Summary
Mechanosensitive iyon kanalları kez yama-kelepçe kaydı ile sıvı akışı/makaslama kuvvet duyarlılık açısından incelenmektedir. Ancak, Deneysel protokol bağlı olarak, sonuç sıvı akışı-düzenlemelerin iyon kanalları üzerinde hatalı olabilir. Burada, önlenmesi ve teorik bir temel ile bu tür hataları düzeltmek için yöntemleri sağlar.
Abstract
Sıvı akış sıvı akış kaynaklı vazodilatasyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçleri denetleyen önemli bir çevresel uyarıcı olduğunu. Her ne kadar biyolojik yanıtları sıvı akışı/kesme kuvvetleri için moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değil, iyon kanal perdeleme sıvı akışı aracılı Yönetmeliğin eleştirel katkıda bulunabilir. Bu nedenle, sıvı akışı/kesme kuvvetleri duyarlılık iyon kanallarının yama-klemp tekniği kullanarak çalışılmıştır. Ancak, sonuçları ve yorumunu veri bağlı olarak Deneysel protokol, hatalı olabilir. Burada, deneysel ve teorik kanıt sıvı akışı ile ilgili hatalar için mevcut ve tahmin etme, önleme ve bu hataları düzeltmek için yöntemleri sağlar. Junction Ag/AgCl referans elektrot ve banyo sıvı arasında potansiyel değişiklikleri ile 3 M KCl. sıvı akış olabilir dolu bir açık pipet ile ölçüldü sonra sıvı/metal Kavşağı yaklaşık 7 için potansiyel mV vardiya. Diğer taraftan, sıvı akış tarafından indüklenen gerilim shift ölçerek, biz iyonu konsantrasyonu unstirred sınır tabaka içinde tahmini. Statik durumda gerçek iyon konsantrasyonlarının Ag/AgCl referans elektrot veya iyon kanal giriş hücre membran yüzeyinde bitişik olarak yaklaşık % 30 bu akışı koşulu düşük olarak ulaşabilirsiniz. Bir özel 3 M yerleştirerek banyo sıvı ve referans elektrot arasında KCl köprü Kavşağı potansiyel değişen bu sorunu engellemiş olabilir. Ancak, hücre zarının yüzeye bitişik unstirred Katman efektini bu şekilde sabit değil. Burada, biz sıvı akış kaynaklı Yönetmeliğin iyon akıntılarının okurken bir özel tuz-köprü kullanmanın önemini vurgulayan bir açık yama-kelepçe pipet ile unstirred sınır tabaka konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu nedenle, dikkate unstirred sınır tabaka iyonu gerçek konsantrasyonları alır, bu roman yaklaşım deneysel tasarım ve iyon kanalları sıvı kesme stres düzenlenmesi ile ilgili veri yorumu yararlı bilgiler sağlayabilir .
Introduction
Sıvı akış sıvı akış kaynaklı vazodilatasyon ve sıvı kesme kuvvetleri bağımlı vasküler remodeling ve geliştirme1,2gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçler denetleyen önemli bir çevresel işaretimiz, 3,4,5. Her ne kadar biyolojik yanıtları sıvı akış kesme kuvvetleri için moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değil, bu iyon kanal perdeleme sıvı akışı aracılı Yönetmeliğin eleştirel sıvı akış kaynaklı yanıt-e doğru5 ' e katkıda bulunabilir inanılıyor , 6 , 7 , 8. Örneğin, endotel içe doğrultucu Kir2.1 ve Ca2 +aktivasyonu-aktif K+ (KCa2.3, KCNN3) kanalları Ca2 + akını sıvı akış tarafından sıvı için katkıda bulunmak için önerilen sonra akış kaynaklı vazodilatasyon6,7,8. Bu nedenle, birçok iyon kanalları, sıvı akışı/kesme kuvvetleri duyarlılık yama-klemp tekniği6,9,10 ile açısından okudu kanal, özellikle mekanik aktif veya - Inhibe , 11. ancak, yama kayıt tipi kelepçe sırasında gerçekleştirilen Deneysel protokol bağlı olarak sonuçları ve iyon kanallarının sıvı akışı mevzuatı hakkında veri yorumlanması hatalı10,11olabilir.
Bir sıvı akış kaynaklı eserler içinde yama-kelepçe yazmak banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot11arasında potansiyel kavşak üzerinden kaynağıdır. Bu genellikle banyo sıvı Cl- konsantrasyonu sabit tutulması gibi sıvı/metal kavşak banyo sıvı ve Ag/AgCl elektrot arasında potansiyel banyo çözüm arasında kimyasal karşılık göz önünde bulundurarak sürekli inanılıyor ve Ag/AgCl elektrot olmak:
AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (denklem 1)
Ancak, Cl- konsantrasyonu Ag/AgCl bitişik banyo sıvısının nerede genel olarak elektrokimyasal reaksiyon banyo çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot (denklem 1) arasında soldan sağa doğru devam eder bir durumda, başvuru yeterli convectional ulaşım sağlanmaktadır sürece elektrot (unstirred sınır tabaka12,13,14,15) çok bu çözüm, banyo toplu olarak daha düşük olabilir. Ag yetersiz klorlama ile bir eski veya ideal olmayan Ag/AgCl elektrot kullanarak böyle bir risk artabilir. Bu sıvı akışı ile ilgili yapı, referans elektrodu, aslında, sadece banyo sıvı ile başvuru geleneksel bir özel-tuz Köprüsü yanında duvar ilanı hariç olmak objeyi gerçek Cl- içinde değişiklikler temel bu yana elektrot, konsantrasyon Ag/AgCl elektrot11' e bitişik. Bu çalışmada sunulan protokolü bağlantı akışı ile ilgili olası değişiklikleri önlemek ve unstirred sınır tabaka konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek nasıl açıklar.
Bir özel banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında KCl köprü koyduktan sonra düşünülmesi gereken bir diğer önemli faktör var: sadece referans olarak Ag/AgCl elektrot Cl- elektrot gibi davranır, iyon kanalları da işlev görebilir bir iyon-seçici elektrot gibi. Banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında unstirred bir sınır tabaka durumun iyonların hareketi sırasında membran iyon kanalları yoluyla ekstraselüler ve hücre içi çözüm arasında ortaya çıkar. Bu iyon Yönetmeliği yorumlama tarafından sıvı akış kanalları zaman dikkatli kullanılmalıdır anlamına gelir. Bizim önceki çalışma11' de tartııldıı gibi bir elektrokimyasal gradyan mevcut çözüm iyonların hareketi üç farklı mekanizma ile ortaya çıkabilir: difüzyon, geçiş ve konveksiyon, difüzyon hareketi nerede konsantrasyon gradyanı tarafından indüklenen, geçiş hareketi elektrik degrade tarafından tahrik olur ve konveksiyon yoluyla sıvı akış hareketidir. Bu üç taşıma mekanizmaları arasında konveksiyon modu çoğu iyonları11 (> 1000 kere difüzyon veya geçiş her zamanki yama-kelepçe ayarlar altında daha büyük) hareketine katkıda bulunur. Neden kavşak banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında potansiyel çok farklı statik ve sıvı akış koşulları11altında bu teorik temelini oluşturur.
Yukarıda önerilen hipotez başı olarak, sıvı akış facilitatory bazı etkileri iyon kanal geçerli gerçek iyon konsantrasyonu (unstirred sınır tabaka) membran yüzey kanal girişi için bitişik konvektif restorasyonu dan anlaşılmaktadır 10. Bu durumda, iyon kanal akımları akış kaynaklı sıvı etkisi sadece elektrokimyasal olaylardan değil yönetmelik iyon kanal perdeleme dan çıkmıştır. Benzer bir fikir titiz teorik hususlar ve deneysel kanıt, olarak da bilinen unstirred katman göre Barry ve meslektaşları12,13,14,15 tarafından daha önce önerilen veya taşıma sayı etkisi. Bazı iyon kanalları yeterli varsa tek kanal gürültülerinden ve yeterli taşıma kanallardan (zarda unstirred membran yüzey bir daha hızlı aktarım hızı), bir sınır tabaka etkisi oranları sağlamak için yeterince uzun açık zaman ortaya çıkabilir . Böylece, konveksiyon bağımlı taşıma Ion geçerli10,12,13,14,15nihai sıvı akışı bağlı merkezler için katkıda bulunabilir.
Bu çalışmada, biz bir agar veya özel kullanmanın önemini vurgulamak tuz-köprü sıvı akışı bağlı yönetmelik iyon akıntılarının eğitim sırasında. Biz de unstirred sınır tabaka Ag/AgCl referans elektrot ve membran iyon kanalları için bitişik konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca, sıvı akış kaynaklı modülasyon iyon kanal akımlarının (Yani, konveksiyon hipotez veya unstirred katman taşıma sayı etkisi) teorik yorumlanması tasarlama ve üzerinde çalışmalar yorumlama için değerli bilgiler sağlayabilir kesme kuvvetleri-düzenlenmesi iyon kanalları. Unstirred sınır tabaka taşıma sayı etkisi göre biz iyon kanal akımları yoluyla membran iyon kanalları her türlü akışkan akışı, bağımsız olarak sıvı akış kesme kuvvetleri, ama sadece onların biyolojik duyarlılık tarafından Eğer kolaylaştırılabilir olduğunu tahmin iyon kanalları yeterli tek kanal gürültülerinden ve uzun açık-zaman var. Daha yüksek iyon kanal akım yoğunluğu hücre membran yüzeyinde unstirred sınır tabaka etkisi artabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Konkuk Üniversitesi Kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. özel tuz banyosu çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot arasında köprü
Not: Özel 3M KCl tuz köprüleri daha önce üretilen12 küçük farklılıklar nedeniyle nitelendirdi.
- Köprüler oluşumu
- U şekli uygun oluşturmak için yangın cam kılcal tüpler viraj. Kılcal iç çapı büyük iyon akımlarını kaydederken serisi direnci azaltmak için yeterince büyük olmalıdır. 2-5 mm bir iç çapı ile tüplerin genellikle kabul edilir.
- Özel 3 M KCl çözüm hazırlanması
- 100 mL 3 M KCl çözeltisi hazırlamak (1 M veya 2 M da kabul edilir).
- Özel 3 g ağırlığında.
- 90 ile 100 ° c arasında sıcak tabakta KCl (Yani, % 3 özel) 100 ml özel dağıtılması
- Köprüler ile 3 M KCl özel yükleme
- Kolay yükleme için U şeklinde cam köprü özel-KCl çözelti içinde bırakın.
Not: Özel-KCl çözüm sığ ve geniş bir kapta içeriyorsa doğruAksi durumda, cam köprü kazmak kolaydır. - Gece için ayarla ve sertleşmesine özel (RT) Oda sıcaklığında kalsın.
- Dikkatle set/sertleştirilmiş özel-tuz özel KCl yüklü cam köprülerden kazmak.
- Kolay yükleme için U şeklinde cam köprü özel-KCl çözelti içinde bırakın.
- Köprüleri depolamak
- Yeterli hacim hazırlamak (Yani, 500 mL) 3 M KCl çözüm geniş boyunlu şişe.
- Hazırlanan özel-tuz köprüleri şişe bir buzdolabında saklayın.
2. yama sıkma odası bulunan hücrelere sıvı akış kesme kuvvet uygulanması
Not: Yama-kelepçe deneysel set-up bir Şematik diyagramı Şekil 1' de gösterilen.
- Bir konteyner yüklü çözüm banyo ile yer (birim ve yükseklik zaten var olmak ölçü) yama-kelepçe odası yukarıda.
- Yama-kelepçe odası tüp suctioning tarafından banyo çözüm ile doldurun.
- Sıvı akışını durdurmak için tüp sıvı akışını engellemek için kapsayıcının tarafında küçük, sonra tüp emici aynı zamanda durdurmak için emme tarafında küçük. Bu "sabit" Denetim durumdur.
- Sıvı akış kesme kuvvet uygulamak için aynı anda her iki tüpler konteyner ve emme tarafında açık.
- Daha önce ya da sıvı akış kesme kuvvetleri hücreye uygulandıktan sonra debi mL/dak ölçmek.
- Belirli bir zaman içinde sıvı hacmindeki azalma ölçerek akış oranını hesaplamak.
- Ölçülen debi ve banyo odası (yapısı) geometrisini, sıvı akış tarafından hücreye uygulanan kesme Kuvvetleri (tartışma bölümüne bakın) tahmini.
- Alternatif olarak, akış hızı (için adımları 2.3-2.6) denetlemek için bir perfüzyon pompa kullanın. Bu durumda, pulsatil bir akış yerine bir sabit emin olmak için dikkatli olun.
3. ölçme likit Metal kavşak potansiyel banyo çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot (Şekil 3A) arasında sıvı akışı tarafından değişimler
- Ag/AgCl elektrot veya hazır ürünler, özel tuz Köprüsü olmadan kullanılabilir Pelet kullanın.
- Normal bir fizyolojik tuzlu tuz banyo odası (Örneğin, 143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 11 mM D-glikoz; pH 7.4 NaOH ile düzeltilmiş) için hazır olun.
- Bir yama pipet pipet ve banyo çözümleri arasındaki kavşak potansiyel kayma en aza indirmek için odasında 3 M KCl solüsyon içeren yerleştirin.
- Geçerli kelepçe moduna gerilim tipi kelepçe amplifikatör tamir ("Ben = 0" veya "Bilgi").
- İlk ofset potansiyel bozarak sonra çeşitli akış oranları tarafından indüklenen gerilim içinde değişiklikleri ölçmek.
- Voltaj değişiklikleri sıvı/metal kavşak potansiyelleri olduğunu doğrulamak için sıvı akış etkisi kavşak potansiyel banyo çözüm Ag/AgCl elektrot ile özel-tuz Köprüsü kullanarak yeniden inceleyin.
4. deneysel tahmini gerçek Cl- konsantrasyon Unstirred katmanında bitişik Ag/AgCl elektrot altında statik durum (3B rakam)
- Adım 3 sonuçlarından kavşak potansiyel debi ilişkileri çizmek ve kavşak potansiyel shift tarafından supra-sıvı akış hızı (doyurarak) en büyük değerini tahmin etmek.
- Cl çeşitli konsantrasyonları ile çözümler hazırlamak (yani, 50, 99, 147, 195 ve 288 mM NaCl).
- Cl- konsantrasyonu banyo sıvı değiştirerek kavşak potansiyel-[Cl-] ilişki çizin. Sıvı oranı sürekli ve yeterince yüksek olması unutmayın (> 30 mL / Cl- konsantrasyonu bitişik Ag/AgCl referans elektrot olan için azalma önlemek için min).
- İki ilişki eğriler Cl- konsantrasyonu ölçülen kavşak potansiyel shift üzerinden değişiklikleri tahmin etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bütün hücre voltaj bağımlı L tipi Ca2 + kanal (VDCCM) akımları enzimatik dağınık sıçan mezenterik arteryel miyositler, yukarıda açıklanan11kaydedildi. Arteryel miyositler bir çözümle Cs-zengin pipet nistatin delikli yapılandırma altında VDCCL11,16ile geçerli akışı kolaylaştırmak için divalent katyon ücretsiz banyo solüsyonu ile diyaliz. Gerilim rampalar depolarize veya voltaj adımları,-70 holding potansiyelini kısa mV, VDCCL akımları temin için uygulandı. Bir temsilci akım-gerilim (ı-V) VDCCL sıvı akış (5 mL/dak veya yaklaşık 0,004 m/s), bir özel KCl Köprüsü, kaydedilen varlığı ve yokluğu ilişkisi Şekil 2Agösterilir. Sıvı akış biraz VDCCL bir gerilim bağımsız şekilde geçerli arttı. Bu kolaylaştırıcı etkisi sıvı akış VDCCL geçerli Şekil 2Bözetlenir.
VDCCL tarafından sıvı akış geçerli gerilim bağımsız kolaylaştırma sıvı veya kesme kuvvetleri için VDCCL bir doğru yanıttır. 5 mL/dak veya yaklaşık 0,004 m/s geçerli deneysel kurulumunda sıvı akışının yaklaşık 0.1 dyn/cm2 kesme kuvveti açısından temsil etmek için tahmin edilmiştir (konuya bakın). Ag/AgCl başvuruda bulunacağınız zaman ancak, elektrot doğrudan bir özel KCl Köprüsü, ı-V ilişki sıvı akış bu statik altında VDCCL akıntılarının göre sağa kaydırılır huzurunda olmadan banyo sıvı bağlı yapıldı. koşul (Şekil 2C ve 2D). Bu VDCCL negatif gerilim geçerli inhibisyonu ve VDCCL daha fazla depolarized veya olumlu potansiyeller geçerli kolaylaştırma sonuçlandı. Bu sıvı akış kaynaklı artifakı içinde ı-V ilişkisinin bir gerilim kayma kanal perdeleme değişiklik nedeniyle değildi ama aslında banyo sıvı ve Ag/AgCl arasındaki bir kavşak potansiyel kayma nedeniyle oldu yama-kelepçe yazmak örneğidir Elektrot11başvuru. Sıvı akış kaynaklı birleşim potansiyel vardiya için doğrudan kanıt Şekil 3' te gösterilmiştir.
Kavşak potansiyel vardiya adım 3 göre ölçüldü. Belgili tanımlık değişmek, sıvı akış nedeniyle 3 M KCl, yukarıda açıklanan11olarak dolu açık bir pipet kullanılarak ölçüldü. 3 M KCl ile dolu bir açık pipet ile kavşak pipet ve banyo çözümleri arasında potansiyel minimize edilebilir ve sıvı akış nedeniyle olası değişiklikleri öncelikle banyo çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot idi. Bir özel 3 M KCl banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında köprü, sıvı akış potansiyel birleşme sıvı ve Ag/AgCl elektrot arasında bir sıvı akış hızı bağımlı şekilde (Şekil 3A) kaymıştır. En fazla bağlantı olası değişiklik ~ 7 olmak yaygınlaştırılması (Şekil 3A, alt) Kavşağı potansiyel-sıvı akışı ilişkisinden mV. Buna ek olarak, ne zaman özel 3 M KCl köprü kullanıldı, sıvı akış değiştirmemesi Kavşağı arasında banyo sıvı ve referans elektrot potansiyel ( Şekil 3Aalt grafikte özetlenen, alt).
Hangi yeterli konveksiyon eylem kipleri fonksiyonel, statik ve sıvı akışı koşulları arasındaki farklar konsantrasyon ölçmek için biz Cl- konsantrasyonları banyo sıvı-Ag/AgCl elektrot üzerinde değiştirme etkisini inceledi kavşak adım 4 göre potansiyel. Cl- konsantrasyonu artan kaymıştır bir konsantrasyon bağımlı şekilde potansiyel birleşme (Şekil 3B, üst) sadece sıvı akış hızı bağımlı bir şekilde potansiyel birleşme kaymıştır. KCl özel Bridge'i kullanarak, kavşak potansiyel bir Cl- konsantrasyonu bağlı şekilde (Şekil 3 c), kavşak olası değişikliği banyo çözüm ve referans elektrot arasında meydana geldiğini belirten değiştirmesini engelledi, değil banyo ve pipet çözümleri arasında. Kavşak potansiyel-[Cl-] ilişkinin yarı oturum Arsa Şekil 3Balt panelinde gösterilir. 3B rakam, ~ 7 kavşak potansiyel vardiya ( Şekil 3A) mV öneriyor Cl- konsantrasyonu Ag/AgCl referans elektrot için bitişik ~ %70 azalır ekstrapole maksimal değeri içinde sonuçlarına göre sıvı akış eksik olduğunda Sıvı banyo toplu (Şekil 3B, alt) ortalama konsantrasyon.
Bizim önceki çalışmada, Kir2.1 akımlar tarafından sıvı akış convectively (artan) [K+] Kanal giriş10geri yükleyerek kolaylaştırılmış olacak rapor edilmiştir. Kir2.1 kanal Ag/AgCl elektrot işlevi görür bir Cl- elektrot gibi bir K+ elektrot gibi davranabilir gibi banyo sıvı ve Ag/AgCl elektrot, arasında meydana gelen olayları bu fikri kaynaklanmaktadır. Bu fikir şematik Şekil 4A ve 4Bgösterilmektedir. Sıvı akış kaynaklı kolaylaştırma Kir2.1 akıntılarının temsil edici bir örnek Şekil 4 cgösterilir. Kir2.1 akımlar tarafından bir hyperpolarizing gerilim adımından holding potansiyel 0 -100 için elde edildi fare bazofilik lösemi (RBL) hücrelerdeki mV. Sıvı akış (5 mL/dak veya 0,004 m/s) uygulanması kolayca Kir2.1 akım (Şekil 4 c) arttı. Bu kolaylaştırma sıvı akış tarafından daha önce hücresel sinyal tarafından değil ama unstirred sınır tabaka10K+ iyonların konvektif Ulaştırma elektrokimyasal etkisi tarafından aracılı için önerilmiştir.
Şekil 1: şematik sıvı akış düzenleme iyon kanalları, banyo odası kurulumu yama-kelepçe yazmak içinde gösteren. Yama-kelepçe odası yan görünüm (sagittal bölümü) alt paneldir. Sıvı akış yolunu ve okudu bir hücre, elektrotlar ve giriş/çıkış sıvının konumları özetler. Çünkü sıvı sürekli dışarı çıkış tüpten emme tarafından pompalanır, odasında sıvı yüksekliği nispeten sabit bir seviyede tutulur. Bu rakam bir önceki yayın11değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Sıvı etkileri KCl Köprüsü üzerinde L-tipi voltaj bağımlı Ca2 + kanal (VDCCM) akımları ve özel 3 M olmayan akışı. VDCCL akımları enzimatik dağınık sıçan mezenterik arteryel miyositler nistatin delikli yama-kelepçe kaydı ile kaydedildi. Normal tyrode fizyolojik tuz solüsyonu divalent katyonlar olmadan 4.2 mM EDTA ile banyo çözüm11kullanıldı. Pipet çözüm CsCl, 140 mM bulunan; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; EGTA 0.05 mM; pH 7.2 ile CsOH göre düzeltilir. (A ve B) Özel 3M ile KCl-köprü. (A) temsilcisi ben-V için bir ilişki VDCCL akım ve sıvı akış etkileri. (B) ı-V ilişki VDCCL akıntılarının sıvı etkilerinin Özeti. (C ve D) Özel 3M KCl köprü. (C) ı-V ilişkileri VDCCL akıntılarının. (D) devamsızlık ve sıvı akış varlığı ben-V ilişkileri en yüksek VDCCL akımlarının özetlenebilir. VDCCL akımları alabilme gerilim adımlar şekilleri şekil iç metin gösterilir. Bu rakam bir önceki yayın11değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Sıvı akış etkileri likit metal bölgede banyo sıvı ve Ag/AgCl arasında potansiyel referans elektrot ve tahmini gerçek Cl- konsantrasyon unstirred katmanı ölçülen Kavşağı referans elektrot bitişik potansiyel. Kavşak olası değişiklikler nedeniyle sıvı akış (üst paneli) çeşitli oranlarda (a) A temsilcisi izlemeyi. Bu rakam bir önceki yayın11değiştirildi. Kavşak potansiyel-sıvı akış hızı ilişki (n = 5). (B) üst paneli: temsilcisi kayıt kavşak potansiyel değişiklikleri NaCl çözümler çeşitli konsantrasyonları nedeniyle. Alt paneli: kavşak potansiyel-[Cl-] ilişkinin yarı oturum Arsa (n = 5). Kırmızı düz çizgide tarafından değiştirilmiş Nernst denklemi denge 49 panolarında bir eğim ile potansiyel için en uygun temsil eden mV. Na+, Cl-, potansiyel, sıvı/metal kavşak oluşturmak için kıyasla sonlu seçicilik 49 eğim değeri nedeniyle mV, 58 yerine mV, üretilen kavşak potansiyel-[Cl-] ilişki odasında en uygun sıcaklık. 49-mV yamaç Cl- bağımlılığı (veya seçicilik) Ag/AgCl referans elektrot > %95 diğer iyon (Bu durumda, Na+) üzerinden, Goldman-Hodgkin-Katz gerilim denklem göre gösterir. 7 bir kayma mV 150 mM Cl- konsantrasyonu, Cl- konsantrasyonu ~ %30 bir düşüş gösterir. (C) A temsilcisi izleme kavşak potansiyel 3 M KCl özel köprü kullanımı ile NaCl çözümleri çeşitli konsantrasyonlarda (n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: iyon geçerli akı sırasında açık kanallara bitişik iyon konsantrasyonlarının sıvı akışının konveksiyon modelinin etkilerinin şematik. (A) altında statik koşullarla küçük konvektif taşıma iyonlar elektriksel alan ile çözümde, K+ iyon akı K+-seçici iyon kanalları microdomain bitişik içinde K+ konsantrasyonları azalmasına neden olabilir Kanal giriş. (B) sıvı akış convectively K+ konsantrasyon açık kanal koya bitişik azalma geri yükleyebilirsiniz. (C) içe doğrultucu Kir2.1 kanal akımları üzerine sıvı akış etkisi. Sıvı akış anında Kir2.1 akımları artmış. Gerilim adım şeklinde şekil iç metin gösterilir. Kir2.1 akımları yüksek K+kullanarak kaydedildi-banyo ve - pipet çözümler. Çözüm banyo: 148.4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 11 mM D-glikoz; pH 7.4 NaOH ile göre düzeltilir. Pipet çözüm: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM ethyleneglycol-bis (2-aminoethyl)-N, N, N', N',-tetraacetic asit (EGTA), pH 7.2 (KOH ile ayarlanabilir). RBL - 2 H 3 hücreleri hipo-ozmotik şişlik için son derece duyarlı ve ses-harekete geçirmek CL- akımları, 38 mM sükroz sonucu tetikleyici Osmolarite için ayarlamak ve hücre şişme önlemek için banyo çözüm eklenen beri. Ayrıca, bir Cl- kanal engelleyici [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic asit (DIDS, 30 µM)] herhangi bir kirlenme ortadan kaldırmak için pipet çözüm Cl- akımlar tarafından eklendi. Paneli C bir önceki yayın10' dan değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz gerçek Cl- konsantrasyonu Ag/AgCl referans elektrot için bitişik unstirred katmanındaki bir yüksek KCl ile dolu bir açık yama-kelepçe pipet ile likit metal kavşak potansiyel belirlenerek ölçmek için bir yöntem gösterdi konsantrasyon. Sınır tabaka Cl- konsantrasyon değişikliği kavşak potansiyel bir vardiyada statik sıvı akış koşulları için geçiş yaparken neden olabilir. Sadece bir özel banyo sıvı ve referans elektrot arasında KCl köprü kullanarak Cl- konsantrasyonu ile ilgili hatalar veya eserler yama-kelepçe kayıt sırasında önleyebilirsiniz.
Agar veya özel bir tuz Köprüsü önemini vurgulayan yanı sıra, bu yöntemin gerçek iyonu konsantrasyonu unstirred sınır tabaka içinde tahmin etme, başka bir uygulama aşağıdaki gibidir. Plasmalemmal iyon kanalları unstirred sınır içinde gerçek iyonu konsantrasyonu (Ag/AgCl elektrot gibi işlevleri Cl- elektrot) gibi iyon-seçici elektrot olarak işlev görebilir çünkü bitişik hücre zarı kanal girişi için katman yüzey toplu sıvı konsantrasyon ortalama farklı olabilir. Bu fark iyonu konsantrasyonu arasında toplu sıvı ve unstirred katman hücre zarı için bitişik klinik ayarları'nın altında gerçek bir senaryodur ve kanal sıvı akışı/makaslama zorla perdeleme biyolojik modülasyon dan ayırt edici olmalıdır. Ne yazık ki, Ag/AgCl referans elektrot ve banyo sıvı arasında unstirred Katman efektini, biz hücre membran yüzeyine bitişik unstirred Katman efektini düzenleme iyon kanalları, sıvı akışı/makaslama zorla okurken tamir edemiyorum.
Ancak, gözlem unstirred katmanında gerçek iyonu konsantrasyonu yaklaşık % 70'i bu toplu sıvı (Şekil 3) olduğunu göz önüne alındığında, biz bazı değişiklikler biyolojik modülasyon iyon kanalları ayırmak için deneysel veriler yapabilirsiniz "elektrokimyasal olgusu unstirred Katman efektini". Gerçek iyonu konsantrasyonu hücre membran yüzeyinde unstirred katmanındaki bir son çalışmada10çözümde banyo toplu ortalama konsantrasyon yaklaşık % 70'i olmak bekleniyordu. Sıvı akış azalmış iyonu konsantrasyonu geri beri10sinyal cep bağımsız olarak geçerli Kir2.1 kolaylaştırdı. Bizim önceki çalışmada, akım yoğunluğu oldukça yüksek (2,5 A / m2) yüksek hücre dışı K+ ile konsantrasyon ve Kir2.1 RBL içinde yüksek ifade hücreleri10. Ancak, çeşitli iyon kanal akım yoğunluğu genlikleri ile gerçek hücre zarlarında durumunda hücre membran yüzeyinde unstirred katman etkisi büyük ölçüde iyon kanal akım yoğunluğu genliği bağlı olabilir. Ayrıca, bu bazı iyon kanal akımları (özellikle de nispeten daha düşük akım yoğunluğu ile) sıvı akış düzenleme için büyük küçük harf duyarlı olmak neden olabilir; Her ne kadar unstirred Katman efektini mamüllerinin ve değil biyolojik olarak düzenlenmiştir. Böylece, bu burada açıklanan tekniği etkileyebilir. Bu nedenle, deneysel sonuçlar düzeltme olmalıdır için yeterli bir nicel Yöntem geliştirme olasılığı gelecekte çalışmalar araştırıldı.
Şekil 3' te, likit metal kavşak potansiyel Ag/AgCl referans elektrot ve banyo sıvı arasında büyük ölçüde Ag/AgCl elektrot koşula bağlı görülmektedir. Aslında, Ag/AgCl elektrot mükemmel durumda, değişiklikleri nedeniyle sıvı akış potansiyel Junction oldu (en düşük düzeyde veri gösterilmez). Ancak, zavallı klorlama Ag/AgCl elektrot potansiyel Kavşağı'nda büyük bir kayma neden oldu. Ag/AgCl referans elektrot ultraviyole ışık ve oksidatif stres gibi çeşitli dış uyaranlara çok duyarlı olduğundan bir agar veya özel KCl köprü kullanarak her zaman tavsiye edilir. Her ne kadar arasında kavşak potansiyel sıvı tarafından değişiklikleri akış sıvı ve referans elektrot banyo hata potansiyel kaynağıdır, biz başarıyla kavşak kayması ölçerek unstirred sınır tabaka gerçek iyon konsantrasyonlarda tahmini potansiyel çeşitli sıvı akış oranları (Şekil 3A ve 3B) altında.
Kritik nokta için shift unstirred sınır katmanlardan gerçek Cl- konsantrasyon kavşak potansiyel tahmini standart eğri altında yeterli bir debi kaydedilmesi gereken standart eğri hazırlanması için adım 4'te (30 mL / Bu deneyde dk). Bu akış hızı çok hızlı olmasına rağmen pratik durumlarda daha hızlı, daha küçük konsantrasyon açılan sınır katmanları (Şekil 3) sıvıdır. Ayrıca, açık pipet Junction bir pipet ve çözüm banyo arasında olası değişikliği engellemek bir yama-kelepçe çalışma amacıyla bir düzenli pipet çözüm yerine yüksek KCl ile doldurulması gerekir.
Yama-kelepçe ayar kesme yürürlükte aşağıdaki ilişki11tahmin edilebilir:
τ = (6μQ) / (bh2) (denklem 2)
: Nerede τ kesme stres (N/cm2); μ olduğunu viskozitesi (0,001 N m/s2 için su 20 ° c); Sıvı akış hızı (m3/s); Q olduğunu b Oda genişliği (m);. ve h odası yüksekliği (m). Sıvı akış hızı 30 mL/dk olduğunda, Şekil 1 ' de gösterilen yama odasında kesme kuvvetleri ~0.75 dyn/cm2 göre yukarıdaki denklem olduğu tahmin edilmektedir. Bu fizyolojik kesme kuvvetleri ile karşılaştırıldığında bir düşük kesme kuvvetleri düzeyidir; endotel hücreleri kan damarlarında kuvvetleri 40 dyn/cm18,19yamultmak için tabi. Şartıyla iyon kanallarını güçler daha az 0,75 dyn/cm2yamultmak için duyarlı değildir, bu nedenle, biz iyon kanalları sıvı akışı/kesme kuvvetleri duyarlılığını kontrol koşulunu ayarlayarak unstirred sınır tabaka etkisi hariç sonra eğitim görebilirsiniz 0,75 dyn/cm2' ye. Ancak, Kir2.1, dahil olmak üzere bazı iyon kanalları kuvvetleri daha az 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6yamultmak için duyarlı olmak gibi görünüyor.
Unstirred Katman efektini Aslında Barry ve meslektaşları12,13,14,15tarafından önerildi. Burada, biz açık yama-kelepçe pipet ile kavşak potansiyel değişiklikleri ölçerek unstirred tabakasında gerçek iyonu konsantrasyonu tahmin etmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca bu unstirred sınır tabaka etkisi sıvı akış kaynaklı Yönetmeliğin iyon kanal akımlarının için katkıda bulunabilir ve sıvı akışı-mechanosensitivity iyon kanallarının okurken kabul öneririz. Ancak, bu varsayımı üzerinde bağlı olarak, bu neden bazı iyon kanal akımları biyolojik mücadele yerine unstirred sınır tabaka etkisi bir elektrokimyasal ise sıvı akışı bağlı Yönetmeliğin için duyarlı değildir istenebilir. Kısaca ele alınmış yukarıda olarak, çünkü sadece iyon akımları yoluyla kanalları ile büyük yeterli tek kanallı gürültülerinden ve uzun yeterince açık zaman sıvı akış tarafından kolaylaştırılabilir çalışmanızdır. Diğer bir deyişle, iyonu konsantrasyonu toplu bir çözüm ortalama farklı olduğu unstirred katman kurulması için yeterince hızlı için sulu faz14karşılaştırılması gereken membran aşamasında akı. Yakın zamanda geçerli olan gürültülerinden ve açık zaman yeterince yüksek, Kir2.1 kanallardan konvektif iyonu konsantrasyonu unstirred sınır tabakası içinde restorasyonu için sıvı akış yoluyla mekanizmaları tarafından yönetilir sürmüşlerdir hücre membran yüzey11.
Sonuç olarak, biz iyonu konsantrasyonu unstirred sınır tabaka referans elektrot ve hücre membran yüzeyine bir açık yama-kelepçe pipet ile bitişik olarak ölçmek için bir yöntem mevcut. Bir özel KCl köprü önemini vurgulayan yanı sıra, bu yöntem aynı zamanda sıvı akışı/kesme kuvvetleri kontrol iyon kanallarının yorumlama unstirred Katman efektini için hesap için bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma öncü araştırma merkezi programı (2011-0027921), tarafından temel bilim araştırma programlarını (2015R1C1A1A02036887 ve NATO Mukabele Gücü-2016R1A2B4014795) Ulusal Araştırma Vakfı Bilim Bakanlığı tarafından ICT finanse Kore tarafından desteklenmiştir & Gelecek planlama ve Kore sağlık teknoloji R & D proje Kore Sağlık Sanayi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla verilmesi tarafından finanse edilen Sağlık Bakanlığı & refah, Kore Cumhuriyeti (HI15C1540) tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
