Summary
תעלות יונים Mechanosensitive נלמדים לעתים קרובות במונחים של זרימת נוזלים/הטיה רגישות כוח עם תיקון-קלאמפ הקלטה. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, התוצאה על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מספקים שיטות מניעת ותיקון שגיאות כאלה עם בסיס תיאורטי.
Abstract
זרימת נוזלים היא גירוי סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזלים. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל/הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, רגולציה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating יכול לתרום באופן ביקורתי. לכן, זרימת נוזל/הטיה הרגישות בכוח של תעלות יונים נחקרה בטכניקה תיקון-קלאמפ. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, תוצאות ופרשנות של נתונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מציגים ראיות ניסיוני ותיאורטי עבור שגיאות הקשורות זרימת נוזל מספקים שיטות להערכת, מניעת של תיקון שגיאות אלה. שינויים בצומת פוטנציאלי בין אלקטרודה הפניה Ag/AgCl נוזל רחצה נמדדו עם פיפטה פתוח מלא עם 3 מ' אשלגן כלורי. זרימת נוזלים יכול ואז shift mV פוטנציאליים כדי כ 7 את צומת נוזלי/מתכת. לעומת זאת, על ידי מדידת משמרת מתח הנגרמת על ידי זרימת נוזלים, אנחנו מעריכים את ריכוז יון בשכבת הגבול unstirred. במצב סטטי, ריכוז יון האמיתי סמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה או יון הערוץ לים על פני קרום התא יכול להגיע נמוך כמו כ- 30% זה מצב זרימה. הנחת agarose של 3 מ' אשלגן כלורי גשר בין האלקטרודה נוזל והפניה רחצה עשוי למנוע את הבעיה של צומת פוטנציאלי הסטה. עם זאת, האפקט שכבה unstirred סמוך פני קרום התא לא היתה אפשרות לתקן בדרך זו. כאן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ, המדגיש את החשיבות של שימוש agarose של מלח-גשר תוך כדי לימוד תקנה הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים יון. לכן, גישה חדשנית זו, אשר לוקח בחשבון את ריכוזי יונים בשכבת הגבול unstirred אמיתי, עשוי לספק תובנה שימושי על עיצוב ניסיוני ועל פרשנות הנתונים הקשורים ויסות נוזלים גזירה של תעלות יונים .
Introduction
זרימת נוזל זה הסימן סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזל נוזל הטיה תלויי-כוח וסקולרית שיפוץ ופיתוח1,2, 3,4,5. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, הוא האמין כי תקנה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating עשוי לתרום באופן ביקורתי תגובות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל5 , 6 , 7 , 8. לדוגמה, הפעלת המתקן פנימה אנדותל Kir2.1 ו- Ca2 +-activated K+ (KCa2.3, KCNN3) ערוצי לאחר Ca2 + זרם על ידי זרימת נוזל כבר הציע לתרום נוזל זרימה-induced vasodilation6,7,8. לכן, רבים תעלות יונים, ערוצי במיוחד מופעל מכנית או - עכבות, נחקרו מבחינת זרימת נוזל/הטיה רגישות כוח עם9,10 6,טכניקה תיקון-קלאמפ , 11. עם זאת, בהתאם פרוטוקול נסיוני שבוצעה במהלך תיקון-קלאמפ הקלטה, תוצאות ופרשנות של הנתונים על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים10,11.
מקור אחד של חפצים הנוצרות על-ידי זרימת נוזל בהקלטה תיקון-קלאמפ היא מצומת פוטנציאלי בין נוזל אמבטיה Ag/AgCl הפניה אלקטרודה11. בדרך כלל הוא האמין כי הצומת נוזלי/מטאל פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl אלקטרודה היא קבועה כמו ריכוז Cl– של נוזל רחצה נשמרת יציבה, שוקל את התגובה הכימית בין הפתרון רחצה Ag/AgCl אלקטרודה להיות:
Ag + Cl–↔ AgCl + אלקטרון (e–) (משוואה 1)
עם זאת, במקרה שבו התגובה הכוללת אלקטרוכימי בין פתרון רחצה אלקטרודה הפניה Ag/AgCl (משוואה 1) ממשיך משמאל לימין, ריכוז Cl– של נוזל רחצה צמוד Ag/AgCl הפניה אלקטרודה (שכבת גבול unstirred12,13,14,15) עשוי להיות נמוך בהרבה מאשר בעיקר רחצה פתרון, אלא אם כן מספיק תחבורה convectional מובטחת. באמצעות אלקטרודה Ag/AgCl ישנים או לא אידאליות הכלרה לקוי של Ag עשוי להגביר סיכון כזה. החפץ הקשורות זרימת נוזל על האלקטרודה הפניה, למעשה, יכול להיות מהכלל על-ידי פשוט הנחת גשר מלח agarose המקובלת בין נוזל רחצה לבין התייחסות אלקטרודה, מאז החפץ מבוסס על שינויים אמיתיים Cl– ריכוז הסמוך ה Ag/AgCl אלקטרודה11. פרוטוקול שהוצגו במחקר זה מתאר כיצד למנוע את השינויים אפשריות הקשורות זרימת צומת ולמדוד את ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred.
לאחר הנחת agarose של אשלגן כלורי גשר בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, יש גורם מכריע נוסף שיש לשקול: Ag/AgCl אלקטרודה רק כהפניה מתנהג כמו אלקטרודה Cl– , תעלות היונים גם יכול לתפקד כמו אלקטרודה יון סלקטיבי. המצב של שכבת הגבול unstirred בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה מתעוררת במהלך תנועת יונים בין הפתרונות חוץ-תאית, תאיים דרך תעלות היונים ממברנה. זה מרמז כי יש להשתמש בזהירות כאשר לפרש ברגולציה של יון ערוצי על ידי זרימת נוזלים. כפי שפורט המחקר הקודם שלנו11, התנועה של יונים דרך פתרון שבו הדרגתי אלקטרוכימי קיים יכול להתרחש באמצעות שלושה ייחודי מנגנונים: דיפוזיה, הגירה, הסעת חום, איפה דיפוזיה התנועה המושרה על ידי ריכוז הדרגתי, ההעברה היא התנועה מונע על ידי מעבר חשמל צבע, הסעת חום הוא התנועה באמצעות זרימת נוזל. בין המנגנונים האלה תעבורה שלוש, הסעת חום מצב תורם לרוב את תנועת יונים11 (> 1,000 פעמים גדול יותר מאשר דיפוזיה או ההעברה תחת הגדרות תיקון הרגיל-קלאמפ). זה מהווה את הבסיס התיאורטי של הסיבה צומת פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה יכול מאוד תחת תנאים שונים סטטי ו זרימת נוזל11.
לפי ההשערה המוצעת לעיל, כמה תופעות facilitatory של זרימת נוזלים בערוץ יון הנוכחי ניתן להסיק מן המחודשת הכנת ריכוז יון האמיתי סמוך לים ערוץ על פני הממברנה (שכבת גבול unstirred) 10. במקרה זה, ההשפעות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל על יון ערוץ זרמי פשוט שהתעוררו מאירועים אלקטרוכימי, לא מן התקנון של gating ערוץ יון. רעיון דומה הוצע בעבר על ידי בארי ועמיתיו12,13,14,15 בהתבסס על השיקולים התיאורטיים קפדני ועל ראיות, הידוע גם בשם השכבה unstirred או אפקט מספר תחבורה. אם כמה תעלות יונים יש מספיק מוליכות ערוץ אחד, מספיק זמן פתיחה-זמן לספק תחבורה מספקת שיעורי דרך הערוצים (מהירה יותר תחבורה תעריף של ממברנה מאשר על גבי המשטח ממברנה unstirred), אפקט בשכבת הגבול שעשויות להתעורר . לפיכך, התעבורה תלויי-הסעת חום יכול לתרום facilitations נוזל-זרימה-induced בסופו של דבר של יון הנוכחי10,12,13,14,15.
במחקר זה, אנו שמים דגש על חשיבות באמצעות אגר או agarose מלח-גשר תוך כדי לימוד נוזל-זרימה-induced רגולציה של זרמי יונים. כמו כן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred הסמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, הממברנה תעלות היונים. יתר על כן, הפרשנות תיאורטי של אפנון הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים ערוץ יון (קרי, הסעת חום השערה או שכבה unstirred התחבורה מספר אפקט) יכולה לספק תובנות בעלות ערך עבור עיצוב ופרשנות מחקרים על הטיה הכוח-ברגולציה של תעלות יונים. על פי האפקט תעבורה בשכבת הגבול unstirred מספר, אנו צופים כי יון זרמי ערוץ דרך כל סוגי הממברנה תעלות יונים ניתן להקל על ידי זרימת נוזלים, באופן עצמאי את רגישותם ביולוגי לכוח הטיה זרימת נוזלים, אבל רק אם תעלות היונים יש מוליכות ערוץ אחד מספיק פתוח-זמן רב. צפיפויות הנוכחי של ערוץ יון גבוה יותר עשוי להגביר את האפקט unstirred בשכבת הגבול על פני קרום התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדי של אוניברסיטת Konkuk.
1. Agarose מלח גשרים בין פתרון אמבט Ag/AgCl הפניה אלקטרודה
הערה: Agarose 3 מ' אשלגן כלורי, מלח גשרים מיוצרים כאמור תיאר12 עם הבדלים קלים.
- היווצרות גשרים
- כיפוף צינורות נימי זכוכית אש כדי ליצור צורת U לפי הצורך. הקוטר הפנימי של נימי הדם צריך להיות גדול מספיק כדי להפחית את התנגדות סדרה בעת הקלטת הזרמים יון גדולים. צינורות בקוטר הפנימי 2-5 מ מ מקובלים בדרך כלל.
- הכנת agarose 3 מ' אשלגן כלורי פתרון
- להכין 100 מ של 3 מ' אשלגן כלורי פתרון (1 מ' או 2 מ' הוא גם מקובל).
- שוקלים דור 3 של agarose.
- להמיס את agarose ב 100 מ של אשלגן כלורי (קרי, 3% agarose) על פלטה חמה בין 90 ל- 100 מעלות C.
- טעינת הגשרים עם 3 מ' אשלגן agarose
- לטעינה קלה, לטבול את הגשרים זכוכית בצורת U הפתרון agarose-אשלגן כלורי.
הערה: קל לחפור החוצה את הגשרים זכוכית אם הפתרון agarose-אשלגן כלורי מוכל במיכל רדוד ורחב. - להשאיר אותם ללילה בטמפרטורת החדר (RT) עבור agarose לקבוע וכדי להקשיח.
- בזהירות לחפור החוצה את הגשרים זכוכית agarose-אשלגן כלורי-טעון מהמלח מוקשה/סט agarose-
- לטעינה קלה, לטבול את הגשרים זכוכית בצורת U הפתרון agarose-אשלגן כלורי.
- אחסון הגשרים
- להכין כמות גדולה מספיק (קרי, 500 מ ל) של הפתרון אשלגן כלורי 3 מ' בבקבוק צוואר רחב.
- אחסן את הגשרים agarose מלח מוכן בבקבוק במקרר.
2. יישום בכוח גזירה זרימת נוזל לתאים תא מחבר תיקון-חובק למעקה
הערה: תרשים כללי של הגדרת ניסיוני תיקון-קלאמפ מוצג באיור1.
- המקום מכולה עמוסה רחצה פתרון (גובה ונפח יש כבר למדוד) מעל תא תיקון-קלאמפ.
- למלא את התא תיקון-קלאמפ הפתרון רחצה מאת suctioning הצינור.
- כדי להפסיק את זרימת הנוזלים, קליפ השפופרת בצד המכל כדי לחסום את זרימת הנוזלים ולאחר מכן קליפ הצינור לצד היניקה כדי לעצור את היניקה באותו זמן. . זה התנאי שליטה "נייח"
- כדי להחיל זרימת נוזל הטיה כוח, לפתוח שני צינורות בצדדים המכיל ולא שאיבה באותו זמן.
- לפני או אחרי החלת הכוח הטיה זרימת נוזל התא, למדוד את קצב הזרימה ב- mL/min.
- לחשב את קצב הזרימה על ידי מדידת הירידה בנפח נוזלים במשך זמן נתון.
- קצב הזרימה נמדד, גיאומטריית לחדר הרחצה (מבנה), הכוח הטיה לתא שהחיל את זרימת הנוזלים צריך להיות מוערך (עיין בסעיף הדיון).
- לחלופין, כדי לקבוע את קצב הזרימה (עבור השלבים 2.3-2.6), להשתמש משאבה זלוף. במקרה זה, להיות זהירים כדי להבטיח קבוע ולא זרימה פועמת.
3. מדידת שינויים בפוטנציאל צומת נוזלי-מתכת על ידי זרימת נוזל בין פתרון אמבט אלקטרודה הפניה Ag/AgCl (איור 3 א)
- השתמש Ag/AgCl אלקטרודה או גלולה, אשר זמין מן המוצרים מוכנות מראש, בלי הגשר מלח agarose.
- היכונו של תמיסת מלח פיזיולוגית לחדר הרחצה (למשל, 143 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ אשלגן כלורי, 0.33 מ מ2PO NaH4, 5 מ מ HEPES, MgCl 0.5 מ מ2, CaCl 1.8 מ מ2, 11 מ"מ D-גלוקוז; pH להתאים ל- 7.4 עם NaOH).
- מניחים על פיפטה תיקון המכיל פתרון אשלגן כלורי 3 מ' בבית הבליעה כדי למזער את משמרת צומת פוטנציאלי בין פיפטה פתרונות הרחצה.
- לתקן את מגבר מתח-קלאמפ למצב קלאמפ הנוכחי ("אני = 0" או "CC").
- וישכח את הפוטנציאל ההיסט ההתחלתי, למדוד שינויי מתח המושרה על ידי תעריפים זרימה שונים.
- כדי לוודא כי שינויי מתח הן פוטנציאל צומת נוזלי/מתכת, לבחון מחדש את ההשפעה של זרימת נוזלים על הפוטנציאל צומת באמצעות הגשר מלח agarose בין פתרון אמבט Ag/AgCl אלקטרודה.
4. ניסיוני אומדן ריכוז Cl אמיתי– בשכבה Unstirred הסמוך Ag/AgCl אלקטרודה בתנאי סטטי (איור 3B)
- התוצאות של שלב 3, לצייר את קשרי הגומלין פוטנציאל-ספיקה צומת, לאמוד את ערכו מקסימלי (קולח) של צומת shift פוטנציאליים על ידי קצב הזרימה העל-נוזל.
- להכין פתרונות עם ריכוזים שונים של Cl (קרי: 50 ', ' 99 ', ' 147 ', 195, 288 מ מ של NaCl).
- על-ידי שינוי של Cl– הריכוז בנוזל רחצה, לצייר צומת פוטנציאלי-[Cl–] הקשר. שים לב הקצב הנוזלים צריכה להיות קבועה וגבוהה מספיק (> 30 מ לדקה) כדי למנוע את הירידה של ריכוז Cl– לזה של האלקטרודה הפניה Ag/AgCl סמוכים.
- מן העקומות שני היחסים, להעריך את השינויים בריכוז Cl– של משמרת פוטנציאליים צומת נמדד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התא כולו תלויי-מתח Ca L-סוג2 + ערוץ (VDCCL) זרמי נרשמו ב עכברוש enzymatically התפזרו מצע המעי העליון עורקי נייטרלים, כפי שתואר לעיל11. השריר עורקי היו דיאליזה עם פתרון פיפטה Cs-עשיר תחת תצורת ניסטטין מחורר עם פתרון רחצה ללא הקטיון כלט כדי להקל על הזרם הנוכחי דרך VDCCL11,16. קצר depolarizing רמפות מתח או שלבים מתח, על פוטנציאל החזקה של-70 mV, הוחלו שמעודדים את הזרמים VDCCL . נציג זרם-מתח (אני-V) קשר ב- VDCCL היעדרות, נוכחות של זרימת נוזלים (5 mL/min או כ m/s 0.004), הקליט עם agarose אשלגן כלורי גשר, מוצג באיור 2A. זרימת נוזל מעט מוגברת של VDCCL הנוכחי באופן שאינו תלוי-מתח. זו השפעה והקלה על זרימת נוזלים על VDCCL הנוכחי מסוכם ב איור 2B.
ההנחיה ללא תלות מתח של VDCCL הנוכחי על ידי זרימת נוזלים היא תגובה נכונה VDCCL לכוח נוזל או הטיה. את 5 mL/min או כ 0.004 m/s של זרימת נוזלים בכיוונון הניסיונית הנוכחית הוערך לייצג את רמות דינ כ 0.1/cm2 מבחינת כוח הטיה (ראה דיון). עם זאת, כאשר מפנה Ag/AgCl אלקטרודה היה קשור באופן ישיר נוזל רחצה ללא agarose אשלגן כלורי גשר, מערכת היחסים -V אניבנוכחות זרימת נוזל זז ימינה לעומת זו של הזרמים VDCCL תחת סטטית מצב (איור 2C ו- 2D). כתוצאה מכך עיכוב של VDCCL הנוכחי-מתחים שליליים והנחייה של VDCCL הנוכחי-פוטנציאל depolarized או חיובית יותר. זו מדגימה את החפץ הנוצרות על-ידי זרימת נוזל תיקון-קלאמפ הקלטת בה שינוי מתח של אני-V היחס לא היה עקב השינוי של ערוץ gating אך היה למעשה עקב שינוי צומת פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl התייחסות אלקטרודה11. עדות ישירה למשמרת פוטנציאליים צומת הנוצרות על-ידי זרימת נוזל מוצג באיור3.
המשמרות פוטנציאלי של צומת נמדדו לפי שלב 3. השינויים, עקב זרימת נוזלים, נמדדו באמצעות פיפטה פתוח מלא עם 3 מ' אשלגן כלורי, כפי שתואר לעיל11. עם פיפטה פתוח מלא עם 3 מ' אשלגן כלורי, צומת פוטנציאלי בין פיפטה של רחצה פתרונות יכול להיות ממוזער, השינויים פוטנציאלי עקב זרימת נוזל היו בעיקר מן הרחצה פתרון Ag/AgCl הפניה אלקטרודה. בלי agarose 3 מ' אשלגן כלורי לגשר בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, זרימת נוזל העביר את צומת פוטנציאלי בין הנוזל האלקטרודה Ag/AgCl באופן תלוי-קצב זרימת נוזל (איור 3 א). מרבית junction פוטנציאל השינוי היה אומדן להיות ~ 7 mV ממערכת היחסים זרימת נוזל פוטנציאל צומת (איור 3A, התחתון). לעומת זאת, כאשר agarose 3 מ' אשלגן כלורי שימש גשר, זרימת נוזל לא תשנה את צומת פוטנציאלי בין האלקטרודה נוזל והפניה רחצה (סיכם בגרף התחתון של איור 3A, למטה).
על מנת למדוד ריכוז ההבדלים בין התנאים סטטי וזרימת נוזלים, אילו הסעת חום מספיק ודרכי פעולה הם פונקציונליים, בדקנו את האפקט של שינוי ריכוזים Cl– על האלקטרודה נוזל-Ag/AgCl רחצה צומת פוטנציאליים על פי שלב 4. הגדלת ריכוז Cl– העביר את הצומת פוטנציאליים באופן תלוי-ריכוז (איור 3B, העליון) בדיוק כמו זרימת נוזל העביר את הצומת פוטנציאליים באופן תלוי-קצב. באמצעות גשר agarose אשלגן כלורי, הפוטנציאל צומת נמנעה מלשנות ב מודיע– באופן תלוי-ריכוז (איור 3C), המציינת שאירעה בצומת פוטנציאל השינוי בין האלקטרודה פתרון והפניה אמבטיה, בין הפתרונות טורקי, פיפטה. העלילה למחצה ביומן של קשר הגומלין פוטנציאל-[Cl–] צומת מוצג בחלונית התחתונה של איור 3B. על פי התוצאות ב איור 3B, הערך המקסימלי משוערים של ~ 7 mV צומת משמרת פוטנציאליים (מתוך איור 3A) מרמז כי ריכוז Cl– הסמוך האלקטרודה הפניה Ag/AgCl פוחת ל ~ 70% ריכוז ממוצע הנפח רחצה נוזלי כאשר זרימת נוזל נעדר (איור 3B, התחתון).
במחקר הקודם שלנו, הזרמים Kir2.1 דווחו כדי להקל על ידי זרימת נוזל על-ידי שחזור convectively (הגדלת) [K+] כניסת ערוץ10. רעיון זה נובעת התופעה המתרחשת בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl אלקטרודה, כמו בערוץ Kir2.1 יכול לשמש אלקטרודה K+ בדיוק כמו הפונקציות אלקטרודה Ag/AgCl כמו אלקטרודה Cl– . רעיון זה מודגם סכמטי איור 4A , 4B. דוגמה מייצגת של ההנחיה הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים Kir2.1 מוצג באיור 4C. הזרמים Kir2.1 היינו שהפיק צעד מתח hyperpolarizing פוטנציאל החזקה של 0 ל-100 mV בתאי לוקמיה basophilic (RBL) עכברים. היישום של זרימת נוזלים (5 mL/min או 0.004 m/s) עלה ברצון הזרם Kir2.1 (איור 4C). זו ההנחיה על ידי זרימת נוזל הוצע בעבר כדי להיות מתווכת באיתות אלא על ידי השפעת אלקטרוכימי ההסעים הולכת חום של יוני K+ שכבת גבול unstirred10.
איור 1: סכימטי מציג כיוונון של חדר הרחצה לוויסות זרימת נוזל של תעלות יונים בהקלטה תיקון-קלאמפ. החלונית התחתונה היא להציג צד (סעיף הסאגיטלי) לשכת תיקון-קלאמפ. זה מסכם את הנתיב של זרימת נוזלים והמיקומים של תא למדה אלקטרודות, כניסה/יציאה של הנוזל. בגלל הנוזל נשאבים ברציפות החוצה דרך צינור עודפים ביניקה, גובה נוזל בבית הבליעה מתוחזק ברמה קבועים יחסית. דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השפעות של נוזל לזרום על L-סוג תלויי-מתח Ca2 + ערוץ (VDCCL) זרמים עם או בלי agarose של 3 מ' אשלגן כלורי גשר. VDCCL זרמי נרשמו ב נייטרלים מצע המעי העליון עכברוש enzymatically התפזרו עורקי עם ניסטטין תיקון מחורר-קלאמפ הקלטה. תמיסת מלח פיזיולוגית נורמלית tyrode עם 4.2 מ"מ EDTA ללא קטיונים דו ערכיים שימש פתרון רחצה11. הפתרון פיפטה הכילה CsCl, 140 מ מ; MgCl2, 1 מ מ; HEPES, 5 מ מ; EGTA 0.05 מ"מ; pH להתאים ל- 7.2 עם CsOH. (A ו- B) עם agarose 3 מ' אשלגן כלורי-גשר. (א) נציג אני-V קשר עבור הזרם VDCCL ואת ההשפעות של זרימת נוזלים. (ב) סיכום של ההשפעות נוזלים על המערכת יחסים -V אניהזרמים VDCCL . (C ו- D) ללא agarose 3 מ' אשלגן כלורי גשר. (ג) אני-V מערכות יחסים של הזרמים VDCCL . (ד) סיכם אני-V מערכות יחסים של הזרמים VDCCL שיא ההיעדרות, נוכחות של זרימת נוזלים. הצורות של מתח השלבים עבור העלאת VDCCL זרמי מוצגים על שיבוץ איור. דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השפעת זרימת נוזל על צומת נוזלי-מטאל פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה והשערוך ריכוז Cl– אמיתי בשכבה unstirred הסמוך האלקטרודה הפניה מצומת נמדד פוטנציאל. (א) A העקיבה נציג של צומת פוטנציאלי שינויים עקב המחירים השונים של זרימת נוזלים (החלונית העליונה). דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם11. הגומלין קצב זרימת נוזל פוטנציאל צומת (n = 5). (ב) החלונית העליונה: נציג הקלטה של שינויים פוטנציאליים צומת בשל ריכוזים שונים של NaCl פתרונות. החלונית התחתונה: העלילה למחצה ביומן של קשר הגומלין פוטנציאל-[Cl–] צומת (n = 5). הקו הישר באדום מייצג בכושר הטוב ביותר על ידי משוואת נרנסט ששונה על שיווי משקל פוטנציאלי עם מדרון ten-fold של 49 mV. חייבים מידת הבררנות סופיים של Na+, בהשוואה לזו של Cl-, ליצירת לצומת נוזלי/מטאל פוטנציאלי, ערך השיפוע של 49 mV, במקום 58 mV, המיוצר בכושר הטוב ביותר ביחס פוטנציאל-[Cl–] צומת בחדר טמפרטורה. המדרון 49-mV מציין את Cl– תלות (או סלקטיביות) הפניה Ag/AgCl אלקטרודה > 95% מעל יונים אחרים (במקרה זה, Na+), על פי המשוואה מתח גולדמן-הודג'קין-כץ. משמרת של 7 mV-ריכוז Cl– של 150 מ מ מצביעה על ירידה של ~ 30% ירידה בריכוז Cl– . (ג) עקיבה נציג של צומת פוטנציאל בריכוזים שונים של NaCl פתרונות עם שימוש של 3 מ' אשלגן agarose גשר (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: סכימטי של ההשפעות של הסעת חום דגם של זרימת נוזלים על ריכוז יון הסמוכים הערוצים פתוחים במהלך שטף הנוכחי יון. (א) תחת תנאים סטטיים צמוד הולכת חום קטן של יונים בתמיסה עם שדה חשמלי, יונים K+ שטף דרך K+-יון סלקטיבי ערוצים יכול לגרום ירידה בריכוז K+ microdomain הסמוכים כניסת הערוץ. (ב) זרימה convectively באפשרותך לשחזר את הירידה בריכוז K+ , סמוך לים ערוץ פתוח. (ג) ההשפעה של זרימת נוזלים על הזרמים ערוץ Kir2.1 יישור פנימה. זרימה מוגברת באופן מיידי את הזרמים Kir2.1. צורת השלב מתח מוצג על שיבוץ איור. הזרמים Kir2.1 הוקלטו באמצעות K גבוה+-בגד ים - פיפטה ופתרונות. רחצה פתרון: 148.4 מ מ אשלגן כלורי, 0.33 מ מ2PO NaH4, 5 מ מ HEPES, MgCl 0.5 מ מ2, מ מ 1.8 CaCl2, 11 מ"מ D-גלוקוז; pH להתאים ל- 7.4 עם NaOH. פיפטה פתרון: 135 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ NaCl, 5 מ מ ג-ATP, 10 מ מ HEPES, 5 מ מ ethyleneglycol-bis (2-aminoethyl)-N, N, N', N',-tetraacetic חומצה (EGTA), pH 7.2 (מותאם עם קו). כיוון RBL - 2H 3 תאים הם רגישים מאוד נפיחות היפו-osmotic הסוגר של עוצמה-הופעלה Cl– זרמים, 38 מ מ סוכרוז היה להוסיף את הפתרון בגד ים כדי להתאים osmolarity וכדי למנוע נפיחות התא. יתר על כן, חוסם ערוץ Cl– [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic חומצה (למעשים גדולים עלות גבוהה, 30 מיקרומטר)] נוספה הפתרון פיפטה כדי למנוע כל זיהום על ידי זרמי Cl– . לוח ג שונתה מן הפרסום הקודם10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, הפגנו שיטה למדידת ריכוז Cl– אמיתי בשכבה unstirred הסמוך האלקטרודה הפניה Ag/AgCl על-ידי קביעת לצומת נוזלי-מטאל פוטנציאלי עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ מלא של אשלגן גבוהה ריכוז. משמרת של צומת פוטנציאל השינוי בריכוז Cl– בשכבת הגבול יכול לגרום כאשר מחליפים מ סטטי ותנאים של זרימת נוזל. פשוט באמצעות agarose של אשלגן כלורי גשר בין אלקטרודה הפניה נוזל רחצה יכול למנוע את שגיאות הקשורות ריכוז Cl– או חפצים במהלך ההקלטה תיקון-קלאמפ.
מלבד הדגשת החשיבות של גשר המלח אגר או agarose, יישום נוסף של שיטה זו של הערכת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred הוא כדלקמן. כי תעלות יונים plasmalemmal יכול לשמש אלקטרודות יון סלקטיבי (רק בתור Ag/AgCl אלקטרודה הפונקציות כמו אלקטרודה Cl– ), ריכוז יון אמיתי בגבול unstirred שכבה הסמוך לים ערוץ-קרום התא השטח יכול להיות שונה משם הריכוז הממוצע של הנוזל בכמות גדולה. ההבדל בריכוז יונים בין הנפח שכבה של unstirred נוזלים בצמוד קרום התא התרחיש האמיתי תחת הגדרות קליני, צריך להיות מכובד מן אפנון הביולוגי של ערוץ gating בכוח זרימת נוזל/הטיה. למרבה הצער, בניגוד אפקט שכבה unstirred בין אלקטרודה הפניה Ag/AgCl נוזל רחצה, אנחנו לא יכולים לתקן את אפקט שכבה unstirred סמוך פני קרום התא כשלמדתי ברגולציה של תעלות יונים בכוח זרימת נוזל/הטיה.
עם זאת, בהתחשב התצפית כי ריכוז יון אמיתי בשכבה unstirred הוא כ- 70% מזה בנוזל בכמות גדולה (איור 3), אנחנו יכולים לעשות כמה תיקונים נתונים ניסיוני כדי להבדיל את אפנון הביולוגי של תעלות יונים מ- "אלקטרוכימי התופעה של אפקט שכבה unstirred". ריכוז יון אמיתי בשכבה unstirred על פני קרום התא היה צפוי להיות כ-70% הריכוז הממוצע של הנפח רחצה פתרון מחקר האחרונות10. מכיוון זרימת נוזל לשחזר את ריכוז יון ירד, זה הקל את Kir2.1 הנוכחי ללא תלות הסלולר איתות10. במחקר הקודם שלנו, צפיפות זרם היה גבוה באופן משמעותי (2.5 A / m2) עם ק חוץ-תאית גבוהה+ ריכוז והבעה גבוהה של Kir2.1 ב RBL תאים10. עם זאת, במקרה של קרום התא אמיתי עם amplitudes שונים של צפיפות זרם ערוץ יון, האפקט unstirred שכבה על פני קרום התא עשוי תלויה מאוד משרעת של צפיפות זרם ערוץ יון. חוץ מזה, זה עלול לגרום יון כמה זרמים ערוץ (במיוחד אלה עם צפיפות זרם נמוך יחסית) להיות חסר רגישות ויסות זרימת נוזל; למרות זאת, אפקט שכבה unstirred מוסדר electrochemically ואת לא מבחינה ביולוגית. לכן, זה עלול להשפיע על טכניקה המתוארת כאן. לכן, האפשרות לפתח שיטה כמותית היא נאותה עבור תיקון תוצאות הניסוי צריך להיות חקר בעתיד מחקרים.
איור 3, הבחנו כי הפוטנציאל נוזלי-מטאל צומת בין אלקטרודה הפניה Ag/AgCl נוזל רחצה היה תלוי מאוד על מצבו של האלקטרודה Ag/AgCl. למעשה, כאשר האלקטרודה Ag/AgCl היה מושלם במצב, שינויים בצומת פוטנציאלי עקב זרימת נוזל היה מינימלי (נתונים לא מוצג). אולם, הכלרה המסכן של האלקטרודה Ag/AgCl גרם שינוי גדול בצומת פוטנציאליים. מאז האלקטרודה הפניה Ag/AgCl הוא מאוד רגישים לגירויים חיצוניים שונים, כגון לחץ חמצוני המוארים אולטרה סגול, באמצעות אגר או agarose גשר אשלגן כלורי מומלץ תמיד. למרות שינויים בפוטנציאל צומת על ידי נוזל לזרום בין רחצה של נוזלים ושל האלקטרודה הפניה הוא מקור פוטנציאלי של שגיאה, בהצלחה שציפינו ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred על ידי מדידת ההעברה של צומת פוטנציאל תחת המחירים זרימת נוזלים שונים (איור 3A ו- 3B).
הנקודה הקריטית בשלב 4 להכנת העקומה סטנדרטי עבור הערכת של אמיתי ריכוז Cl– שכבות גבול unstirred של המשמרת של צומת פוטנציאל הוא כי העיקול רגיל צריך להיות מוקלט תחת קצב זרימה sufficent (30 מ ל / מין ניסוי). למרות זה קצב הזרימה הוא מהיר מאוד, במקרים המעשיים מהר יותר הנוזל, קטן יותר ריכוז המסירה היא על הרבדים גבול (איור 3). בנוסף, פיפטה פתוח יש למלא עם אשלגן גבוהה, במקום פתרון קבוע פיפטה, על מנת מחקר תיקון-קלאמפ כדי למנוע שינוי צומת פוטנציאלי בין פיפטה רחצה פתרון.
יכול להיות מוערך הכוח הטיה בקביעת תיקון-קלאמפ מן היחסים הבאים11:
Τ = (6μQ) / (bh2) (משוואה 2)
איפה: τ הוא מאמץ גזירה (N/cm2); Μ הוא צמיגות (0.001 N m/s2 עבור מים ב- 20 ° C); Q הוא קצב זרימת נוזל (מ'3/s); b הוא הרוחב קאמרית (ז); ו- h הוא הגובה קאמרית (ז). כאשר קצב זרימת נוזל 30 מ לדקה, הכוח הטיה בבית הבליעה-התיקון המוצג באיור 1 מוערך ~0.75 רמות דינ/cm2 לפי המשוואה הנ. זוהי רמה בכוח גזירה נמוכה לעומת הכוח הטיה פיזיולוגית; תאי אנדותל בכלי הדם יכולה להיות נתונה להטיית כוחות של רמות דינ/ס מ עד 4018,19. לכן, ובלבד תעלות היונים אינן רגישות להטיית כוחות רמות דינ/cm 0.75 פחות מ2, נוכל ללמוד את הרגישות בכוח זרימת נוזל/הטיה של תעלות יונים לאחר למעט את האפקט unstirred שכבת גבול על-ידי הגדרת מצב שליטה 0.75 רמות דינ/ס מ2. עם זאת, כמה תעלות יונים, כולל Kir2.1, נראה רגיש להטיה כוחות פחות מ 0.75 רמות דינ/cm2,3,4,5,6.
אפקט שכבה unstirred הוצע במקור על ידי בארי ועמיתיו12,13,14,15. כאן, אנו מספקים שיטה לאמוד ריכוז יון אמיתי בשכבה unstirred על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל צומת עם תיקון פתוח-קלאמפ פיפטה. אנו גם מציעים כי אפקט unstirred שכבת גבול זה עשוי לתרום תקנה הנוצרות על-ידי זרימת נוזל של יון ערוץ זרמי ויש להתייחס תוך כדי לימוד זרימת נוזלים-mechanosensitivity של תעלות יונים. עם זאת, על סמך השערה זו, זה עשויים להתבקש למה כמה זרמים ערוץ יון אינם רגישים תקנה תלויי-זרימת נוזלים אם האפקט unstirred שכבת גבול אלקטרוכימיות מאשר הדברה ביולוגית. כמו בקצרה הממוענת אלי מעל זה כנראה כי רק יון זרמים דרך ערוצי עם גדול מוליכות ערוץ אחד מספיק זמן מספיק פתוח-זמן ניתן להקל על ידי זרימת נוזלים. כלומר, הממסד של השכבה unstirred שבו ריכוז יון שונה מן הממוצע בפתרון בצובר שטף בשלב ממברנה צריכה להיות מהירה מספיק בהשוואה כי במימית שלב14. לאחרונה הצענו כי הזרם דרך ערוצי Kir2.1, אשר מוליכות וזמן פתוח גבוהים מספיק, בהנחייתם של זרימת נוזלים באמצעות מנגנונים של שיקום הכנת ריכוז יון בשכבה גבול unstirred של קרום התא על פני השטח11.
לסיכום, אנו מציגים שיטה למדידת ריכוז יון בשכבת הגבול unstirred הסמוך למשטח הפניה אלקטרודה, קרום התא עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ. מלבד הדגשת החשיבות של agarose אשלגן כלורי גשר, שיטה זו מספקת גם דרך להסביר אפקט שכבה unstirred במהלך פענוח זרימת נוזל/הטיה כוח השליטה תעלות יונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מרכז מחקר חלוץ (2011-0027921), על ידי יסוד מדע תוכניות מחקר (2015R1C1A1A02036887 ו- NRF-2016R1A2B4014795) דרך נבחרת מחקר קרן של קוריאה במימון משרד המדע, תקשוב & תכנון העתיד, על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), אשר ממומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
