Summary
Mechanosensitive ионные каналы часто изучаются с точки зрения потока жидкости/сдвига силу чувствительности с патч зажим записи. Однако в зависимости от экспериментальный протокол, итоги по жидкости потока правила ионных каналов может быть ошибочным. Здесь мы предлагаем методы для предотвращения и исправления таких ошибок с теоретической основы.
Abstract
Потока жидкости является важной экологической стимул, который контролирует многие физиологические и патологические процессы, такие как жидкости потока индуцированной вазодилатации. Хотя молекулярные механизмы для биологической реакции в жидкости потока/поперечной силы полностью не поняты, жидкости потока опосредованное регулирование ионного канала стробирования может способствовать критически. Таким образом поток жидкости/сдвига силу чувствительности ионных каналов была изучена с помощью метода патча зажим. Однако в зависимости от экспериментальный протокол, результаты и интерпретации данных может быть ошибочным. Здесь мы представляем экспериментальные и теоретические доказательства для жидкости ошибки, связанные с потоком и предоставляют методы для оценки, предупреждения и исправления этих ошибок. Изменения в стыке потенциальных между Ag/AgCl электрод сравнения и жидкость для купания были измерены с открытым пипетки, заполнены с 3 M KCl. потока жидкости может затем сдвиг потенциал приблизительно 7 mV жидкости/металлические соединения. И наоборот измеряя напряжение сдвига, индуцированный поток жидкости, мы оценили концентрации ионов в unstirred пограничном слое. В статических условиях реальная ионная концентрации, прилегающих к Ag/AgCl ссылка электрода или ионного канала входе на поверхности клеточной мембраны может достигать как низко как примерно 30% в состояние потока. Размещение агарозы 3 M KCl мост между электродом жидкости и ссылка купание может предотвратить эту проблему потенциального перехода перекрестка. Однако эффект unstirred слоя, прилегающих к поверхности клеточной мембраны не может быть исправлена таким образом. Здесь мы предоставляем метод для измерения концентрации реальных ионов в unstirred пограничном слое с открытым патч зажим пипетку, подчеркивая важность использования агарозы соли мост во время учебы жидкости регулирования потока индуцированной ионных токов. Таким образом этот новый подход, который учитывает реальные концентрации ионов в unstirred пограничном слое, может оказаться полезным на экспериментальный дизайн и интерпретации данных, относящиеся к жидкости касательное напряжение регулирования ионных каналов .
Introduction
Потока жидкости — важные экологические подсказка, которая контролирует многие физиологические и патологические процессы, такие как жидкости потока индуцированной вазодилатацию и жидкости сдвига силы зависимых сосудистой реконструкции и развития1,2, 3,4,5. Хотя молекулярные механизмы биологической реакции на поперечной силы потока жидкости полностью не поняты, считается, что жидкости потока опосредованное регулирование ионного канала стробирования критически может способствовать жидкости потока индуцированной ответы5 , 6 , 7 , 8. Например, активации эндотелиальной внутрь выпрямителя Kir2.1 и Ca2 +-активированные K+ (KCa2.3, KCNN3) каналы после Ca2 + приток жидкости потока было предложено вносить жидкости поток индуцированной вазодилатация6,,78. Таким образом, многие каналы иона, особенно механически активированного или - тормозится каналов, были изучены с точки зрения потока жидкости/сдвига силу чувствительности с патч зажим техника6,9,10 , 11. Однако, в зависимости от экспериментальный протокол, выполненных во время фиксации записи, результаты и интерпретации данных о жидкости потока правила ионных каналов может быть ошибочным10,11.
Один источник жидкости потока индуцированной артефактов в патч зажим записи — от перекрестка потенциальных между теплоносителя и ссылка Ag/AgCl электродов11. Считается, что жидкость/металл стыке потенциальных между купания жидкости и Ag/AgCl электродов постоянно как концентрация Cl– купания жидкости остается неизменной, учитывая химической реакции между купания решения и Ag/AgCl электродов для:
AG + Cl–↔ AgCl + Электрон (e–) (уравнение 1)
Однако в случае, где в целом электрохимической реакции между купания решения и ссылка Ag/AgCl электродов (уравнение 1) выполняется слева направо, концентрация Cl– купания жидкости рядом с Ag/AgCl ссылки электрод (unstirred пограничный слой12,13,14,15) могут быть намного ниже, чем в основную часть купания решения, если достаточно конвекционный транспорт обеспечивается. Использование старых или неидеальной Ag/AgCl электродов с неадекватным хлорирования Ag может увеличить такой риск. Этот жидкости связанных с потоком артефакт на электрод сравнения, в самом деле, могут быть исключены, просто поместив обычных агарозы солевой мост между купания жидкости и ссылка электрода, так как артефакт основан на изменения в реальном Cl– концентрация рядом с Ag/AgCl электродов11. Протокол, представленный в настоящем исследовании описывает, как для предотвращения потенциальных изменений связанных с потоком соединения и измерять концентрации реальных ионов в unstirred пограничном слое.
После размещения агарозы KCl мост между купания жидкости и Ag/AgCl электрод сравнения, является другим важным фактором, который следует рассматривать: просто как ссылка Ag/AgCl электродов действует как электрод Cl– , ионные каналы также может функционировать как ионоселективного электрода. Ситуация unstirred пограничный слой между купания жидкости и Ag/AgCl электродов ссылка возникает во время движения ионов между внеклеточным и внутриклеточных решения через мембранных ионных каналов. Это означает, что необходимо с осторожностью подходить при интерпретации регулирование ионных каналов потока жидкости. Как указывалось в наших предыдущих исследования11, движение ионов через решения, в котором присутствует электрохимических градиент может происходить через три отдельных механизмов: диффузия, миграция и конвекции, где Диффузия это движение индуцированных градиент концентрации, миграция движение, движимый электрического градиента, и конвекции движения потока жидкости. Среди этих трех транспортных механизмов режим конвекции вносит наиболее движение ионов11 (> 1000 раз больше, чем диффузии или миграции под обычной фиксации параметров). Это формирует теоретические основы, почему Джанкшен потенциальных между купания жидкости и Ag/AgCl электродов ссылка может очень под различные статические и жидкости потока условия11.
Согласно гипотезе, предложенных выше, некоторые протекать эффекты потока жидкости на текущий ионного канала может быть выведено из конвективных восстановление реальных ионной концентрации рядом с входной канал на поверхности мембраны (unstirred пограничный слой) 10. В этом случае жидкости потока индуцированные эффекты у ионных токов канал просто возникли из электрохимических события, не от регулирования ионного канала стробирования. Аналогичная идея было ранее предложено Барри коллег12,13,14,и15 на основании строгих теоретических соображений и экспериментальных доказательств, также известный как unstirred слой или номер эффект транспорта. Если некоторые каналы иона имеют достаточно одного канала проводимости и достаточно долго открытым время предоставить достаточные транспортные ставки через каналы (транспорта быстрее в мембранных чем в поверхности unstirred мембраны), пограничный слой эффект может возникнуть . Таким образом конвекции зависимых транспорта может способствовать окончательной жидкости поток индуцированной льгот Ион текущих10,12,13,14,15.
В этом исследовании, мы подчеркиваем важность использования агар или агарозы соли мост во время учебы жидкости поток индуцированной регулирование ионных токов. Мы также предоставляют метод для измерения концентрации реальных ионов в unstirred пограничный слой, прилегающий к Ag/AgCl ссылка электрода и мембранных ионных каналов. Кроме того теоретические интерпретации жидкости модуляции потока индуцированной ионного канала токов (то есть конвекция гипотеза или unstirred слой транспорта номер эффект) могут предоставить ценную информацию для разработки и интерпретации исследований на сдвига силы регулирование ионных каналов. Согласно unstirred пограничного слоя транспорта номер эффект мы прогнозируем, что ионного канала токов через все виды мембранных ионных каналов может быть облегчено потока жидкости, независимо от их биологической чувствительности к поперечной силы потока жидкости, но только, если ионные каналы имеют достаточно одного канала проводимости и долго открытым. Высших плотностях тока ионного канала может увеличить эффект unstirred пограничного слоя на поверхности клеточной мембраны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами институциональных университета Конгук.
1. агарозы соли мосты между раствор для ванн и Ag/AgCl электродов ссылки
Примечание: Агарозы 3M KCl, соли мостов производится как ранее описанные12 с небольшими вариациями.
- Формирование мостов
- Согните огонь стеклянные капилляры в форме U-формы при необходимости. Внутренний диаметр капилляров должно быть достаточно большим, для уменьшения сопротивления серии при записи больших ионных токов. Трубы с внутренним диаметром 2-5 мм обычно приемлемо.
- Приготовление раствора KCl агарозы 3 M
- Подготовка 100 мл раствора KCl 3 M (1 М или 2 М также является приемлемым).
- Весят 3 g агарозы.
- Распустить агарозы в 100 мл хлористого калия (т.е. 3% агарозном) на горячей плите между 90 и 100 ° C.
- Загрузка мосты с 3 M KCl агарозы
- Для простой загрузки, погружайте U-образной стеклянной мостов в агарозном несогретом растворе.
Примечание: Это просто выкопать стекла мосты, если агарозы несогретом растворе содержится в контейнере мелкой и широкий. - Держите их на ночь при комнатной температуре (RT) для агарозы и затвердеть.
- Осторожно выкапывают агарозы KCl загружен стекла мосты от набора/закаленные агарозы соли.
- Для простой загрузки, погружайте U-образной стеклянной мостов в агарозном несогретом растворе.
- Хранение мосты
- Подготовить достаточно тома (т.е., 500 мл) раствора KCl 3 M в бутылке широкий шеей.
- Храните подготовленный мостов агарозы соли в бутылки в холодильник.
2. применение потока жидкости поперечной силы к ячейкам в камере патч зажима
Примечание: Схема экспериментальной установки патч зажим показан на рисунке 1.
- Место контейнер загружается с купания решения (объем и высота должна уже быть измерены) выше патч зажим камеры.
- Заполните-фиксации камеры с купания решения путем аспирации трубки.
- Чтобы остановить поток жидкости, зажим трубки на стороне контейнера, чтобы блокировать поток жидкости, а затем обрезать трубу на всасывающей стороне прекратить всасывания в то же время. Это условие «стационарных» управления.
- Чтобы применить потока жидкости поперечной силы, откройте оба трубы на стороне контейнера и всасывания в то же время.
- До или после применения поперечной силы потока жидкости в ячейку Измерьте скорость потока мл/мин.
- Вычислить скорость потока путем измерения уменьшение объем жидкости в течение определенного времени.
- От измеренного расхода и геометрии (структура) купания камере должны оцениваться поперечной силы, примененный к ячейке потоком жидкости (см. раздел "обсуждение").
- Кроме того чтобы контролировать скорость потока (для шагов 2,3-2,6), используйте перфузионного насоса. В этом случае будьте осторожны для обеспечения постоянной, а не пульсирующего потока.
3. измерение изменений в жидкость металл Junction потенциал потоком жидкости между раствор для ванн и Ag/AgCl электродов ссылка (Рисунок 3А)
- Используйте Ag/AgCl электродов или Пелле, который доступен из готовых продуктов, без соли мост агарозы.
- Подготовьте физиологический физиологической соли купания камеры (например, 143 мм NaCl, 5.4 KCl, 0,33 мм NaH2PO4, 5 мм HEPES, MgCl 0,5 мм2, 1.8 мм CaCl2, 11 мм D-глюкозы; рН скорректирована до 7,4 с NaOH).
- Установите патч пипетки, содержащий раствором KCl 3 M в камере для сведения к минимуму потенциальных сдвиг соединения между пипетки и купания решения.
- Исправить мембраной усилитель в режим текущего зажим («я = 0» или «Копия»).
- После отменяешь начального смещения потенциал, измерения перепадов напряжения, вызванного различными скорости потока.
- Чтобы убедиться, что изменения напряжения в жидкости/металлические соединения потенциалов, вновь изучить влияние потока жидкости на стыке потенциал с помощью агарозы солевой мост между раствор для ванн и Ag/AgCl электродов.
4. экспериментальная оценка концентрации реальных Cl– в Unstirred слой, прилегающий к Ag/AgCl электродов при статических условиях (рисунок 3B)
- Из результатов шага 3 привлечь отношения потенциал-расхода Джанкшен и оценить значение максимального (насыщения) потенциального сдвига Джанкшен, скорость потока выше жидкости.
- Подготовка решений с различных концентраций Cl (то есть, 50, 99, 147, 195 и 288 мм NaCl).
- Изменив Cl– концентрация в купать жидкости, нарисуйте [Cl–] отношения потенциальных - Джанкшен. Обратите внимание, что скорость жидкости должна быть постоянной и достаточно высокой (> 30 мл / мин) для предотвращения снижения концентрации Cl– со смежными Ag/AgCl электрод сравнения.
- От отношения двух кривых оцените изменения в концентрации Cl– от измеренной Джанкшен потенциального сдвига.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клеточных напряжени тока зависимых L-типа Ca2 + канал (LVDCC) токи были записаны в ферментативно дисперсной крыса брыжеечных артерий миоцитах, как описано11. Артериальной миоцитов были dialyzed Cs богатые пипеткой раствором под Нистатин перфорированных конфигурации с двухвалентной купания катион бесплатные решения для облегчения текущего потока через VDCCL11,16. Краткое деполяризующий напряжения пандусы или напряжения шаги, в холдинг потенциал -70 mV, были применены к вызывают токов VDCCЛ . Представитель-амперных (I-V) отношения в VDCCL в отсутствие и наличие потока жидкости (5 мл/мин или приблизительно 0,004 м/сек), записанный с агарозы KCl мост, показано на рисунке 2А. Потока жидкости слегка увеличилась VDCCL тока в напряжение независимым образом. Это облегчение эффект потока жидкости на текущий VDCCL приводится на рисунке 2B.
Напряжение независимые содействие VDCCL текущий поток жидкости является надлежащий ответ VDCCЛ жидкости или сдвига силы. 5 мл/мин или приблизительно 0,004 м/сек потока жидкости в текущей экспериментальной установки по оценкам представляют приблизительно 0,1 Дин/см2 с точки зрения поперечной силы (см. обсуждение). Однако когда Ag/AgCl ссылку электрода непосредственно связано с купания жидкости без агарозы KCl мост, -V отношения яприсутствии потока жидкости, смещается вправо, по сравнению с VDCCL течения под статическое состояние (рис. 2 c и 2D). Это привело к ингибитирование VDCCL ток при отрицательных напряжений и содействие VDCCL ток на более деполяризованный или положительных потенциалов. Это иллюстрирует жидкости потока индуцированных артефакт в патч зажим запись в котором напряжения сдвига -V отношения яне из-за изменения канала стробирования, но был на самом деле из-за соединения потенциальных сдвиг между купания жидкости и Ag/AgCl Ссылка электрода11. Прямых доказательств для потенциального сдвига жидкости потока индуцированной Джанкшн это показано на рисунке 3.
Потенциальные изменения соединения были измерены согласно шаг 3. Изменения, из-за потока жидкости, были измерены с помощью открытых пипетки, заполнены с 3 M KCl, как описано11. С открытым пипетку, заполнены с 3 M KCl перекрестка потенциальных между пипетки и купания решения могут быть сведены к минимуму, и потенциальные изменения из-за потока жидкости были главным образом от купания решения и Ag/AgCl электродов ссылки. Без агарозы 3 M KCl мост между купания жидкости и электрод сравнения Ag/AgCl, поток жидкости перенесено перекрестка потенциальных между жидкостью и Ag/AgCl электродов образом курс зависит от потока жидкости (рис. 3A). Предельная потенциального изменения было экстраполировать ~ 7 mV от перекрестка отношения потенциал жидкости потока (рис. 3A, внизу). В отличие от этого, когда агарозы 3 M KCl, мост был использован, поток жидкости не изменяют перекрестка потенциальных между электродом жидкости и ссылка купание (кратко в нижней графе рис. 3A, снизу).
Для того чтобы измерить концентрации различия между условиями статические и жидкости потока, в котором достаточно конвекции режимы действий являются функциональными, мы исследовали эффект изменения концентраций Cl– на купание жидкости Ag/AgCl электродов Перекресток потенциальных согласно шаг 4. Повышение концентрации Cl– перенесло перекрестка потенциал в зависимости от концентрации (рис. 3Б, сверху) так же, как поток жидкости смещается перекрестка потенциал в зависимости от курса. Использование моста агарозы KCl, перекрестка потенциал был лишен возможности изменения в концентрации обнаруживавшие (рис. 3 c), указывающий на стыке потенциального изменения между электродом справочник и решение Ванна, Cl– не между ванной и пипетки решений. Полулогарифмический участок перекрестка потенциал-[Cl–] связь показана на нижней панели рисунок 3B. Согласно результатам в рисунок 3B, экстраполированная максимальное значение ~ 7 mV в Джанкшен потенциального сдвига (от рис. 3A) свидетельствует о том, что концентрация Cl– рядом с Ag/AgCl электродов ссылка снижается до ~ 70% средняя концентрация массового купания жидкости при отсутствии течения жидкости (рис. 3Б, внизу).
В нашем предыдущем исследовании Kir2.1 токи сообщалось облегчаться потока жидкости, восстановив convectively (увеличение) [K+] на входе канала10. Эта идея вытекает из явления, происходящие между купания жидкости и Ag/AgCl электродов, Kir2.1 канал может функционировать как K+ электрод как Ag/AgCl электродов функции как Cl– электрода. Эта идея схематично показана на рисунке 4A и 4B. Представитель пример жидкости упрощения потока индуцированной Kir2.1 токов показан на рисунке 4 c. Kir2.1 токи были вызвало гиперполяризирующий напряжения шаг от Холдинг потенциал 0 до -100 МВ в клетках крыс базофильная лейкемии (RBL). Применение жидкости (5 мл/мин или 0,004 m/s) легко увеличить Kir2.1 ток (рис. 4 c). Это посредничестве потока жидкости было ранее предложено быть посредничанным не клеточной сигнализации а электрохимических эффект конвективной перевозок ионов K+ unstirred пограничного слоя10.
Рисунок 1: схема показаны установки камеры купания для регулирования потока жидкости ионных каналов в записи патч зажим. Нижняя панель является вид сбоку (сагиттальное сечение) патч зажим камеры. Это кратко путь потока жидкости и местах исследованных клеток, электроды и входе/выходе жидкости. Потому что постоянно жидкость откачивается через отводной трубки методом всасывания, высота жидкости в камере поддерживается на относительно постоянном уровне. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Эффекты жидкости поток на L-типа напряжени тока зависимых Ca2 + канал (LVDCC) токов с и без агарозы 3 M мост KCl. VDCCЛ токи были записаны в ферментативно дисперсной крыса брыжеечных артериальной миоцитами с Нистатин перфорированные фиксации записи. Нормальный tyrode физиологический раствор соли с 4,2 мм ЭДТА без двухвалентной катионов был использован как купания решения11. Пипеткой раствора содержится CsCl, 140 мм; MgCl2, 1 мм; HEPES, 5 мм; EGTA 0,05 мм; с учетом pH 7.2 с CsOH. (A и B) С агарозы 3M KCl мост. (A) представитель, я-V отношения для тока VDCCL и эффекты потока жидкости. (Б) краткое изложение жидкости эффекты на I-V отношения токов VDCCЛ . (C и D) Без агарозы 3M KCl мост. (C) I-V отношения токов VDCCЛ . (D) кратко я-V отношения пик VDCCL токов в отсутствие и наличие потока жидкости. Формы напряжения шаги для выявления течений VDCCL показаны на рисунке врезные. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Эффекты потока жидкости на жидкий металл junction потенциальных между купания жидкости и Ag/AgCl ссылки электрода и оценки реальных концентрация Cl– в unstirred слое рядом электрод сравнения от перекрестка измеренные потенциал. () A представитель трассировки Джанкшен потенциальных изменений вследствие различных ставок потока жидкости (верхняя группа). Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации11. Отношения скорость потока жидкости потенциал Джанкшен (n = 5). (B) Верхняя панель: представитель запись Джанкшен потенциальных изменений из-за различных концентраций растворов NaCl. Нижняя панель: полулогарифмический участок перекрестка потенциал-[Cl–] отношения (n = 5). Прямая линия в красном представляет наиболее пригодный, изменение Уравнение Нернста для равновесной потенциала с уклоном десятикратный 49 mV. Благодаря конечных избирательность Na+, по сравнению с Cl-, для создания перекрестка жидкости/металл потенциал, значение уклона 49 mV, вместо 58 mV, производится лучше всего подходят в стыке потенциал-[Cl–] связь в зале Температура. 49-mV склона указывает Cl– зависимость (или избирательности) Ag/AgCl ссылка электрода > 95% над другими Ион (в данном случае, Na+), согласно уравнению напряжения Голдман-Ходжкина-Кац. Переход из 7 mV при Cl– концентрации 150 мм указывает на снижение ~ 30% Cl– концентрации. (C) A представитель трассировки Джанкшен потенциал в различных концентрациях растворов NaCl с использованием 3 M KCl агарозы мост (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: схема воздействия конвекции модель потока жидкости на концентрации ионов, прилегающих к открытым каналам во время текущего потока Ион. (A) при статических условиях с мало конвективной транспорт ионов в растворе с электрическим полем, ионов K+ потока через K+-селективный ионных каналов может привести к снижению концентрации K+ в прилегающих к microdomain входной канал. (B) жидкости convectively можно восстановить снижение концентрации K+ , прилегающих к входной канал. (C) влияние потока жидкости на токи канала Kir2.1 внутрь выпрямителя. Потока жидкости мгновенно увеличить Kir2.1 токи. Форма напряжения шага показан на рисунке врезные. Kir2.1 токи были записаны с помощью высоких K+-купание и - пипетки решений. Решение для купания: 148.4 мм KCl, 0,33 мм NaH2PO4, 5 мм HEPES, MgCl 0,5 мм2, 1.8 мм CaCl2, 11 мм D-глюкозы; с учетом рН 7,4 с NaOH. Пипетка решение: 135 мм KCl, 5 NaCl, 5 мм Mg-АТФ, 10 мм HEPES, 5 мм ЭГ бис (2-аминоэтил)-N, N, N', N',-tetraacetic кислота (EGTA), рН 7,2 (скорректировано с Кох). Так как RBL - 2H 3 клетки очень чувствительны к гипо осмотического припухлость и последующего триггера активации тома Cl– токи, сахароза 38 мм был добавлен в купать решение скорректировать для анализа осмолярности и предотвращения запуханием. Кроме того блокатор канала Cl– [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic кислота (прямые номера, 30 мкм)] был добавлен в пипетку решение для устранения любого загрязнения токами Cl– . Группа C была изменена с предыдущей публикации10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали метод измерения реальной концентрации Cl– в unstirred слой, прилегающий к Ag/AgCl электродов ссылку путем определения перекрестка жидкости металл потенциал с открытым патч зажим пипетки, заполнены с высокой KCl концентрация. Изменение концентрации Cl– в пограничном слое может привести к сдвиг Джанкшен потенциал при переключении от статических условиях потока жидкости. Просто с помощью агарозы KCl мост между электрод сравнения и жидкость для купания можно предотвратить ошибки, связанные с концентрация Cl– или артефакты во время записи патч зажим.
Кроме того, подчеркивая важность агар или агарозы соль мост, другое применение этого метода оценки реальная ионная концентрация в unstirred пограничном слое выглядит следующим образом. Потому что плазмалеммарного ионные каналы может функционировать как ионоселективные электроды (так же, как Ag/AgCl электродов функции как электрод Cl– ), реальная ионная концентрация в unstirred границы слоя рядом с канала впускного в клеточной мембраны поверхность может отличаться от средняя концентрация жидкости, сыпучих. Эта разница в концентрации ионов между основной жидкости и unstirred слой, прилегающий к клеточной мембраны является реальный сценарий под клинических параметров и следует отличать от биологических модуляции канала стробирования силой жидкости потока/сдвига. К сожалению в отличие от эффекта unstirred слой между Ag/AgCl электрод сравнения и жидкость для купания, мы не можем исправить эффект unstirred слоя, прилегающих к поверхности клеточной мембраны при изучении регулирование ионных каналов потока жидкости/сдвига силой.
Однако учитывая замечание, что реальная ионная концентрация в unstirred слое является примерно 70% в массовых жидкости (рис. 3), мы можем внести некоторые поправки в экспериментальные данные, отличить биологических модуляции ионных каналов от «электрохимический феномен эффекта unstirred слоя». Ожидается, что реальная ионная концентрация в unstirred слой на поверхности клеточной мембраны примерно 70% средняя концентрация массового купания решения в недавнее исследование10. Поскольку поток жидкости восстанавливается концентрации снижение ионов, облегчает текущий независимо от сотовых сигнализации10Kir2.1. В нашем предыдущем исследовании, был значительно высокой плотности тока (2,5 A / м2) с высокой внеклеточного K+ концентрации и высокая экспрессия Kir2.1 в RBL клеток10. Однако, в случае реальных клеточных мембран с различными ионного канала плотность тока амплитудой, эффект unstirred слоя на поверхности клеточной мембраны может во многом зависеть амплитуда ионного канала плотности тока. Кроме того это может вызвать некоторые Ион токов канала (особенно с относительно низких плотностях тока) быть регистра для регулирования потока жидкости; Хотя, эффект unstirred слоя регулируется электрохимически и не биологически. Таким образом это может повлиять на метод, описанный здесь. Таким образом возможность разработки количественный метод, который является адекватным для исправления экспериментальные результаты должны быть расследованы в будущих исследований.
На рисунке 3мы отмечено, что потенциал жидкость металлические соединения между Ag/AgCl электрод сравнения и жидкость для купания сильно зависит от состояния Ag/AgCl электродов. В самом деле когда Ag/AgCl электродов было прекрасно в состоянии, изменения в стыке потенциал из-за потока жидкости было минимальным (данные не показаны). Однако бедные хлорирования Ag/AgCl электродов вызвало большее смещение в стыке потенциал. Так как электрод сравнения Ag/AgCl очень восприимчив к различные внешние раздражители, такие как ультрафиолетового света и окислительного стресса, всегда рекомендуется использовать агар или агарозы KCl мост. Хотя изменения в стыке потенциал жидкости потока между купания жидкости и электрод сравнения является потенциальным источником ошибки, мы успешно оценены реальные Ион концентрации в unstirred пограничном слое измерения сдвига Джанкшен потенциал под различные жидкости-расхода (Рисунок 3А и 3Б).
Критической точки в шаге 4 для приготовления калибровочной кривой для оценки реальной концентрации Cl– в unstirred слоях границы от перехода перекрестка потенциала является, что калибровочной кривой должны регистрироваться под фактуры расхода (30 мл / мин в этом эксперименте). Хотя эта величина потока составляет очень быстро, в практических случаях быстрее жидкости, тем меньше падение концентрации находится в граничных слоев (рис. 3). Кроме того открытые пипеткой должны быть заполнены с высокой KCl, вместо решения регулярного пипетку, чтобы исследование патч зажим для предотвращения изменения в стыке потенциальных между пипетки и купания решения.
Поперечной силы в параметре патч клещи могут быть оценены следующие отношения11:
Τ = (6μQ) / (2bh) (уравнение 2)
Где: τ является напряжение сдвига (N/cm2); Μ -вязкости (0,001 N м/с2 для воды при температуре 20 ° C); Q — это скорость потока жидкости (м3/s); b -ширина камеры (м); и h высота камеры (м). Когда скорость потока жидкости 30 мл/мин, поперечная сила в зале патч, показанный на рисунке 1 оценивается в ~0.75 Дин/см2 согласно выше уравнения. Это уровень низкий сдвига силы по сравнению с физиологической поперечной силы; эндотелиальные клетки в кровеносные сосуды может подвергаться перерезывающих сил до 40 дин/см18,19. Таким образом условии, что ионные каналы не чувствительны к перерезывающих сил менее 0,75 Дин/см2, мы можем изучить чувствительность силы жидкости потока/сдвига ионных каналов после исключения эффекта unstirred пограничного слоя, установив условие управления до 0,75 Дин/см2. Однако некоторые ионных каналов, включая Kir2.1, кажется, быть чувствительным к перерезывающих сил менее 0,75 Дин/см2,3,4,5,6.
Эффект unstirred слоя был первоначально предложенный Барри коллег12,13,,14и15. Здесь мы предоставляем метод для оценки реальных ионная концентрация в unstirred слое путем измерения изменений в стыке потенциал с открытым патч зажим пипеткой. Мы также предположить, что этот эффект unstirred пограничного слоя может способствовать жидкости регулирования потока индуцированной ионного канала течений и следует рассматривать во время учебы жидкости потока mechanosensitivity ионных каналов. Однако основываясь на этой гипотезе, может спросил, почему некоторые ионного канала токи не чувствительны к жидкости регулирования потока зависимой если эффект unstirred пограничного слоя электрохимический, вместо того, чтобы биологического контроля. Как кратко рассмотрены выше это, вероятно, потому что только ионных токов через каналы с большим достаточно одноканальный проводимости и долго достаточно открыть время может быть облегчено потока жидкости. То есть для создания unstirred слоя, в котором концентрация ионов отличается от среднего в растворе оптом, потока в фазе мембраны должны быть достаточно быстрым по сравнению с что в водной фазе14. Недавно мы предложили, что ток через Kir2.1 каналы, чьи проводимости и открытое время достаточно высоки, облегчается поток жидкости через механизмы конвективной восстановления концентрации ионов в unstirred слое границы мембраны клеток поверхности11.
В заключение мы представляем метод для измерения концентрации ионов в unstirred пограничный слой, прилегающий к поверхности электрода и клеточной мембраны ссылку с открытым патч зажим пипеткой. Кроме того, подчеркивая важность агарозы KCl мост, этот метод также предоставляет способ учета эффекта unstirred слоя при интерпретации регулятор потока жидкости/сдвига ионных каналов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано пионер исследовательский центр программы (2011-0027921), основными программами исследований науки (2015R1C1A1A02036887 и СР 2016R1A2B4014795) через Национальный исследовательский фонд Кореи финансируется министерством науки, ИКТ & Будущее планирование и Грант Кореи медицинских технологий R и D проекта через Корея здравоохранения Институт развития индустрии (ХИДИ), финансируемая министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
