Summary
Canaux ioniques Mécanosensibles est souvent étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec enregistrement patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, l’issue sur le flux de fluides-règlements des canaux ioniques peut être erronée. Ici, nous fournissons des méthodes pour prévenir et corriger ces erreurs avec une base théorique.
Abstract
Écoulement de fluide est un stimulus environnemental important qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement fluide/shear force ne sont pas totalement comprises, régulation débit liquide de blocage de canal ionique peut contribuer critique. Par conséquent, écoulement fluide/shear force sensibilité des canaux ioniques a été étudiée en utilisant la technique du patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, les résultats et l’interprétation des données peuvent être erronées. Ici, nous présentons des preuves expérimentales et théoriques en erreurs de flux de fluide et fournir des méthodes pour l’estimation et la prévention et la correction de ces erreurs. Changements de potentiel entre l’électrode de référence Ag/AgCl et bain liquide de jonction ont été mesurées avec une pipette ouverte remplie de 3M KCl. écoulement de fluide pourrait alors déplacement le mV potentielle d’environ 7 jonction liquide/métal. À l’inverse, en mesurant le décalage de tension induit par l’écoulement du fluide, nous avons estimé la concentration en ions dans la couche limite stationnaire. À l’état statique, les concentrations d’ions real adjacentes à l’Ag/AgCl référence électrode ion canal d’entrée à la surface de la membrane cellulaire peuvent atteindre le plus bas aussi environ 30 % de ce débit. Placer un gel d’agarose 3M pont de KCl entre l’électrode de référence et fluide de baignade peut avoir empêché ce problème de jonction potentielle changeant. Toutefois, l’effet de la couche stationnaire adjacente à la surface de la membrane cellulaire ne pourrait pas fixée de cette manière. Ici, nous fournissons une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire avec une pipette ouverte patch clamp, mettant l’accent sur l’importance d’utiliser un gel d’agarose sel-pont alors qu’il étudiait les fluide régulation induite par l’écoulement de courants ioniques. Par conséquent, cette approche novatrice, qui prenne en considération les véritables concentrations des ions dans la couche limite stationnaire, peut fournir des observations utiles sur le plan expérimental et interprétation des données liées à la réglementation de la contrainte de cisaillement fluide des canaux ioniques .
Introduction
Écoulement de fluide est un important signal environnemental qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide et cisaillement fluide force dépendant vasculaire remodelage et développement1,2, 3,4,5. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement du fluide force de cisaillement ne sont pas totalement comprises, on croit que régulation débit liquide de blocage de canal ionique critique contribue aux réponses induites par écoulement fluide5 , 6 , 7 , 8. par exemple, l’activation de l’endothélium redresseur entrant Kir2.1 et Ca2 +-activé K+ (KCa2.3, KCNN3) canaux après l’influx de Ca2 + par l’écoulement du fluide a été suggéré de contribuer au fluide vasodilatation induite par le flux de6,7,8. Par conséquent, de nombreux canaux ioniques, canaux spécialement activés mécaniquement ou - inhibés, ont été étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec le patch clamp technique6,9,10 , 11. Toutefois, selon le protocole expérimental effectué au cours de l’enregistrement patch clamp, résultats et interprétation des données sur les flux de fluides-règlements des canaux ioniques peuvent être erronée10,11.
Une source d’artefacts d’induite par le flux de fluide dans l’enregistrement patch-clamp est de la jonction éventuelle entre le fluide de baignoire et d’électrode Ag/AgCl référence11. On croit généralement que la jonction liquide/métal potentielle entre le bain fluide et électrode Ag/AgCl est constante que la concentration en Cl– du bain liquide est maintenue constante, compte tenu de la réaction chimique entre la solution de trempage et électrode Ag/AgCl pour être :
AG + Cl–↔ AgCl + électron (e–) (équation 1)
Toutefois, dans un cas où la réaction électrochimique globale entre la solution de trempage et l’électrode de référence Ag/AgCl (équation 1) procède de gauche à droite, la concentration en Cl– le liquide de bain adjacente à l’Ag/AgCl référence électrode (couche limite stationnaire12,13,14,15) peut être beaucoup plus faible que dans la majeure partie de la solution, de baignade, à moins que suffisamment transport par convection est assurée. En utilisant une électrode Ag/AgCl vieux ou non idéales avec chloration insuffisante de l’Ag peut augmenter ce risque. Cet artefact axés sur les flux de fluide à l’électrode de référence, en fait, peut être exclu en plaçant simplement un pont d’agarose-sel classique entre le fluide de la baignade et la référence électrode, étant donné que l’artefact est issu des altérations en véritable Cl– concentration d’adjacente à électrode Ag/AgCl11. Le protocole présenté dans la présente étude décrit comment empêcher les changements potentiels de jonction axés sur les flux et mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire.
Après avoir placé un gel d’agarose pont de KCl entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl, il y a un autre facteur crucial qui devrait être considéré : tout comme la référence électrode Ag/AgCl agit comme une électrode Cl– , les canaux ioniques peuvent également fonctionner comme une électrode sélective des ions. La situation d’une couche limite stationnaire entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl se présente pendant le mouvement des ions entre les solutions extracellulaires et intracellulaires par le biais de canaux ioniques membranaires. Cela implique que l’attention doit être utilisé lors de l’interprétation de la réglementation des ions canaux par l’écoulement du fluide. Tel que mentionné dans notre précédente étude11, le mouvement des ions à travers une solution dans laquelle existe un gradient électrochimique peut se produire par l’intermédiaire de trois mécanismes distincts : diffusion, migration et convection, où la diffusion est le mouvement induite par le gradient de concentration, la migration est le mouvement conduit par gradient électrique et convection est le mouvement par le biais de flux de fluide. Parmi ces mécanismes de trois transport, mode convection qui contribue le plus à la circulation des ions11 (> 1 000 fois supérieures à la diffusion ou de la migration sous paramètres habituels patch clamp). Celui-ci constitue la base théorique de pourquoi jonction éventuelle entre le fluide de la baignade et électrode de référence Ag/AgCl peut très sous différentes conditions statiques et les flux de fluide11.
Selon l’hypothèse proposée plus haut, certains effets facilitateur de débit des fluides sur le canal ionique actuel peuvent être déduites de la convection restauration des concentrations en ion réelle adjacentes à l’entrée du canal à la surface de la membrane (couche limite stationnaire) 10. dans ce cas, les effets d’induite par le flux de fluide sur les courants des canaux ioniques ont simplement découler d’événements électrochimiques, pas de la régulation des processus de blocage de canal ionique. Une idée similaire a été précédemment suggérée par Barry et ses collègues12,13,14,15 basée sur des considérations théoriques rigoureuses et des preuves expérimentales, également connu sous le nom de la couche stationnaire ou effet numéro de transport. Si certains canaux ioniques ont suffisamment la conductance monocanal et assez longtemps ouverte-le temps de fournir des taux de transport suffisante par tous les canaux (un plus rapide taux de transport dans la membrane que dans la surface de la membrane stationnaire), un effet couche limite peuvent survenir . Ainsi, le transport par convection-dépendante peut contribuer à éventuelles facilitations induite par fluide-flux d’ion actuel10,12,13,14,15.
Dans cette étude, nous insistons sur l’importance d’utiliser une gélose ou agarose sel-pont alors qu’il étudie la régulation induite par fluide-flux des courants ioniques. Nous fournissons également une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire adjacente aux Ag/AgCl référence électrode et membrane canaux ioniques. En outre, l’interprétation théorique de fluide modulation induite par le flux des courants des canaux ioniques (c.-à-d., hypothèse de convection ou effet numéro de transport couche stationnaire) peut fournir des indications précieuses pour la conception et l’interprétation des études sur la force de cisaillement-règlement des canaux ioniques. Selon l’effet numéro de la transport couche limite stationnaire, nous prédisons que les courants des canaux ioniques à travers tous les types de canaux ioniques membranaires peuvent être facilitées par l’écoulement du fluide, indépendamment de leur sensibilité biologique à force de cisaillement du fluide, mais seulement si les canaux ioniques ont suffisamment monocanal conductance et ouvert long-temps. Densités de courant plus élevées ion channel peut augmenter l’effet de la couche limite stationnaire à la surface de la membrane cellulaire.
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Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles de Konkuk University.
1. Agarose sel ponts entre la Solution de bain et l’électrode de référence Ag/AgCl
Remarque : Agarose 3M KCl ponts salins sont produites comme précédemment décrit12 avec des variations mineures.
- Formation de ponts
- Courber les tubes capillaires de verre feu pour former une U-forme le cas échéant. Le diamètre intérieur des capillaires doit être assez grand pour réduire la résistance série lors de l’enregistrement des courants ioniques grand. Tubes d’un diamètre intérieur de 2 à 5 mm sont généralement acceptables.
- Préparation de la solution de KCl 3M d’agarose
- Préparer 100 mL de solution de KCl 3M (1 M ou 2 M est également acceptable).
- Environ 3 g d’agarose.
- Dissoudre l’agarose dans 100 mL de KCl (c.-à-d., 3 % d’agarose) sur une plaque chauffante entre 90 et 100 ° C.
- La passerelle avec 3M KCl agarose d’embarquement
- Pour faciliter le chargement, immergez les ponts de verre en forme de U dans la solution de gel d’agarose-KCl.
Remarque : Il est facile de creuser les ponts de verre si la solution d’agarose-KCl est contenue dans un récipient peu profond et large. - Les garder toute la nuit à température ambiante (RT) pour l’agarose à définir et à durcir.
- Déterrer soigneusement les ponts d’agarose-KCl-chargé de verre de la série/durci d’agarose-sel.
- Pour faciliter le chargement, immergez les ponts de verre en forme de U dans la solution de gel d’agarose-KCl.
- Stocker les ponts
- Préparer assez de volume (p. ex., 500 mL) de la solution de KCl 3M dans une bouteille à col large.
- Stockez les ponts d’agarose-sel préparés dans la bouteille au réfrigérateur.
2. application de la Force de cisaillement d’écoulement du fluide aux cellules dans une chambre de serrage Patch
Remarque : Un schéma de l’installation expérimentale de patch clamp est montré dans la Figure 1.
- Place un conteneur chargé avec solution de baignade (volume et hauteur devraient déjà être mesurés) au-dessus de la chambre de patch clamp.
- Remplir la chambre de patch clamp avec la solution de trempage par aspiration du tube.
- Pour arrêter l’écoulement du fluide, couper le tube à côté du conteneur pour bloquer l’écoulement du fluide, puis couper le tube à l’aspiration pour arrêter l’aspiration en même temps. Il s’agit de la condition de contrôle « stationnaire ».
- Pour appliquer la force de cisaillement d’écoulement du fluide, ouvrir les deux tubes sur les côtés du récipient et d’aspiration en même temps.
- Avant ou après l’application de la force de cisaillement d’écoulement du fluide à la cellule, mesurer le débit en mL/min.
- Calculer le débit en mesurant la diminution de volume du liquide pendant une période donnée.
- Du débit mesuré et de géométrie (structure) de la chambre de bain, la force de cisaillement appliquée à la cellule par l’écoulement du fluide doit être évaluée (voir la section « discussion »).
- Sinon, pour contrôler la vitesse d’écoulement (pour obtenir la procédure 2,3-2,6), utiliser une pompe à perfusion. Dans ce cas, veillez à assurer une constante plutôt qu’un flux pulsatile.
3. mesurer les changements de potentiel de jonction liquide-métal par l’écoulement du fluide entre Solution bain et électrode de référence Ag/AgCl (Figure 3 a)
- Utiliser l’électrode Ag/AgCl ou pellet, qui n’existe pas de produits prêts à l’emploi, sans le pont salin d’agarose.
- Préparer une solution saline normale sel physiologique pour la chambre de bain (p. ex., 143 mM NaCl, KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucose 5,4 mM ; pH ajusté à 7,4 avec NaOH).
- Placez une pipette patch contenant une solution de KCl 3M dans la chambre pour réduire au minimum le changement de potentiel de jonction entre la pipette et les solutions de baignade.
- Difficulté de l’amplificateur de tension-bride pour le mode actuel de la pince ("J’ai = 0 » ou « CC »).
- Après détruire le potentiel de décalage initial, mesurer les changements de tension induite par différents débits.
- Pour vérifier que les variations de tension sont des potentiels de jonction liquide/métal, réexaminer l’effet de l’écoulement du fluide sur le potentiel de jonction à l’aide du pont d’agarose-sel entre la solution du bain et électrode Ag/AgCl.
4. experimental Estimation de la Concentration réelle Cl– dans la couche stationnaire Adjacent à électrode Ag/AgCl dans des conditions statiques (Figure 3 b)
- Les résultats de l’étape 3, établir les relations de débit potentiel de jonction et estimer la valeur maximale (saturation) de changement potentiel de jonction par le débit de fluide précité.
- Préparer des solutions de différentes concentrations de Cl (c.-à-d., 50, 99, 147, 195 et 288 mM de NaCl).
- En changeant le Cl– concentration dans le liquide du bain, dessiner la relation jonction potentielle-[Cl–]. Notez que le taux de fluide doit être constante et suffisamment élevé (> 30 mL / min) pour éviter la baisse de concentration de Cl– à celle de l’électrode de référence Ag/AgCl adjacent.
- Partir des courbes de deux relation, estimer les variations de concentration de Cl– depuis le changement de potentiel de jonction mesurée.
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Representative Results
Germes entiers dépendants de la tension type L Ca2 + (VDCCL) courants des canaux ont été enregistrées dans les myocytes artériels mésentérique de rat enzymatiquement dispersés, comme décrit précédemment11. Les myocytes artériels ont été dialysées avec une solution de la pipette Cs-riches dans une configuration de nystatine perforé avec la solution de trempage d’exempt de cations divalents pour faciliter l’écoulement du courant à travers VDCCL11,16. Bref dépolarisant rampes de tension ou des mesures de tension, à un potentiel d’exploitation de -70 mV, ont été appliquées pour obtenir les courants VDCCL . Une représentante courant-tension (I-V) relation VDCCL en absence et en présence d’écoulement du fluide (5 mL/min ou environ 0,004 m/s), enregistré avec un gel d’agarose pont de KCl, est montré dans la Figure 2 a. Écoulement de fluide a légèrement augmenté le VDCCL actuel d’une façon indépendante de la tension. Cet effet facilitateur de débit des fluides sur le VDCCL actuel est résumé dans la Figure 2 b.
La facilitation de tension indépendantes de VDCCL actuel par l’écoulement du fluide est une réponse appropriée de l' VDCCL à la force de fluide ou de cisaillement. Les 5 mL/min environ 0,004 m/s de débit des fluides dans l’installation expérimentale actuelle a été estimée pour représenter approximativement 0.1 Dynes/cm2 en termes de force de cisaillement (voir discussion). Toutefois, lorsque l’Ag/AgCl référencez électrode était directement lié au fluide de se baigner sans un gel d’agarose pont de KCl, la relation de V - j’en présence de l’écoulement du fluide déplacé vers la droite par rapport à celle des courants VDCCL sous un statique condition (Figure 2 et 2D). Il en est résulté l’inhibition de VDCCL actuel à des tensions négatives et facilitation de VDCCL actuel à des potentiels plus positifs ou dépolarisées. Cela illustre bien l’artefact induite par le flux de fluide dans l’enregistrement de patch-clamp dans lequel un changement de tension de la relation -V jen’était pas dû à la modification de blocage du canal mais a été fait en raison d’un changement de potentiel de jonction entre le bain fluide et Ag/AgCl référence de l’électrode11. Preuve directe pour le changement de potentiel de jonction d’induite par le flux de fluide est illustrée à la Figure 3.
Les variations potentielles de la jonction ont été mesurées selon l’étape 3. Les modifications, en raison de l’écoulement du fluide, ont été mesurées à l’aide d’une pipette ouverte remplie de 3M KCl, comme décrit précédemment11. Avec une pipette ouverte remplie de 3M KCl, la jonction potentielle entre la pipette et le bain solutions pourrait être réduite, et les changements potentiels en raison de l’écoulement du fluide étaient principalement de la solution de trempage et l’électrode de référence Ag/AgCl. Sans un gel d’agarose 3M KCl des ponts entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl, écoulement du fluide déplacé le potentiel de jonction entre le fluide et l’électrode Ag/AgCl dans une manière de taux-dépendante de l’écoulement du fluide (Figure 3 a). Le changement de potentiel de jonction maximale a été extrapolé pour être ~ 7 mV de la relation d’écoulement potentiel-fluide de jonction (Figure 3 a, en bas). En revanche, lorsque l’agarose 3M KCl pont a été utilisé, écoulement du fluide n’a pas altéré le potentiel entre l’électrode de référence et fluide de baignade de jonction (résumée dans le graphique du bas de la Figure 3 a, en bas).
Afin de mesurer les différences de concentration entre les conditions d’écoulement de fluide et statique, dans laquelle assez convection des modes d’action sont fonctionnelles, nous avons examiné l’effet de l’évolution des concentrations de Cl– sur l’électrode de fluide-Ag/AgCl baignade jonction potentielle selon l’étape 4. Augmentation de la concentration de Cl– décalé le potentiel d’une manière dose-dépendante de jonction (Figure 3 b, haut) tout comme l’écoulement du fluide déplacé le potentiel dans une manière dépendante du taux de jonction. À l’aide d’un pont d’agarose de KCl, le potentiel de jonction a été empêché de modifier dans un Cl– façon dépendante de la concentration (Figure 3), ce qui indique que le changement de potentiel de jonction survenue entre l’électrode de référence et de solution de bain, pas entre les solutions de salle de bain et pipette. L’intrigue semi-logarithmique de la jonction potentiel-[Cl–] relation s’affiche dans le panneau inférieur de la Figure 3 b. Selon les résultats dans la Figure 3 b, la valeur maximale extrapolée de ~ 7 mV dans le changement potentiel de jonction (à partir de la Figure 3 a) suggère que la concentration en Cl– adjacente à l’électrode de référence Ag/AgCl diminue à environ 70 % de la concentration moyenne de la masse liquide de baignade lors de l’écoulement du fluide est absent (Figure 3 b, en bas).
Dans notre étude précédente, Kir2.1 courants auraient été facilitée par l’écoulement du fluide par la convection restauration (croissant) [K+] à l' entrée de canal10. Cette idée découle des phénomènes qui se produisent entre le bain fluide et électrode Ag/AgCl, comme le canal Kir2.1 peut fonctionner comme une électrode K+ tout comme les fonctions d’électrode Ag/AgCl comme électrode Cl– . Cette idée est illustrée schématiquement à la Figure 4 a et 4 b. Un exemple représentatif du fluide facilitation induite par le flux des courants Kir2.1 est montré dans la Figure 4. Les courants de Kir2.1 ont été provoquées par une étape de tension hyperpolarisant d’un potentiel d’exploitation de 0 à -100 mV dans les cellules de la leucémie basophile (RBL) rat. Demande de débit des fluides (5 mL/min ou 0,004 m/s) augmente facilement le courant Kir2.1 (Figure 4). Cette facilitation par l’écoulement du fluide a été suggérée précédemment être médiée ne pas de signalisation cellulaire, mais par l’effet électrochimique de convection transports des ions de K+ de la couche limite stationnaire10.
Figure 1 : schéma montrant la configuration de la chambre de bain pour la régulation de courant des canaux ioniques dans l’enregistrement patch clamp. Panneau inférieur est la vue de côté (coupe sagittale) de la chambre de patch clamp. Il résume le chemin d’accès de débit des fluides et les lieux d’une cellule étudiée, électrodes et d’entrée/de sortie du fluide. Parce que le liquide est continuellement pompé à travers le tube de sortie par aspiration, la hauteur de liquide dans la chambre est maintenue à un niveau relativement constant. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effets de liquide coulent sur L-type dépendant de la tension Ca2 + (VDCCL) courants des canaux avec et sans l’agarose 3M pont de KCl. VDCCL courants ont été enregistrées dans les myocytes artériels mésentérique rat enzymatiquement dispersée avec enregistrement perforé patch-clamp de la nystatine. Solution saline physiologique de tyrode normale avec 4,2 mM EDTA sans les cations divalents servait la baignade solution11. La solution de la pipette contenues CsCl, 140 mM ; MgCl2, 1 mM ; HEPES, 5 mM ; EGTA 0,05 mM ; pH ajusté à 7,2 avec CsOH. (A et B) Avec agarose 3M KCl-pont. (A) représentant jeV - couple pour le courant VDCCL et les effets de l’écoulement du fluide. B résumé des effets sur la relation de V - J’aides courants VDCCL fluides. (C et D) Sans gel d’agarose 3M KCl pont. (C) jeV - relations des courants VDCCL . D résumé j’aides relations -V des courants VDCCL pic en absence et en présence d’écoulement du fluide. Les formes des marches de tension pour soutirer VDCCL courants sont indiqués dans l’encart de la figure. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effets du débit des fluides sur métaux liquides jonction éventuelle entre le fluide de la baignade et Ag/AgCl référencent électrode et estimation de véritable concentration Cl– dans la couche stationnaire adjacente à l’électrode de référence de la jonction mesurée potentiel. (Un) tracé représentatif A des changements potentiels de jonction en raison de divers taux d’écoulement du fluide (du haut). Ce chiffre a été modifié par une précédente publication11. Le rapport de taux de flux potentiel-fluid junction (n = 5). B supérieure panneau : représentant enregistrement des changements potentiels de jonction en raison de diverses concentrations des solutions de NaCl. Panneau inférieur : l’intrigue semi-logarithmique de la relation risque-[Cl–] jonction (n = 5). La ligne droite en rouge représente le meilleur ajustement par une équation de Nernst modifié pour équilibre possible avec une pente de dix fois de 49 mV. En raison de la sélectivité finie de Na+, comparée à celle du Cl-, pour générer la jonction liquide/métal potentielle, la valeur de la pente de 49 mV, au lieu de 58 mV, produit le meilleur ajustement la jonction potentiel-[Cl–] relativement à la chambre température. La pente de 49-mV indique le Cl– dépendance (ou sélectivité) du électrode de référence Ag/AgCl > 95 % sur l’autre ion (dans ce cas, Na+), selon l’équation de tension de Goldman-Hodgkin-Katz. Un déplacement de 7 mV à une concentration de Cl– de 150 mM indique une diminution d’environ 30 % de la concentration en Cl– . Traçage représentatif (C) A du potentiel de jonction en diverses concentrations des solutions de NaCl avec une utilisation de 3 pont d’agarose M KCl (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : schéma des effets de convection modèle de débit des fluides sur les concentrations d’ions adjacentes aux canaux ouverts pendant le flux de courant ionique. (A) dans des conditions statiques avec peu de transport convectif d’ions dans la solution avec le champ électrique de l’ion K+ flux par le biais de K+-canaux ioniques sélectives peut provoquer une diminution des concentrations de K+ dans le Microdomaine adjacente à la entrée du canal. (B) le fluide peut restaurer convection de la diminution de concentration K+ adjacente à l’entrée du canal ouvert. (C) effet de l’écoulement du fluide sur les courants des canaux Kir2.1 rectification entrante. Écoulement de fluide augmente instantanément les courants Kir2.1. La forme de l’étape de tension est illustrée dans le médaillon de la figure. Les courants de Kir2.1 ont été enregistrées à l’aide de K haute+-solutions de baignade et - pipette. Solution de baignade : 148,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucose ; pH ajusté à 7,4 avec NaOH. Pipetter solution : 135 mM KCl, 5 mM NaCl, Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM 5 mM éthylèneglycol-bis (2-aminoéthyl)-N, N, N', N',-tétraacétique (EGTA), pH 7,2 (ajusté avec KOH). Puisque les cellules RBL - 2H 3 sont très sensibles au gonflement hypo-osmotique et conséquente déclencheur activé par volume cl– courants, saccharose 38 mM a été ajouté à la solution de trempage pour ajuster pour osmolarité et empêcher le gonflement des cellules. En outre, un bloqueur des canaux Cl– [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbènedisulfonique acide (DIDS, 30 µM)] a été ajouté à la solution de la pipette afin d’éliminer toute contamination par les courants Cl– . Groupe C a été modifié par une précédente publication10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons démontré une méthode pour mesurer la véritable concentration Cl– dans la couche stationnaire adjacente à l’électrode de référence Ag/AgCl en déterminant le potentiel de jonction liquide métallique avec une pipette de patch clamp ouvert remplie d’une haute KCl concentration. La variation de concentration Cl– dans la couche limite peut entraîner un changement de potentiel de jonction lors du passage du statique à des conditions de flux de fluide. Simplement en utilisant un gel d’agarose pont de KCl entre l’électrode de référence et le bain liquide peut empêcher les erreurs liées à la concentration de Cl– ou artefacts au cours de l’enregistrement patch-clamp.
En plus en insistant sur l’importance d’un pont salin agar ou d’agarose, une autre application de cette méthode pour estimer la concentration de l’ion réelle dans la couche limite stationnaire est la suivante. Parce que les canaux ioniques plasmiques peut fonctionner comme électrodes sélectives (tout comme les fonctions électrode de Ag/AgCl comme une électrode Cl– ), la concentration en ions réels dans la limite de stationnaire couche adjacente à l’entrée du canal à la membrane cellulaire surface peut être différente de la concentration moyenne du fluide en vrac. Cette différence dans la concentration d’ions entre le gros fluide et stationnaire couche adjacente à la membrane cellulaire est le scénario réel sous paramètres cliniques et doit être distinguée de la modulation biologique du canal Gate par la force de l’écoulement fluide/contrainte de cisaillement. Malheureusement, contrairement à l’effet de la couche stationnaire entre l’électrode de référence Ag/AgCl et fluide de la baignade, nous ne pouvons résoudre l’effet de la couche stationnaire adjacente à la surface de la membrane de la cellule lors de l’étude de la régulation des canaux ioniques par écoulement fluide/shear force.
Toutefois, compte tenu de l’observation que la concentration de l’ion réelle dans la couche stationnaire est environ 70 % de celle dans le liquide en vrac (Figure 3), nous pouvons faire quelques modifications dans les données expérimentales de distinguer la modulation biologique des canaux ioniques le « phénomène électrochimique de prise d’effet de la couche stationnaire ». La concentration en ions réel dans la couche stationnaire à la surface de la membrane cellulaire devait être environ 70 % de la concentration moyenne de la plus grande partie baignade solution dans une récente étude10. Puisque le fluide restauré la concentration en ions une diminution, il a facilité le Kir2.1 actuel indépendamment10de signalisation cellulaire. Dans notre étude précédente, la densité de courant était considérablement élevée (2,5 A / m2) avec un K extracellulaire haut+ concentration et forte expression de Kir2.1 en RBL cellules10. Toutefois, dans le cas réels membranes cellulaires avec diverses amplitudes de densité de courant de canal ionique, l’effet de la couche stationnaire à la surface de la membrane cellulaire peut dépendre grandement l’amplitude de la densité de courant de canal ionique. En outre, cela peut provoquer certains ions courants des canaux (en particulier ceux avec des densités de courant relativement faibles) insensible à la régulation du fluide-débit ; bien que, l’effet de la couche stationnaire est régulée par voie électrochimique et pas biologiquement. Ainsi, cela pourrait affecter la technique décrite ici. Donc, la possibilité d’élaborer une méthode quantitative qui est suffisante pour corriger les résultats expérimentaux devrait être étudié à l’avenir des études.
Dans la Figure 3, nous avons observé que potentiel de jonction liquide métallique entre l’électrode de référence Ag/AgCl et bain liquide dépendait grandement de l’état de l’électrode Ag/AgCl. En effet, lorsque l’électrode Ag/AgCl était parfait en état, changements de potentiel en raison de l’écoulement du fluide de jonction a été minimales (données non présentées). Toutefois, pauvre chloration de l’électrode Ag/AgCl provoqua un grand changement dans le potentiel de jonction. Étant donné que l’électrode de référence Ag/AgCl est très sensible à divers stimuli externes, tels que les ultraviolet léger et le stress oxydatif, en utilisant une gélose ou agarose pont de KCl est toujours recommandé. Bien que les changements de potentiel de jonction par fluide circulent entre bain fluide et l’électrode de référence est une source potentielle d’erreur, nous avons estimé avec succès les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire en mesurant le décalage de jonction potentiel en vertu de divers taux de flux de fluide (figures 3 a et 3 b).
Le point critique à l’étape 4 pour préparer la courbe d’étalonnage pour l’estimation de la véritable concentration Cl– dans les couches limites stationnaires de l’évolution du potentiel de jonction est que la courbe d’étalonnage doit être enregistrée sous un débit suffisante (30 mL / min dans cette expérience). Bien que ce débit est très rapide, dans des cas pratiques les plus rapidement le fluide, plus la baisse de la concentration est au niveau des couches limites (Figure 3). En outre, la pipette ouverte doit être remplie de KCl élevée, au lieu d’une solution de la pipette régulière, pour qu’une étude de patch clamp empêcher le changement de potentiel entre une pipette et solution de baignade de jonction.
De la relation suivante11, on peut estimer la force de cisaillement dans le cadre de patch clamp :
Τ = (6μQ) / (bh2) (équation 2)
Où : τ est la contrainte de cisaillement (N/cm2) ; Μ est la viscosité (0,001 N m/s2 pour l’eau à 20 ° C) ; Q est le débit de fluide (m3/s) ; b est la largeur de la chambre (m) ; et h est la hauteur de la chambre (m). Lorsque le taux d’écoulement du fluide est 30 mL/min, la force de cisaillement dans le patch-chambre illustré à la Figure 1 est estimée à ~0.75 dyn/cm2 d’après l’équation ci-dessus. Il s’agit d’un niveau de force de cisaillement faible par rapport à la force de cisaillement physiologiques ; les cellules endothéliales dans les vaisseaux sanguins peuvent être soumises jusqu'à 40 Dynes/cm18,19, les forces de cisaillement. Par conséquent, sous réserve que les canaux ioniques ne sont pas sensibles aux forces de cisaillement inférieure à 0,75 Dynes/cm2, nous pouvons étudier l’écoulement fluide/shear force sensibilité des canaux ioniques après l’exclusion de l’effet de la couche limite stationnaire en affectant à la condition de contrôle à 0,75 Dynes/cm2. Cependant, certains canaux ioniques, y compris Kir2.1, semble être sensibles aux forces de cisaillement inférieure à 0,75 Dynes/cm2,3,4,5,6.
L’effet couche stationnaire a été initialement proposé par Barry et ses collègues12,13,14,15. Ici, nous fournissons une méthode pour estimer la concentration de l’ion réelle dans la couche stationnaire en mesurant les changements dans le potentiel de jonction avec la pipette ouverte patch clamp. Nous suggérons également que cet effet de couche limite stationnaire peut contribuer au règlement d’induite par l’écoulement fluide des courants des canaux ioniques et il faudrait alors qu’il étudiait l’écoulement fluide-mechanosensitivity des canaux ioniques. Toutefois, selon cette hypothèse, on peut se demander pourquoi certains courants des canaux ioniques ne sont pas sensibles aux fluide régulation de débit-dépendante si l’effet de la couche limite stationnaire est un électrochimique plutôt que la lutte biologique. Comme abordé brièvement ci-dessus, c’est probablement parce que seulement les courants ioniques à travers les canaux avec grand assez conductance monocanal et longtemps ouverte-temps peut être facilitée par l’écoulement du fluide. Autrement dit, pour la mise en place de la couche stationnaire où la concentration de l’ion est différente de la moyenne dans la solution en vrac, des flux dans la phase de membrane devrait être assez rapide comparé à que dans l’humeur aqueuse phase14. Nous avons récemment suggéré que le courant à travers les canaux Kir2.1, dont la conductance et temps ouvert sont suffisamment élevées, est facilité par l’écoulement du fluide via des mécanismes de convection restauration de concentration en ions dans la couche limite stationnaire de surface de membrane de la cellule11.
En conclusion, nous présentons une méthode pour mesurer la concentration en ions dans la couche limite stationnaire adjacente à la surface d’électrode et de la membrane cellulaire de référence avec une pipette ouverte patch clamp. Outre en insistant sur l’importance d’un gel d’agarose pont de KCl, cette méthode fournit également un moyen de tenir compte de l’effet de couche stationnaire tout en interprétant l’écoulement fluide/shear force contrôle des canaux ioniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le programme de centre de recherche de Pioneer (2011-0027921), de programmes de recherche sciences fondamentales (2015R1C1A1A02036887 et 2016R1A2B4014795-NRF) par le National Research Foundation of Korea financé par le ministère de la Science, TIC & Avenir de planification et par une subvention de la Corée Health Technology R & D Project à travers la Corée santé industrie développement Institut (KHIDI), financé par le ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
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