Summary
Mechanosensitive 이온 채널은 종종 패치 클램프 기록 유체 흐름/전단 힘 감도 측면에서 공부 했다. 그러나, 실험 프로토콜에 따라 이온 채널의 유체 흐름 규정에 결과 잘못 된 수 있습니다. 여기, 우리는 방지 하 고 이론적 근거와 이러한 오류에 대 한 메서드를 제공 합니다.
Abstract
유체 흐름은 유체 흐름을 이용한 혈관 확장 등 많은 생리와 병리학 과정을 제어 하는 중요 한 환경 자극. 유체 흐름/전단 힘에 생물학 응답에 대 한 분자 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 이온 채널 게이팅의 유체 흐름 중재 규정은 비판적으로 기여할 수 있습니다. 따라서, 이온 채널의 유체 흐름/전단 힘 감도 패치 클램프 기술을 사용 하 여 공부 되었습니다 했다. 그러나, 실험 프로토콜에 따라 결과 및 해석 데이터의 수 잘못 된. 우리가 유체 흐름 관련 오류에 대 한 실험 및 이론적인 증거를 제시 하는 여기, 예측, 예방, 및 이러한 오류를 수정에 대 한 메서드를 제공 하 고. Ag/AgCl 기준 전극과 입욕 액체 사이 잠재적인 연결에 변화 3 M KCl. 유체 흐름 수 가득한 오픈 피 펫으로 측정 되었다 다음 액체/금속 접합 약 7 잠재적인 뮤직 비디오를 이동 합니다. 반대로, 유체 흐름에 의해 유도 된 전압 변화를 측정 하 여 우리 unstirred 경계 층의 이온 농도 추정. 정적 상태에서 실제 이온 농도 Ag/AgCl 기준 전극 또는 이온 채널 인렛에 세포 막 표면에 인접 한 낮은 흐름 상태에서의 30%로 약으로 도달할 수 있습니다. 배치는 agarose 3 M KCl 다리 입욕 및 참조 전극 사이 접합 잠재적인 이동의이 문제를 방지 할 수 있습니다. 그러나, unstirred 레이어 효과 세포 막 표면에 인접 한이 방법으로 해결할 수 없습니다. 여기, 우리는 이온 전류의 유체 흐름 유도 규칙을 공부 하는 동안 agarose 소금 브리지를 사용 하 여의 중요성을 강조 오픈 패치 클램프 피 펫과 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하기 위한 방법을 제공 합니다. 따라서, unstirred 경계 층에 이온의 실제 농도 고려이 새로운 접근 방식을 실험 설계 및 이온 채널의 유체 전단 응력 규제 관련 데이터 해석에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다. .
Introduction
유체 흐름은 유체 흐름을 이용한 혈관 확장 및 유체 전단 힘 종속 혈관 개장 및 개발1,2,등 많은 생리와 병 적인 프로세스를 제어 하는 중요 한 환경 큐 3,,45. 유체 흐름 전단 힘에 생물학 응답에 대 한 분자 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 이온 채널 게이팅의 유체 흐름 중재 규칙 유체 흐름 유도 응답5 비판적으로 기여할 수 있다고 믿고 , 6 , 7 , 8. 내 피 안쪽 정류기 Kir2.1 및 캘리포니아2 +의 예를 들어 활성화-활성화 된 K+ (KCa2.3, KCNN3) 채널 Ca2 + 유입 유체 흐름에 의해 액체에 기여할 제안 되었습니다 후 흐름 유도 혈관6,,78. 따라서, 많은 이온 채널, 특히 기계적으로 활성화 또는-저해 채널, 패치 클램프 기술6,,910 유체 흐름/전단 힘 감도 측면에서 연구 , 그러나 11., 수에 따라 실험 프로토콜 패치 클램프 기록 동안 수행, 결과 및 유체 흐름-이온 채널의 규정에 있는 데이터의 해석 잘못10,11.
유체 흐름 유도 아티팩트 패치 클램프 기록에의 한 소스는 목욕 및 Ag/AgCl 기준 전극11사이 잠재적인 교차점에서 이다. 그것은 일반적으로 믿고 그 입욕 액체와 Ag/AgCl 전극 사이 잠재적인 액체/금속 접합 일정 입욕 액체의 Cl- 농도 일정 유지는 입욕 솔루션 사이의 화학 반응 고려 그리고 되도록 Ag/AgCl 전극:
Ag + Cl-↔ AgCl + 전자 (e-) (공식 1)
그러나, 입욕 솔루션 및 Ag/AgCl 기준 전극 (공식 1) 사이 전반적인 전기 화학 반응 왼쪽에서 오른쪽으로 진행 하는 경우, Ag/AgCl에 인접 한 입욕 액체의 Cl- 농도 참조 충분 한 convectional 전송 보장 하지 않는 한 전극 (unstirred 경계 층12,13,,1415) 솔루션, 목욕의 대부분에서 그 보다 훨씬 낮은 수 있습니다. 이전 또는 비 이상적 Ag/AgCl 전극 Ag의 부적당 한 염소와 함께 사용 하 여 이러한 위험을 증가할 수 있습니다. 이 유체 흐름 관련 아티팩트 참조 전극, 사실,에서 단순히 입욕 액체 및 참조 사이 기존의 agarose 소금 다리를 배치 하 여 제외할 수 있습니다 전극, 유물 진짜 Cl- 에서 변경에 기반 Ag/AgCl 전극11에 인접 한 농도. 이 연구에서 제시 하는 프로토콜 흐름 관련 접합 잠재적인 변화를 방지 하 고 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하는 방법을 설명 합니다.
Agarose KCl 입욕 액체 및 Ag/AgCl 기준 전극 사이 다리를 놓은 후 고려해 야 하는 또 다른 중요 한 요소 이다: 참조로 그냥 Ag/AgCl 전극 역할 Cl- 전극, 이온 채널 또한 기능을 할 수 같은 이온 선택적인 전극. 입욕 액체와 Ag/AgCl 기준 전극 사이 unstirred 경계 층의 상황 막 이온 채널을 통해 세포 외 및 세포내 솔루션 사이 이온의 운동을 하는 동안 발생합니다. 이 유체 흐름에 의해 채널 이온의 규정을 해석 하는 때 주의 사용 해야 함을 의미 합니다. 우리의 이전 연구11에서 설명 했 듯이, 전기 화학 기온 변화도 존재 하는 솔루션을 통해 이온의 운동 3 가지 메커니즘을 통해 발생할 수 있습니다: 확산, 마이그레이션, 및 대류, 어디 확산 운동 이다 농도 기온 변화도 의해 유도 된 마이그레이션 전기 기온 변화도 의해 구동 하는 운동 이며 대류 유체 흐름을 통해 운동 이다. 이러한 세 가지 전송 메커니즘 가운데 대류 모드 대부분 이온11 (> 1000 번 유포 또는 일반적인 패치 클램프 설정 마이그레이션 보다)의 운동에 공헌 한다. 이 왜 입욕 액체와 Ag/AgCl 기준 전극 사이 잠재적인 연결 수 매우 다른 정적 및 유체 흐름 조건11의 이론적인 기초를 형성 합니다.
위에서 제안 된 가설에 의하여 현재 이온 채널에 유체 흐름의 어떤 facilitatory 효과 진짜 이온 농도 막 표면 (unstirred 경계 층)에 채널 입구에 인접 한의 대류 복원에서 유추 될 수 10.이 경우에, 이온 채널 전류에 대 한 유체 흐름 유도 효과 단순히 발현 이온 채널 게이팅의 규제 안에서 전기 이벤트에서. 비슷한 생각 이전 배리와 동료12,13,,1415 엄격한 이론적인 고려 사항 및 실험적 증거, 일컬어 unstirred 층에 따라 의해 제안 되었다 또는 전송 번호 효과입니다. 단일 채널 전도도 충분 한 전송 채널 (unstirred 멤브레인 표면에 보다 막에서 빠른 전송 속도), 속도 경계층 효과 제공 하기 위해 충분히 오픈 시간 발생할 수 있습니다 일부 이온 채널 충분 한 경우 . 따라서, 대류 종속 전송 최종 유체 흐름 유도 자와 이온 현재10,12,13,,1415에 기여할 수 있다.
우리는 한 천 또는 agarose를 사용 하 여의 중요성을 강조 하는이 연구에서 이온의 유체 흐름 유도 규칙을 공부 하는 동안 소금 브리지. 우리는 또한 Ag/AgCl 기준 전극 및 막 이온 채널에 인접 한 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 측정 하기 위한 방법을 제공 합니다. 또한, 이온 채널 전류 (즉, 대류 가설 또는 unstirred 층 전송 번호 효과)의 유체 흐름을 이용한 변조의 이론적 해석 설계 하 고 해석 하는 연구에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 전단 힘-규칙 이온 채널의. 우리 경우 이온 채널 전류 막 이온 채널의 모든 종류를 통해 유체 흐름, 유체 흐름 전단 힘만을 그들의 생물 학적 감도의 독립에 의해 촉진 될 수 있다 예측 unstirred 경계 층 전송 번호 효과 따라 이온 채널 충분 한 단일 채널 전도도 긴 오픈-시간이 있다. 높은 이온 채널 전류 밀도 세포 막 표면에 unstirred 경계층 효과 높일 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험은 건국대의 기관 지침에 따라 수행 했다.
1. Agarose 소금 교량 목욕 솔루션 및 Ag/AgCl 기준 전극 사이
참고: Agarose 3m KCl 염 다리 이전 생산12 사소한 변형을 설명 합니다.
- 다리의 형성
- 적절 한 U 자형을 형성 화재 유리 모 세관 튜브 벤드. 모세 혈관의 내경 큰 이온 전류를 기록할 때 직렬 저항을 줄이기 위한 충분히 큰 해야 합니다. 2-5 m m 내부 직경 튜브는 일반적으로 허용 됩니다.
- Agarose 3m KCl 솔루션의 준비
- 100 mL 3 M KCl 해결책의 준비 (1 또는 2 M 하 셔도 됩니다).
- Agarose의 3 g의 무게.
- 90와 100 ° C 사이 뜨거운 접시에 KCl (즉, 3 %agarose) 100 mL에 agarose를 녹
- 3m KCl agarose와 브리지 로드
- 쉽게 로드 agarose KCl 해결책에 U 자 모양의 유리 다리를 담가.
참고: 그것은 agarose KCl 솔루션 얕 고 넓은 컨테이너에 포함 되어 있으면 유리 다리를 찾아 쉽습니다. - 하룻밤 실 온 (RT) agarose 설정 및 강화를 위한 계속 그들.
- Agarose KCl 로드 유리 다리 세트/강화 agarose-소금에서 신중 하 게 찾아.
- 쉽게 로드 agarose KCl 해결책에 U 자 모양의 유리 다리를 담가.
- 다리를 저장
- 준비 하는 충분 한 볼륨 (즉, 500ml) 넓은 센 병에 3 M KCl 해결책의.
- 냉장고에 있는 병에 준비한 agarose 소금 다리를 저장 합니다.
2. 셀 패치 클램핑 챔버에 유체 흐름 전단 력의 응용
참고: 패치 클램프 실험 설정의 회로도 그림 1에 표시 됩니다.
- 장소 컨테이너 로드 목욕 솔루션 (볼륨 및 높이 측정 해야 합니다 이미) 패치 클램프 챔버 위에.
- 튜브를 suctioning 여 입욕 솔루션 패치 클램프 챔버를 채우십시오.
- 유체 흐름을 중지, 유체 흐름을 차단 하도록 컨테이너의 측면에서 튜브 클립 다음 중지 동시에 흡입 하는 흡입 쪽에 튜브를 클립 합니다. 이것은 "고정" 제어 상태 이다.
- 유체 흐름 전단 힘을 적용 하기 위해 동시에 컨테이너와 흡입 측에 두 튜브를 엽니다.
- 전에 또는 유체 흐름 전단 힘 셀에 적용 한 후, mL/min의 유량을 측정 합니다.
- 주어진된 시간 동안 유체 볼륨에서 감소를 측정 하 여 유량을 계산 합니다.
- 측정 된 유량과 입욕 챔버의 형상 (구조)에서 유체 흐름에 의해 셀에 적용 되는 전단 힘 (토론 섹션 참조) 추정 한다.
- 또는, (단계 2.3-2.6)에 대 한 유량 제어, 관류 펌프를 사용 합니다. 이 경우에 상수 타악기 흐름 보다는 되도록 주의 해야 합니다.
3. 목욕 솔루션 및 (그림 3A) Ag/AgCl 기준 전극 사이의 유체 흐름에 의해 액체 금속 접합 잠재력에 변화를 측정
- Ag/AgCl 전극 또는 펠 릿, agarose 소금 다리 없이 기성 품 제품에서 사용할 수 있는 사용 합니다.
- (예를 들어, 143 m m NaCl, 5.4 m m KCl, 0.33 m m NaH2포4, 5 mM HEPES, 0.5 m m MgCl2, 1.8 m m CaCl2, 11 m m D-포도 당, pH 7.4 NaOH로 조정) 입욕 약 실에 대 한 일반적인 생리 소금 염 분을 준비 합니다.
- 피 펫 및 입욕 솔루션 사이 접합 잠재적인 변화를 최소화 하기 위해 챔버에 3m KCl 솔루션을 포함 하는 패치 피 펫을 놓습니다.
- 전압 클램프 증폭기 전류 클램프 모드를 수정 ("I = 0" 또는 "참조").
- 초기 오프셋된 잠재력을 nullifying, 후 다양 한 유량에 의해 유도 된 전압 변화를 측정 합니다.
- 전압 변화 액체/금속 접합 잠재력을 확인, 다시 목욕 솔루션 및 Ag/AgCl 전극 사이 agarose 소금 다리를 사용 하 여 접합 잠재력에 유체 흐름의 효과 검사 합니다.
4. 실험 Unstirred 층 (그림 3B) 정적 조건 Ag/AgCl 전극에 인접 한에서 진짜 Cl- 농도 추정
- 3 단계의 결과에서 접합 잠재력-유량 관계 그리고 위에 유체 흐름 속도 의해 접합 잠재적인 변화의 최대한 (채도) 값을 추정.
- Cl의 다양 한 농도와 솔루션 준비 (즉, 50, 99, 147, 195, 및 NaCl의 288 m m).
- Cl- 입욕 액체의 농도 변경 하 여 접합 잠재적인-[Cl-] 관계를 그립니다. 일정 하 고 충분히 높은 유체 속도 수 한다 (> 30 mL/min) 인접 한 Ag/AgCl 기준 전극의 Cl- 농도의 감소를 방지 하기 위해.
- 두 관계 곡선에서 측정 된 접합 잠재적인 변화에서 Cl- 농도 변화 예상.
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Representative Results
전체 셀 전압 종속 L 유형 캘리포니아2 + 채널 (VDCCL) 전류는 앞에서 설명한11로 효소 분산된 쥐 mesenteric 동맥 myocytes에 기록 되었다. 동맥 myocytes divalent 양이온 무료 입욕 솔루션 VDCCL11,16을 통해 현재의 흐름을 촉진 하기 위하여 nystatin 천공 구성에서 Cs 풍부한 피 펫 솔루션 dialyzed 했다. Depolarizing 전압 램프 또는-70의 지주 잠재력에 전압 단계 간단한 mV, VDCCL 전류 유도에 적용 했다. 대표 전류-전압 (I-V) VDCCL 부재에는 agarose KCl 다리와 기록 (5 mL/min 또는 약 0.004 m/s), 유체 흐름의 존재에에서 관계 그림 2A에 표시 됩니다. 유체 흐름은 약간 전압에 독립적인 방식으로 현재 VDCCL 을 증가 했다. 현재 VDCCL 에 유체 흐름의 촉진이 효과 그림 2B요약.
VDCCL 유체 흐름에 의해 전류 전압 독립적인 촉진 액체 또는 전단 힘에 VDCCL 의 적절 한 응답 이다. 5 mL/min 또는 약 0.004 m/s 현재 실험적인 체제에서 유체 흐름의 전단 힘에서 약 0.1 dyn/cm2 를 나타내는 추정 되었다 (내용 참조). 그러나, Ag/AgCl 참조 전극은 직접 연결 agarose KCl 다리, 나-V 관계 정적 아래 VDCCL 전류에 비해 오른쪽으로 이동 하는 유체 흐름의 존재 없이 입욕 액체에 조건 (그림 2C 및 2D). 이 결과 VDCCL 부정적인 전압 전류 억제 및 VDCCL 더 depolarized 또는 긍정적인 잠재력에 현재의 촉진. 이 패치 클램프 기록 있는 나-V 관계의 전압 변화 채널 게이팅의 수정으로 인해 아니었지만 실제로 입욕 액체와 Ag/AgCl 사이 접합 잠재적인 변화 때문에 유체 흐름 유도 유물을 보여준다 전극11참조. 유체 흐름을 이용한 접합 잠재적인 변화에 대 한 직접적인 증거는 그림 3에 표시 됩니다.
정션 잠재적인 교대는 3 단계에 따라 측정 되었다. 때문에 유체 흐름 변화, 3m KCl, 앞에서 설명한11로 가득한 오픈 피 펫을 사용 하 여 측정 되었다. 3m KCl 가득한 오픈 피 펫, 피펫으로 솔루션 입욕 사이 잠재적인 연결 최소화 될 수 있는, 그리고 주로 목욕 솔루션 Ag/AgCl 기준 전극에서 유체 흐름으로 인해 잠재적인 변화 했다. Agarose 3m KCl 없이 입욕 액체와 Ag/AgCl 기준 전극 사이 교량, 유체 흐름 유체 흐름 속도 의존 방식 (그림 3A) 액체와 Ag/AgCl 전극 사이 잠재적인 연결을 이동. 최대 접합 잠재적인 변화 ~ 7 추정 했다 (그림 3A, 하단) 접합 잠재력 유체 흐름 관계에서 mV. 대조적으로 때 agarose 3m KCl 다리 사용 되었다, 유체 흐름 않았다 변경 하지 입욕 및 기준 전극 사이 잠재적인 연결 ( 그림 3A의 아래쪽 그래프에 요약, 아래쪽).
농도 충분 한 대류 활동의 모드는 기능, 정적 및 유체 흐름 조건 차이 측정 하기 위하여 우리가 입욕 액체-Ag/AgCl 전극에 Cl- 농도 변화 효과 검사 4 단계에 따라 잠재적인 분기점입니다. 접합 농도 의존 방식에서 잠재적인 이동 Cl- 농도 증가 (그림 3B, 위쪽) 단지 유체 흐름 이동 속도 의존 방식으로 잠재적인 교차점. 접합 잠재력에는 Cl- 농도 의존 방식 (그림 3C), 목욕 솔루션 및 기준 전극 사이 접합 잠재적인 변경 했음을 나타내는 변경 못했습니다 KCl agarose 브리지를 사용 하 여, 사이 목욕 및 피 펫 솔루션. 정션 잠재력-[Cl-] 관계의 세미 로그 줄거리 그림 3B의 하단 패널에 표시 됩니다. 그림 3B, 추정된 최대 값 ~ 7 접합 잠재적인 변화 ( 그림 3A)에 mV 나왔다 Ag/AgCl 기준 전극에 인접 한 Cl- 농도 ~ 70%의 감소에서 결과 대량 액체 흐름은 결 석 하는 경우 액체 목욕 (그림 3B, 하단)의 평균 농도.
우리의 이전 연구에서 Kir2.1 전류는 convectively (증가) [K+] 채널 입구10에 복원 하 여 유체 흐름에 의해 촉진을 보도 했다. 이 아이디어로 Kir2.1 채널 Cl- 전극으로 Ag/AgCl 전극 기능으로 그냥 K+ 전극으로 작동할 수 있습니다 입욕 액체와 Ag/AgCl 전극 간에 발생 하는 현상에서 유래한 다. 이 아이디어는 그림 4A 와 4B에 개요로 설명 된다. Kir2.1의 유체 흐름을 이용한 촉진의 대표적인 예는 그림 4C에 표시 됩니다. Kir2.1 전류-100 0의 지주 잠재력에서 hyperpolarizing 전압 단계 elicited 했다 쥐 basophilic 백혈병 (RBL) 셀에 mV. 유체 흐름 (5 mL/min 또는 0.004 m/s)의 응용 프로그램은 쉽게 Kir2.1 전류 (그림 4C) 증가 했다. 유체 흐름에 의해이 촉진이 이전 세포 신호에 의해 아닙니다 그러나 unstirred 경계 층10K+ 이온의 대류 교통의 전기 효력에 의해 중재를 제안 되었다.
그림 1: 패치 클램프 기록에서 이온 채널의 유체 흐름 규칙에 대 한 입욕 챔버의 설치를 보여주는 도식. 하단 패널은 패치 클램프 챔버의 측면 보기 (화살 섹션). 그것은 유체 흐름의 경로 및 공부 셀, 전극, 및 액체의 입구/출구의 위치를 요약 한다. 액체는 지속적으로 흡입 하 여 콘센트 튜브를 통해 밖으로 펌핑, 때문에 챔버에 액체의 높이 상대적으로 일정 수준에서 유지 됩니다. 이 그림은 이전 게시11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 유체의 효과 흐름 L 유형 전압 종속 Ca2 + 채널 (VDCCL) 전류와 3m agarose 없이 KCl 다리. VDCCL 전류 효소 분산된 쥐 mesenteric 동맥 myocytes의 nystatin 구멍이 패치 클램프 기록에 기록 되었다. 4.2 m m EDTA divalent 양이온 없이 정상적인 tyrode 생리 적 소금물 목욕 솔루션11으로 사용 되었다. 피 펫 솔루션 포함 CsCl, 140 밀리미터; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 밀리미터; EGTA 0.05 m m; pH 7.2 CsOH와 조정. (A와 B) Agarose 3m와 KCl 브리지. (A)는 대표 나-V 관계 VDCCL 전류 및 유체 흐름의 효과 대 한. (B) 나-V 관계에 VDCCL 의 유체 효과의 요약. (C, D) Agarose 3m KCl 없이 다리. (C) 나-V 관계 VDCC패 해류의. (D) 부재 및 유체 흐름의 존재 나피크 VDCC패 해류의-V 관계를 요약. VDCCL 전류를 도출 하기 위한 전압 단계의 도형에 그림 삽입 표시 됩니다. 이 그림은 이전 게시11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 액체-금속 접합 입욕 액체와 Ag/AgCl 사이 잠재적인에 유체 흐름의 효과 참조 전극 및 unstirred 층 측정된 접점에서 참조 전극에 인접 한에서 진짜 Cl- 농도의 추정 가능성이 있습니다. 유체 흐름 (위 패널)의 다양 한 속도로 인해 접합 잠재적인 변경 (A) A 대표 추적. 이 그림은 이전 게시11에서 수정 되었습니다. 정션 잠재력 액체 흐름 율 관계 (n = 5). (B) 상단 패널: 대표 NaCl 솔루션의 다양 한 농도로 인해 접합 잠재적인 변화의 기록. 하단 패널: 접합 잠재력-[Cl-] 관계의 세미 로그 줄거리 (n = 5). 빨간색에서 직선 나타냅니다 49의 ten-fold 기울기와 평형에 대 한 수정된 Nernst 방정식에 의해 최적 mV. 나+, 생성 하는 잠재적인, 액체/금속 접합에 대 한 Cl-에 비해의 유한 선택 때문에 49의 기울기 값 58 대신 mV 뮤직 비디오, 제작 룸에서 접합 잠재력-[Cl-] 관계에 가장 적합 온도입니다. 49-mV 슬로프는 Cl- 의존 (또는 선택) Ag/AgCl 기준 전극 > 95% 이상 (이 경우에는 Na+)에서 다른 이온의, 카 츠 골드만-Hodgkin 전압 방정식에 따라 나타냅니다. 7의 교대 150 m m의 Cl- 농도에서 mV Cl- 농도에 ~ 30%의 감소를 나타냅니다. 3 M KCl agarose 다리의 사용을 가진 NaCl 솔루션의 다양 한 농도에서 접합 잠재력의 (C) A 대표 추적 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 이온 현재 플럭스 동안 오픈 채널에 인접 한 이온 농도에 유체 흐름의 대류 모델의 효과의 도식. (A) 전기 분야와 솔루션에 이온의 작은 대류와 정적 조건에서 K+통해+ K 이온 플럭스-선택적 이온 채널에 인접 한 microdomain K+ 농도 감소를 일으킬 수 있습니다는 채널 입구입니다. (B) 유체 흐름 convectively 오픈 채널 입구에 인접 한 K+ 농도 감소를 복원할 수 있습니다. (C) 안으로 정류기 Kir2.1 채널 전류에 유체 흐름의 효과. 유체 흐름은 즉시 Kir2.1 전류를 증가 했다. 전압 단계의 모양 그림 삽입에 표시 됩니다. Kir2.1 전류 높은 K+를 사용 하 여 기록 된-목욕-피 펫 솔루션. 솔루션을 입욕: 148.4 m m KCl, 0.33 m m NaH2포4, 5 mM HEPES, 0.5 m m MgCl2, 1.8 m m CaCl2, 11 m m D-포도 당; pH 7.4 NaOH로 조정. 플라스틱 솔루션: 135 5mm KCl, NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM ethyleneglycol-비스 (2-aminoethyl)-N, N, N', N',-tetraacetic 산 (EGTA), pH 7.2 (코와 조정). 이후 RBL-2 H 3 세포는 포 삼 투 붓기에 매우 취약 하 고 볼륨 활성화 Cl- 전류, 38mm 자당의 필연적인 트리거 osmolarity에 대 한 조정 및 셀 붓기 방지 입욕 솔루션에 추가 되었습니다. 또한, Cl- 채널 차단 [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic 산 (DIDS, 30 µ M)] Cl- 현재에 의해 어떤 오염 든 지 제거 하는 피 펫 솔루션에 추가 되었습니다. 패널 C 이전 게시10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리는 오픈 패치 클램프 피 펫이 높은 KCl로 가득와 잠재적인 액체 금속 접합을 결정 하 여 Ag/AgCl 기준 전극에 인접 한 unstirred 층에 진짜 Cl- 농도 측정 하는 방법을 시연 농도입니다. 경계 층에 Cl- 농도 변화 접합 잠재력의 변화 유체 흐름 조건에 정적에서 전환할 때 발생할 수 있습니다. 단순히 참조 전극과 입욕 액체 사이 KCl 다리는 agarose를 사용 하 여 패치 클램프 기록 중 Cl- 농도 관련 된 오류 또는 아티팩트 방지할 수 있습니다.
한 천 또는 agarose 소금 다리의 중요성을 강조, 게다가 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 추정에이 방법의 또 다른 응용 프로그램은 다음과 같습니다. Plasmalemmal 이온 채널 unstirred 경계에 진짜 이온 농도 (마찬가지로, Ag/AgCl 전극 기능 같은 Cl- 전극), 이온 선택적인 전극으로 작동할 수 있기 때문에 세포 막에 채널 입구에 인접 한 계층 표면 다 대량 액체의 평균 농도를 수 수 있습니다. 이 차이 대량 사이의 이온 농도에 유체 unstirred 층 세포 막에 인접 한 임상 설정에서 실제 시나리오 이며 채널 유체 흐름/전단 력에 의해 게이팅의 생물 학적 변조에서 고유 해야. 불행히도, Ag/AgCl 기준 전극과 입욕 액체 사이 unstirred 레이어 효과 달리 우리 수 없습니다 해결 unstirred 레이어 효과 세포 막 표면에 인접 한 유체 흐름/전단 힘에 의해 이온 채널의 규칙을 공부 하는 때.
그러나, 관찰 unstirred 층에 진짜 이온 농도 대량 액체 (그림 3)에서 약 70%는, 고려 우리가 만들 수 있습니다 일부 개정안 이온 채널의 생물 학적 변조를 구별 하는 실험 데이터 "전기 현상 unstirred 레이어 효과 의". 세포 막 표면에 unstirred 층에 진짜 이온 농도 대량 솔루션10최근 연구 입욕의 평균 농도의 약 70%로 예상 되었다. 때문에 유체 흐름 감소 이온 농도 복원, 셀룰러 신호10별도로 현재 Kir2.1 촉진. 우리의 이전 연구에서 전류 밀도 상당히 높은 (2.5 A / m2)+ 높은 extracellular K 농도 및 RBL에 Kir2.1의 높은 식 세포10. 그러나,의 경우에 다양 한 이온 채널 전류 밀도 진폭과 실제 세포 막, 세포 막 표면에 unstirred 레이어 효과에 달려 있습니다 크게 이온 채널 전류 밀도의 진폭. 게다가,이 발생할 수 있습니다 일부 이온 채널 전류 (상대적으로 낮은 전류 밀도와 특히 그들) 유체 흐름 규칙;에 민감 하 비록, 화학적 및 생물학적 하지 unstirred 레이어 효과 통제 된다. 따라서,이 여기에 설명 된 기술에 영향을 수 있습니다. 따라서, 실험 결과 수정 되어야 적절 한는 양적 방법 개발의 가능성을 미래에 연구 조사.
그림 3, Ag/AgCl 기준 전극과 입욕 액체 사이 액체 금속 접합 잠재력 Ag/AgCl 전극의 상태에 크게 의존 했다 관찰 합니다. 사실, Ag/AgCl 전극 상태에서 완벽 한 때, 유체 흐름으로 인해 잠재적인 교차점에 변화 최소화 (데이터 표시 되지 않음) 했다. 그러나, 불 쌍 한 염소 Ag/AgCl 전극의 잠재적인 교차점에 큰 변화를 발생합니다. Ag/AgCl 기준 전극은 자외선 빛과 산화 스트레스 등 다양 한 외부 자극에 매우 취약 한 천 또는 agarose KCl 다리를 사용 하 여 것이 항상 좋습니다. 비록 사이 액체에 의해 접합 잠재력에 변화 흐름 및 참조 전극 입욕 오류의, 우리는 성공적으로 접합의 변화를 측정 하 여 unstirred 경계 층에 진짜 이온 농도 추정 다양 한 유체 흐름 속도 (그림 3A 와 3B)에서 가능성.
진짜 Cl- 농도 변화에서 unstirred 경계 층에서 접합 잠재력의 평가 표준 곡선을 충분 유량 아래에 기록 한다 표준 곡선을 준비 하기 위한 4 단계에서 중요 한 포인트 (30 mL / 이 실험에서 분)입니다. 하지만이 흐름 속도가 매우 빠르고, 실용적인 경우 빠른 액체, 작은 농도 드롭이 있다 경계 층 (그림 3)에. 또한, 오픈 피 펫 패치 클램프 연구는 피 펫 및 솔루션 입욕 사이 잠재적인 연결에 변화를 방지 하기 위해서 일반 피 펫 솔루션 대신 높은 KCl로 가득 해야 합니다.
패치 클램프 설정에서 전단 힘 다음 관계11에서 예상할 수 있는:
Τ = (6μQ) / (bh2) (식 2)
장소: τ 는 전단 응력 (N/cm2); Μ 는 점도 (0.001 N m/s2 20 ° C에서 물에 대 한); Q 는 유체 유량 (m3/s); b 는 챔버 폭 (m); 그리고 h 는 챔버 높이 (m). 때 액체 흐름 율 30 mL/min, 그림 1 에 표시 된 패치 챔버에 전단 힘 ~0.75 dyn/cm2 위의 방정식에 따라 추정. 이것은 생리 적인 전단 강제;에 비해 낮은 전단 힘 수준 혈관 내 피 세포 전단 40 dyn/cm18,19의 힘을 받게 될 수 있습니다. 따라서, 제공 되는 이온 채널 전단 세력 미만 0.75 dyn/cm2를 구분 하지 않습니다, 우리는 unstirred 경계층 효과 컨트롤 상태를 설정 하 여 제외 후 이온 채널의 유체 흐름/전단 힘 감도 공부할 수 있습니다. 0.75 dyn/cm2를. 그러나, 일부 이온 채널, Kir2.1를 포함 하 여 전단 세력 미만 0.75 dyn/cm2,3,,45,6에 민감한 것 같다.
Unstirred 레이어 효과 배리와 동료12,13,,1415에 의해 원래 제안 되었다. 여기, 우리 오픈 패치 클램프 피 펫과 접합 잠재력에 변화를 측정 하 여 unstirred 층에 진짜 이온 농도 추정 하는 방법을 제공 합니다. 우리 또한이 unstirred 경계층 효과 이온 채널의 유체 흐름 유도 규칙에 기여할 수 있습니다 및 유체 흐름-mechanosensitivity 이온 채널의 공부 하는 동안 고려해 야 것이 좋습니다. 그러나,이 가설을 바탕으로, 그것은 질문 받을 수 몇 가지 이온 채널 전류 unstirred 경계층 효과 전기 경우 유체 흐름 종속 규칙 보다는 생물 학적 제어를 구분 하지 않습니다. 짧게 위에 제시 된로 이것은 아마도 통해 이온 전류 채널 큰 충분 한 단일 채널 전도도 때문에 긴 충분 한 오픈 시간 유체 흐름에 의해 촉진 될 수 있다. 즉, 이온 농도 대량 해결책에서 평균 다른 unstirred 층의 설립에 대 한 자 속 막 단계에서 충분히 빠른 비교 해야 하는 수성에14단계는 이다. 우리는 최근 그의 전도도 및 오픈 시간 충분히 높다, Kir2.1 채널을 통해 전류 이온 농도의 unstirred 경계층에서의 대류 복원의 메커니즘을 통해 유체 흐름에 의해 용이 하 게 제안 세포 막 표면11.
결론적으로, 우리는 오픈 패치 클램프 피 펫과 참조 전극 및 세포 막 표면에 인접 한 unstirred 경계 층에 이온 농도 측정 하는 방법 제시. Agarose KCl 다리의 중요성을 강조, 게다가이 메서드는 또한 이온 채널의 유체 흐름/전단 힘 제어를 해석 하는 동안 unstirred 레이어 효과 대 한 계정을 하는 방법을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 프로그램에 의해 기본 과학 연구 (2015R1C1A1A02036887 및 2016R1A2B4014795 NRF) 연구 재단의 국립 과학, 정보 통신의 내각에 의해 투자를 통해 파이 오 니 아 연구 센터 프로그램 (2011-0027921)에 의해 지원 되었다 & 미래 계획, 보건 복지, 한국 공화국 (HI15C1540)에 의해 한국 건강 기술 R & D 프로젝트 통해는 한국 보건 산업 개발 연구소 (진흥원)의 교부 금에 의해 투자 하 고.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
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