروس].
- يحل [اغروس] في 100 مل بوكل (أي، [اغروس] 3%) على لوحة الساخن بين 90 و 100 درجة مئوية.
- تحميل الجسور مع 3 م بوكل [اغروس]
- لتحميل سهلة، تزج الجسور الزجاج على شكل U في حل بوكل [اغروس].
ملاحظة: من السهل حفر الجسور الزجاج إذا كان الحل [اغروس]-بوكل يرد في حاوية ضحلة وواسعة النطاق. - الاحتفاظ بها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT) على [اغروس] لتعيين وتتصلب.
- بعناية إلى حفر الجسور الزجاج [اغروس]-بوكل-تحميل من مجموعة/تصلب [اغروس]-الملح.
- لتحميل سهلة، تزج الجسور الزجاج على شكل U في حل بوكل [اغروس].
- تخزين الجسور
- إعداد ما يكفي من وحدة التخزين (أي 500 مل) الحل بوكل م 3 في زجاجة على مستوى العنق.
- تخزين استعداد الجسور [اغروس]-الملح في الزجاجة في ثلاجة.
2-تطبيق قوة القص تدفق السائل إلى خلايا في غرفة لقط التصحيح
ملاحظة: يظهر من الرسم تخطيطي للتصحيح-المشبك طريقة إعداد تجريبية في الشكل 1.
- مكان حاوية محملة بالاستحمام الحل (ينبغي قياس حجم وارتفاع الفعل) أعلاه قاعة التصحيح-المشبك.
- تعبئة قاعة التصحيح-المشبك بالحل الاستحمام بالمص الأنبوب.
- لوقف تدفق السوائل، مقطع الأنبوب في الجانب الحاوية عرقلة تدفق السائل، ثم مقطع الأنبوب إلى جانب شفط لوقف الشفط في نفس الوقت. وهذا الشرط تحكم "ثابتة".
- لتطبيق قوة القص تدفق السوائل، فتح أنابيب كلا الجانبين الحاوية والشفط في نفس الوقت.
- قبل أو بعد تطبيق قوة القص تدفق السائل إلى الخلية، قياس معدل التدفق في مل/دقيقة.
- حساب معدل التدفق بقياس الانخفاض في حجم السوائل على مدى فترة زمنية معينة.
- من معدل التدفق المقاسة والهندسة (هيكل) غرفة الاستحمام، ينبغي تقدير قوة القص المطبق على الخلية بتدفق السوائل (انظر القسم المناقشة).
- وبدلاً من ذلك، التحكم في معدل تدفق (بالنسبة للخطوات 2، 3-2.6)، استخدام مضخة التروية. في هذه الحالة، ينبغي الحرص على ضمان ثابت بدلاً من تدفق نابض.
3-قياس التغيرات في إمكانات مفرق المعدن السائل بتدفق السوائل بين حل حمام وقطب مرجعي Ag/AgCl (الشكل 3A)
- استخدام Ag/AgCl قطب كهربائي أو بيليه، الذي يتوفر من المنتجات الجاهزة، دون الجسر الملح [اغروس].
- إعداد الملحية ملح فيزيولوجية طبيعية لقاعة الاستحمام (مثلاً، 143 مم كلوريد الصوديوم، 5.4 مم بوكل، 0.33 ملم نة2ص. ب4، 5 ملم حبيس، 0.5 مم مجكل2و 1.8 مم كاكل2، 11 مم د-الجلوكوز؛ الرقم الهيدروجيني تعديلها إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
- ضع ماصة تصحيح تتضمن حلاً بوكل م 3 في قاعة للتقليل من مفرق التحول المحتملة بين ماصة وحلول الاستحمام.
- إصلاح مكبر للصوت المشبك الجهد لوضع المشبك الحالي ("أنا = 0" أو "نسخة").
- بعد إبطال إمكانية إزاحة الأولية، لقياس التغيرات في الجهد الناجم عن معدلات تدفق مختلف.
- للتحقق من أن التغييرات في الجهد إمكانيات تقاطع السائل/المعادن، إعادة النظر في تأثير تدفق السائل على مفرق إمكانات استخدام الجسر [اغروس]-الملح بين حل حمام والقطب Ag/AgCl.
4-التجريبية تقدير تركيز حقيقي Cl– في طبقة أونستيريد المتاخمة للقطب Ag/AgCl تحت ظروف ثابتة (الشكل 3B)
- من نتائج الخطوة 3، رسم العلاقات معدل تدفق إمكانات مفرق وتقدير القيمة الأعلى (تشبع) من تقاطع التحول المحتملة في معدل تدفق الموائع والحاشية.
- إعداد الحلول بتركيزات مختلفة من Cl (أي، 50 و 99، 147، 195، و 288 مم من كلوريد الصوديوم).
- عن طريق تغيير Cl– تركيز في سائل الاستحمام، رسم العلاقة مفرق المحتملة-[Cl–]. ملاحظة أن معدل السوائل يجب أن تكون ثابتة وعالية بما فيه الكفاية (> 30 مل/دقيقة) لمنع انخفاض تركيز Cl– لأن القطب مرجع Ag/AgCl المجاورة.
- من منحنيات العلاقة اثنين، تقدير التغيرات في تركيز Cl– من مفرق قياس التحول المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وسجلت الخلية كلها تعتمد على الجهد Ca L من نوع2 + قناة (فدككل) التيارات في myocytes الشرياني المساريقي العلوي الفئران انزيماتيكالي مشتتة، كما هو موضح سابقا11. وقد دياليزيد myocytes الشرياني مع حل ماصة Cs غنية تحت التكوين مثقوبة النيستاتين مع الحل divalent الاستحمام خالية من الأيونات الموجبة لتيسير تدفق الحالية من خلال11،فدككل16. موجز ديبولاريزينج الجهد سلالم أو خطوات الجهد، في احتمال عقد من-70 mV، طبقت على انتزاع التيارات فدككل . ممثل الحالي الفولت (أنا-V) العلاقة في فدككل في غياب ووجود تدفق السوائل (5 مل/دقيقة أو نحو 0.004 m/s)، سجلت [اغروس] جسر بوكل، يرد في الشكل 2 ألف. تدفق السائل زيادة طفيفة في فدككل الحالية بطريقة مستقلة عن التيار الكهربائي. ويرد هذا أثر تيسير تدفق السائل على فدككل الحالي في الشكل 2.
تيسير مستقلة عن الجهد فدككL الحالية بتدفق السائل رد مناسبل لفدكك إلى قوة السائل أو القص. وقدرت 5 مل/دقيقة أو نحو 0.004 m/s لتدفق السوائل في الإعداد التجريبية الحالية لتمثيل حوالي 0.1 داين/سم2 من حيث قوة القص (انظر المناقشة). ومع ذلك، عند الرجوع Ag/AgCl القطب ارتباطاً مباشرا بسائل الاستحمام دون [اغروس] جسر بوكل، العلاقة-V أناحضور تدفق السائل تحول إلى اليمين مقارنة بالتيارات فدككل إطار ثابت الشرط (الشكل 2 و 2D). وادي ذلك إلى تثبيط فدككL الحالية في الفولتية السالبة وتيسير فدككL الحالية في إمكانات depolarized أو إيجابية أكثر. وهذا يجسد هذا الأثر الناجم عن تدفق السائل في تسجيل التصحيح-المشبك الذي تحول جهد من العلاقة-V أنالم يكن بسبب تعديل قناة النابضة، لكن كان في الواقع بسبب تحول تقاطع محتملة بين سائل الاستحمام و Ag/AgCl مرجع القطب11. ويرد دليل مباشر للتحول المحتملة مفرق الناجمة عن تدفق السائل في الشكل 3.
وقيست مفترق التحولات المحتملة وفقا للخطوة 3. تم قياس التغييرات، بسبب تدفق السوائل، استخدام ماصة مفتوحة مليئة 3 م بوكل، كما هو موضح سابقا11. مع ماصة مفتوحة مليئة 3 م بوكل، يمكن التقليل من مفترق الطرق المحتملة بين ماصة والاستحمام الحلول، والتغييرات المحتملة بسبب تدفق السوائل أساسا من حل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl. دون [اغروس] 3 م بوكل جسر بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl، تحول تدفق السائل تقاطع المحتملة بين السوائل ومسرى Ag/AgCl بطريقة تعتمد على معدل تدفق السائل (الشكل 3A). كان استقراء التغيير تقاطع الحد الأقصى المحتمل أن تكون ~ 7 mV من العلاقة تدفق الموائع واحتمال تقاطع (الشكل 3 ألف، أسفل). وفي المقابل، عندما [اغروس] 3 م بوكل استخدمت الجسر، تدفق السائل لم يغير مفترق الطرق المحتملة بين مسرى السائل ومرجع الاستحمام (موجز في أسفل الرسم البياني في الشكل 3 ألف، أسفل).
من أجل قياس تركيز الاختلافات بين ظروف تدفق ثابت والسوائل، في الذي يكفي الحراري أوضاع العمل الوظيفية، قمنا بدراسة تأثير تغيير التركيزات Cl– على مسرى السائل-Ag/AgCl الاستحمام تقاطع المحتملة وفقا للخطوة 4. زيادة تركيز Cl– تحول تقاطع المحتملة بطريقة تعتمد على تركيز (الشكل 3B، أعلى) تماما كما تحول تدفق السائل تقاطع المحتملة بطريقة تعتمد على معدل. باستخدام جسر [اغروس] بوكل، حالت دون إمكانية تقاطع من تغيير في Cl– تعتمد على تركيز الطريقة (الشكل 3)، مما يشير إلى حدوث التغير المحتمل في تقاطع بين مسرى حمام الحل والمرجعية، ليس بين الحلول حمام وماصة. ويرد المؤامرة شبه تسجيل مفرق إمكانات-[Cl–] العلاقة في اللوحة السفلي من الشكل 3B. ووفقا للنتائج في الشكل 3B، القيمة القصوى المستنتجة من ~ 7 أم في مفرق التحول المحتملة (من الشكل 3 ألف) يوحي بأن ينخفض تركيز Cl– المتاخمة للقطب مرجع Ag/AgCl ~ 70 في المائة من متوسط تركيز جل الاستحمام السائل عندما تدفق السائل غائبا (الشكل 3B، أسفل).
في دراستنا السابقة، سجلت التيارات Kir2.1 يتيسر بتدفق السوائل عن طريق استعادة كونفيكتيفيلي (زيادة) في مدخل القناة10[ك+]. هذه الفكرة ينبع من الظواهر التي تحدث بين سائل الاستحمام والقطب Ag/AgCl، كما يمكن أن تعمل قناة Kir2.1 كقطب ك+ فقط كمهام القطب Ag/AgCl كقطب Cl– . وتتجلى هذه الفكرة العريضة في الشكل 4A و 4B. ويبين الشكل 4مثال ممثل لتيسير السوائل الناجم عن تدفق التيارات Kir2.1. وقد أثارت التيارات Kir2.1 بخطوة جهد هايبربولاريزينج من احتمال عقد من 0-100 أم في الفئران خلايا اللوكيميا باسوفيليك (ربل). تطبيق تدفق السوائل (5 مل/دقيقة أو 0.004 m/s) زيادة سهولة الحالي Kir2.1 (الشكل 4). واقترح هذا التيسير بتدفق السائل سابقا أن وساطة لا بالإشارات الخلوية بل بتأثير الكهروكيميائية للنقل الحراري من أيونات K+ إلى طبقة الحدود أونستيريد10.
رقم 1: التخطيطي تبين إعداد قاعة الاستحمام لتنظيم تدفق السائل من القنوات الأيونية في تسجيل التصحيح-المشبك- الفريق أقل من رأي الجانب (القسم السهمي) دائرة التصحيح-المشبك. وهو يلخص مسار تدفق السوائل ومواقع خلية درس وكهربائي، ومدخل/مخرج من السوائل. لأنه يتم ضخه السائل باستمرار من خلال أنبوب منفذ بالشفط، هو الإبقاء على ارتفاع السائل في الدائرة عند مستوى ثابت نسبيا. لقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: تدفق آثار السائل في لتر من نوع المعتمدة على الجهد Ca2 + قناة (فدككل) التيارات مع أو بدون [اغروس] م 3 جسر بوكل. التيارات فدككL سجلت في myocytes الشرياني المساريقي العلوي الفئران انزيماتيكالي متفرقة مع تسجيل التصحيح-المشبك مثقبة النيستاتين. الحل الملح الفسيولوجية تيرودي العادي مع 4.2 مم يدتا دون divalent الكاتيونات كحل الاستحمام11. الحل ماصة الواردة CsCl، 140 ملم؛ مجكل2، 1 مم؛ حبيس، 5 مم؛ عطا 0.05 مم؛ ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2 مع CsOH. (أ وب) مع [اغروس] 3 م بوكل-جسر. (أ) ممثل أنا-V علاقة الحالية فدككل وآثار تدفق السائل. (ب) ملخص لآثار السوائل على العلاقة-V أناالتيارات فدككل . (C و D) دون [اغروس] 3 م بوكل الجسر. (ج) أنا-V علاقات التيارات فدككل . (د) تلخيص أنا-V علاقات التيارات فدككL الذروة في غياب ووجود تدفق السائل. تظهر الأشكال الجهد اتخاذ خطوات لالتماس التيارات فدككل في اقحم الشكل. لقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: آثار تدفق السائل على مفرق المعدن السائل المحتملة بين سائل الاستحمام و Ag/AgCl مرجع القطب وتقدير تركيز Cl– الحقيقية في طبقة أونستيرريد المتاخمة للقطب مرجعية من تقاطع يقاس المحتملة. (أ) تتبع ممثل بتقاطع التغييرات المحتملة بسبب مختلف معدلات تدفق السوائل (اللوحة العلوية). لقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق11. العلاقة معدل تدفق الموائع واحتمال تقاطع (n = 5). (ب) تسجيل الفريق العلوي: الممثل من مفرق التغييرات المحتملة نتيجة لتركيزات مختلفة من حلول كلوريد الصوديوم. لوحة أقل: مؤامرة شبه تسجيل من مفرق إمكانات-[Cl–] العلاقة (n = 5). خط مستقيم باللون الأحمر يمثل أفضل ملائمة من] [نرنست]-معادلة التوازن المحتمل مع منحدر عشرة إضعاف من 49 بتعديل السيارات. يرجع ذلك إلى انتقائية محدودة نا+، مقارنة Cl-، لتوليد تقاطع السائل/المعادن المحتملة، قيمة المنحدر من 49 mV، بدلاً من 58 mV، أنتجت الاحتواء الأفضل في مفرق إمكانات-[Cl–] العلاقة في غرفة درجة الحرارة. 49-mV المنحدر يشير إلى Cl– الاعتماد (أو الانتقائية) Ag/AgCl مرجع القطب > 95% على أيون أخرى (في هذه الحالة، نا+)، وفقا لمعادلة غولدمان-هودجكين-كاتز الجهد. تحولاً 7 mV بتركيز Cl– من 150 مم تشير إلى انخفاض قدرة ~ 30% في تركيز Cl– . (ج) تتبع الممثل من إمكانات مفرق في تركيزات مختلفة من حلول كلوريد الصوديوم مع استخدام جسر [اغروس] "بوكل م" 3 (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التخطيطي لآثار النموذج الحراري لتدفق السوائل في تركيزات أيون المتاخمة للقنوات المفتوحة أثناء التدفق الحالي أيون- (أ) تحت ظروف ثابتة مع النقل الحراري قليلاً من الأيونات في الحل مع الحقل الكهربائي، الجريان أيون K+ من خلال ك+-قنوات أيون انتقائية يمكن أن يسبب انخفاض في تركيزات ك+ في ميكرودومين المتاخمة مدخل القناة. (ب) يمكن استعادة تدفق السوائل كونفيكتيفيلي الانخفاض في تركيز ك+ المتاخمة لمدخل قناة مفتوحة. (ج) أثر تدفق السائل على التيارات قناة Kir2.1 مقوم إلى الداخل. زيادة تدفق السائل على الفور التيارات Kir2.1. ويبين الشكل خطوة الجهد اقحم الشكل. وسجلت التيارات Kir2.1 استخدام عالية ك+-حلول والاستحمام-ماصة. الاستحمام الحل: 148.4 ملم بوكل، 0.33 ملم نة2بو4، 5 ملم حبيس، 0.5 مم مجكل2، كاكل 1.8 مم2، 11 مم د-الجلوكوز؛ تعديل درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. "الماصة؛" الحل: 135 ملم بوكل، 5 ملم كلوريد الصوديوم، مم 5 ملغ-ATP، 10 مم حبيس، 5 مم اثيلينيجليكول-مكررا (2-أمينو إيثايل)-ن، ن، ن '، ن'،-حمض tetraacetic (عطا)، الرقم الهيدروجيني 7.2 (المعدل مع كوه). منذ خلايا ربل-2 ح 3 عرضه التورم هيبو ناضح وما يترتب عليه من المشغل لتنشيط وحدة التخزين Cl– التيارات، السكروز 38 مم وأضيفت إلى الحل الاستحمام لضبط الاسموليه ومنع تورم الخلية. وعلاوة على ذلك، أضيفت إلى الحل ماصة للقضاء على أي تلوث بالتيارات Cl– عائقا قناة Cl– [4، 4 '--دييسوثيوسيانو--2، حمض 2-ستيلبينيديسولفونيك (الافتراضية، 30 ميكرومتر)]. وقد تم تعديل الفريق ج من منشور سابق10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفي هذه الدراسة، أثبتنا طريقة لقياس تركيز Cl– الحقيقية في طبقة أونستيريد المتاخمة للقطب مرجع Ag/AgCl بتحديد تقاطع السائل المعدنية المحتملة مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة مليئة بوكل عالية التركيز. يمكن أن يؤدي التغيير في تركيز Cl– في طبقة الحدود تحولاً إمكانات تقاطع عند التبديل من ثابت إلى ظروف التدفق السائل. ببساطة باستخدام [اغروس] بوكل جسر بين القطب مرجعية وسوائل الاستحمام يمكن منع الأخطاء المتعلقة بتركيز Cl– أو القطع الأثرية أثناء تسجيل التصحيح-المشبك.
بالإضافة إلى التأكيد على أهمية جسر الملح أجار أو [اغروس]، تطبيق آخر لهذا الأسلوب في تقدير تركيز أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيريد كما يلي. لأن قنوات أيون بلاسماليمال يمكن أن تعمل كأقطاب الأيوني الانتقائي (مثلما في Ag/AgCl القطب مهام مثل قطب Cl– )، تركيز أيون الحقيقية في حدود أونستيريد الطبقة المتاخمة لمدخل القناة في غشاء الخلية يمكن أن يكون السطح المختلفة من متوسط التركيزات من السوائل السائبة. هذا الاختلاف في تركيز أيون بين معظم طبقة السائل وأونستيرريد المتاخمة لغشاء الخلية هو السيناريو الحقيقي تحت إعدادات السريرية، وينبغي تمييزها عن تحوير البيولوجي قناة النابضة بقوة تدفق السائل/القص. ولسوء الحظ، خلافا لتأثير طبقة أونستيريد بين القطب مرجع Ag/AgCl وسوائل الاستحمام، لا نستطيع إصلاح تأثير الطبقة أونستيريد متجاورة على سطح غشاء الخلية عند دراسة تنظيم قنوات أيون بقوة تدفق السائل/القص.
ومع ذلك، نظراً لملاحظة أن تركيز أيون الحقيقية في طبقة أونستيريد هو حوالي 70% من أن في السوائل السائبة (الشكل 3)، يمكننا أن نجعل بعض التعديلات في البيانات التجريبية للتمييز البيولوجي تحوير قنوات أيون من "ظاهرة الكهروكيميائية لتأثير طبقة أونستيريد". ويتوقع أن حوالي 70 في المائة من متوسط تركيز جل الاستحمام الحل في دراسة الأخيرة10تركيز أيون الحقيقية في طبقة أونستيريد على سطح غشاء الخلية. منذ استعادة تدفق السائل تركيز أيون انخفض، يسر Kir2.1 الحالية مستقلة عن الخلوي يشير إلى10. في دراستنا السابقة، الكثافة الحالية كان مرتفعا إلى حد كبير (2.5 A/م2) مع K خارج الخلية عالية+ خلايا التركيز والتعبير عالية من Kir2.1 في ربل10. ومع ذلك، في حالة أغشية الخلية حقيقية مع مختلف أيون قناة ستريك الكثافة الحالية، تأثير الطبقة أونستيريد على سطح غشاء الخلية قد تعتمد إلى حد كبير على السعة لايون قناة الكثافة الحالية. وعلاوة على ذلك، قد يتسبب هذا في بعض أيون التيارات قناة (لا سيما تلك ذات الكثافة الحالية أقل نسبيا) تكون متحسسة لتنظيم تدفق السائل؛ وعلى الرغم من تأثير الطبقة أونستيرريد ينظم اليكتروتشيميكالي ولا بيولوجيا. وهكذا، قد يؤثر هذا الأسلوب الموصوفة هنا. ولذلك، إمكانية تطوير أسلوب كمية تكون كافية لتصحيح النتائج التجريبية ينبغي أن يكون التحقيق في المستقبل دراسات.
في الشكل 3، لاحظنا أن إمكانات المعدن السائل تقاطع بين القطب مرجع Ag/AgCl وسوائل الاستحمام كانت تعتمد بشكل كبير على حالة مسرى Ag/AgCl. في الواقع، عندما مسرى Ag/AgCl كانت مثالية في حالة، كانت التغييرات في مفرق المحتملة بسبب تدفق السائل الحد الأدنى (البيانات لا تظهر). ومع ذلك، تسبب كلورة الفقيرة القطب Ag/AgCl زيادة تحول في مفترق الطرق المحتملة. استخدام أجار أو [اغروس] جسر بوكل ما مسرى مرجع Ag/AgCl عرضه للمؤثرات الخارجية المختلفة، مثل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة وعنصر مؤكسد الإجهاد، يوصي دائماً. على الرغم من أن التغييرات في مفرق المحتملة من السوائل تتدفق بين الاستحمام السائل ومسرى المرجع مصدرا محتملاً للخطأ، وقدرنا تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيريد بنجاح عن طريق قياس التحول في مفرق الإمكانات تحت مختلف معدلات تدفق السوائل (الشكل 3 ألف و 3 باء).
النقطة الحرجة في الخطوة 4 لإعداد المنحنى المعياري لتقدير تركيز Cl– الحقيقية في طبقات الحدود أونستيرريد من التحول من إمكانات مفرق أنه ينبغي تسجيل المنحنى القياسي تحت معدل تدفق كافية (30 مل/ دقيقة في هذه التجربة). على الرغم من أن معدل تدفق هذا سريع جداً، في الحالات العملية أسرع السائل، أصغر انخفاض تركيز على طبقات الحدود (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون مليئة ماصة مفتوحة بوكل عالية، بدلاً من حل ماصة عادية، من أجل دراسة المشبك تصحيح لمنع التغيير في مفرق المحتملة بين ماصة والاستحمام الحل.
ويمكن تقدير قوة القص في وضع التصحيح-المشبك من العلاقة التالية11:
Τ = (6μQ)/(2منالبوسنة والهرسك) (المعادلة 2)
المكان: τ هو إجهاد القص (N/سم2)؛ Μ هو اللزوجة (0.001 N m/s2 للماء عند 20 درجة مئوية)؛ Q هو معدل تدفق السائل (م3/ق)؛ ب هو عرض الغرفة (م)؛ و h هو ارتفاع الدائرة (م). عندما يكون معدل تدفق السائل 30 مل/دقيقة، يقدر أن ~0.75 داين/سم2 طبقاً للمعادلة أعلاه قوة القص في قاعة التصحيح هو مبين في الشكل 1 . هذا مستوى قوة قص منخفضة مقارنة بقوة القص الفسيولوجية؛ يمكن أن تخضع الخلايا البطانية في الأوعية الدموية للقص القوات يصل إلى 40 داين/سم،من18إلى19. ولذلك، شريطة أن قنوات أيون ليست حساسة للقص قوات أقل من 0.75 داين/سم2، علينا دراسة حساسية قوة تدفق السائل/القص قنوات أيون بعد استبعاد تأثير طبقة الحدود أونستيريد بتعيين حالة عنصر التحكم إلى 0.75 داين/سم2. ومع ذلك، يبدو بعض القنوات أيون، بما في ذلك Kir2.1، حساسة لإمالة قوات أقل من 0.75 داين/سم2،3،،من45،6.
وأشار باري والزملاء12،13،،من1415أصلاً تأثير الطبقة أونستيريد. هنا، نحن نقدم طريقة لتقدير تركيز أيون الحقيقية في طبقة أونستيرريد بقياس التغيرات في إمكانات تقاطع مع ماصة المشبك التصحيح مفتوحاً. ونقترح أيضا أن هذا التأثير أونستيريد الطبقة الحدودية قد تساهم في تنظيم السوائل الناجم عن تدفق التيارات قناة أيون، وينبغي النظر في أثناء الدراسة ميتشانوسينسيتيفيتي تدفق السائل من قنوات أيون. ومع ذلك، استناداً إلى هذه الفرضية، فإنه قد يطلب لماذا بعض التيارات قناة أيون ليست حساسة للتنظيم تعتمد على تدفق السوائل إذا كان تأثير الطبقة الحدودية أونستيريد هو الكهروكيميائية بدلاً من المكافحة البيولوجية. كما تناول بإيجاز أعلاه، ربما هذا سبب فقط أيون التيارات من خلال القنوات مع كبير يكفي الموصلية قناة واحدة وطويلة وقت كاف مفتوحة يمكن أن يتيسر بتدفق السائل. هو إنشاء طبقة أونستيريد فيه تركيز أيون يختلف عن المتوسط في حل الجزء الأكبر، الجريان في مرحلة غشاء ينبغي السريعة كافية مقارنة بأن في مائي المرحلة14. وقد اقترحنا مؤخرا الحالية عن طريق قنوات Kir2.1، الذين الموصلية ووقت فتح مرتفعة بما فيه الكفاية، بأن ييسر تدفق السوائل عبر آليات لإعادة تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيريد للحمل الحراري غشاء الخلية السطحية11.
وفي الختام، فإننا نقدم طريقة لقياس تركيز أيون في أونستيريد الطبقة الحدودية المتاخمة لسطح القطب وغشاء الخلية مرجع مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحاً. وإلى جانب التأكيد على أهمية [اغروس] جسر بوكل، يوفر هذا الأسلوب أيضا طريقة لحساب تأثير الطبقة أونستيريد بينما تفسير سيطرة قوة تدفق السائل/القص قنوات أيون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا البحث كان يدعمها "العلم بحوث البرامج الأساسية" (2015R1C1A1A02036887 وجبهة الخلاص الوطني-2016R1A2B4014795) من خلال "مؤسسة البحوث الوطنية كوريا" تموله وزارة العلوم، تكنولوجيا المعلومات والاتصالات "برنامج مركز بحوث رائدة" (2011-0027921)، "تخطيط المستقبل"، ومنحة من كوريا الصحة التكنولوجيا والتطوير د المشروع من خلال معهد التنمية الصناعة (خيدي) كوريا الصحة، تموله وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
