Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58228
* These authors contributed equally

Summary

Mechanosensitive ionenkanalen worden vaak bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met patch-clamp opname. Afhankelijk van het experimentele protocol, kan de uitkomst op vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen echter onjuist. Hier, bieden wij methoden voor het voorkomen en corrigeren van dergelijke fouten met een theoretische basis.

Abstract

Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-stimulans waarmee veel fysiologische en pathologische processen, zoals vloeibare stroom-geïnduceerde vasodilatatie. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistof stroom/schuifspanning kracht niet volledig begrepen worden, kan kritisch fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating bijdragen. Daarom, fluid flow/schuifspanning kracht gevoeligheid van ionenkanalen is onderzocht met behulp van de patch-clamp techniek. Afhankelijk van het experimentele protocol, kunnen de resultaten en de interpretatie van gegevens echter onjuist. Hier presenteren we experimentele en theoretische bewijzen voor fluid flow-gerelateerde fouten en voorzien in methoden voor het schatten, preventie en het corrigeren van deze fouten. Veranderingen in junction potentiële tussen de Ag/AgCl-elektrode en Baden vloeistof werden gemeten met een open pipet gevuld met 3 M KCl vloeistofstromen kan dan verschuiven de vloeistof/metaal junction potentiële tot ongeveer 7 mV. Omgekeerd, door het meten van de verschuiving van de spanning geïnduceerd door vloeistofstromen, geschat we de ion-concentratie in de ongemengde grenslaag. In de rusttoestand, kunnen de echte ion concentraties grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode of ion kanaal inlaat aan het celmembraan oppervlak bereiken zo laag als ongeveer 30% van die in de voorwaarde van de stroom. Plaatsen van een agarose 3 M kan KCl brug tussen de zwemwater-vloeistof en referentie-elektrode hebben verhinderd indien dit probleem van het verschuiven van potentiële junction. De ongemengde laageffect grenzend aan het oppervlak van de celmembraan kan echter niet worden vastgesteld op deze manier. Hier bieden we een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag met een pipet open patch-clamp, wijzend op het belang van het gebruik van een agarose zout-brug terwijl het bestuderen van de vloeistof stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. Dus, deze nieuwe aanpak, waarin rekening wordt gehouden met de reële concentraties van ionen in de ongemengde grenslaag, nuttig inzicht kan verschaffen over de proefopzet en interpretatie van de gegevens aan vloeistof schuifspanning verordening van ionenkanalen gerelateerde .

Introduction

Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-cue waarmee veel fysiologische en pathologische processen zoals fluid flow-geïnduceerde vasodilatatie en vloeistof schuintrekken kracht-afhankelijke vasculaire remodeling en ontwikkeling1,2, 3,4,5. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistofstromen schuintrekken kracht niet helemaal begrepen zijn, gaat men ervan uit dat de fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating kritisch tot de vloeistof stroom-geïnduceerde reacties5 bijdragen kan , 6 , 7 , 8. bijvoorbeeld de activering van het endotheel innerlijke gelijkrichter Kir2.1 en Ca2 +-geactiveerde K+ (KCa2.3, KCNN3) kanalen na Ca2 + toestroom door vloeistofstromen heeft gesuggereerd om bij te dragen tot vloeistof stroom-geïnduceerde vasodilatatie6,7,8. Daarom veel ionenkanalen, vooral mechanisch-geactiveerde of -geremde kanalen, zijn bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met de patch-clamp techniek6,9,10 , 11. afhankelijk van het experimentele protocol taakuit patch-clamp opnemen, uitkomsten en interpretatie van de gegevens op de vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen kunnen echter foutieve10,11.

Een bron van vloeibare stroom-geïnduceerde artefacten in patch-clamp opname is vanaf de samenvloeiing potentiële tussen de Badvloeistof en Ag/AgCl referentie elektrode11. Het is algemeen aangenomen dat de vloeistof/metaal-kruising potentieel tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode constant, is zoals de Cl- -concentratie van de vloeistof zwemmen blijft constant, gelet op de chemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode te zijn:

AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (vergelijking 1)

Echter, in een geval waar de totale elektrochemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode (vergelijking 1) opbrengst van links naar rechts, de concentratie van de Cl- van de Baden vloeistof grenzend aan de Ag/AgCl verwijzing elektrode (ongemengde grenslaag12,13,14,15) wellicht veel lager dan die in de bulk van het zwemwater oplossing, tenzij genoeg convectional transport te waarborgen. Het gebruik van een oude of niet-ideale Ag/AgCl-elektrode met inadequate chlorering van Ag kan dergelijk risico verhogen. Deze vloeistof stroom-gerelateerde artefact op de referentie-elektrode, in feite, kan worden uitgesloten door het simpelweg plaatsen van een conventionele agarose-zout-brug tussen de Baden vloeistof en referentie-elektrode, aangezien het artefact is gebaseerd op wijzigingen in de reële Cl- concentratie grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode11. Het protocol gepresenteerd in deze studie beschrijft hoe te voorkomen van de mogelijke wijzigingen van de stroom-gerelateerde junction en meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag.

Na het plaatsen van een agarose KCl brug tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode, is er een andere cruciale factor die u moet overwegen: net zoals de verwijzing Ag/AgCl-elektrode fungeert als een Cl- -elektrode, de ionenkanalen ook kunnen functioneren zoals een ion-selectieve elektrode. De situatie van een ongemengde grenslaag tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode ontstaat tijdens de beweging van ionen tussen de extracellulaire en intracellulaire oplossingen via het membraan ionenkanalen. Dit impliceert dat voorzichtigheid moet worden gebruikt wanneer de interpretatie van het Reglement van ion kanalen door vloeistofstromen. Zoals besproken in onze eerdere studie11, de beweging van ionen via een oplossing waarin een elektrochemische gradiënt aanwezig is via drie verschillende mechanismen kan optreden: diffusie, migratie en convectie, waar diffusie de beweging is geïnduceerd door verloop van de concentratie, migratie is de beweging gedreven door elektrische verloop en convectie is het verkeer door middel van vloeistof-flow. Onder deze drie vervoer mechanismen, draagt convectie modus bij de meeste aan de beweging van ionen11 (> 1.000 keer groter is dan de verspreiding of migratie onder gebruikelijke patch-clamp-instellingen). Dit vormt de theoretische basis van waarom junction potentiële tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode kan zeer onder verschillende voorwaarden voor statische en vloeistof-flow11.

Volgens de hypothese voorgesteld hierboven, sommige facilitatory effecten van vloeistofstromen op de huidige ionkanaal kunnen worden afgeleid uit de convectie restauratie van echte ion concentraties grenzend aan de inlaat van kanaal aan de oppervlakte van het membraan (ongemengde grenslaag) 10. In dit geval de vloeistof stroom-geïnduceerde effecten op ion kanaal stromingen zijn eenvoudigweg ontstaan uit elektrochemische gebeurtenissen, niet van het Reglement van ion kanaal gating. Een soortgelijk idee was eerder voorgesteld door Barry en collega's12,13,14,15 op basis van strenge theoretische overwegingen en experimenteel bewijs, ook bekend als de ongemengde laag of vervoer nummer effect. Als sommige ionenkanalen voldoende voordoen enkellijns geleidingsvermogen en lang genoeg open-tijd om te zorgen voor voldoende vervoer tarieven via de kanalen (vervoer sneller in het membraan dan in het ongemengde membraan oppervlak), een grenslaag effect . Dus, de convectie-afhankelijke vervoer kan bijdragen tot de uiteindelijke vloeistof-stroom-geïnduceerde faciliteiten van ion huidige10,12,13,14,15.

In deze studie, benadrukken wij het belang van het gebruik van een agar of agarose zout-brug terwijl het bestuderen van vloeistof-stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. We bieden ook een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode en membraan ionenkanalen. Bovendien, de theoretische interpretatie van vloeistof stroom-geïnduceerde modulatie van ion kanaal stromen (dat wil zeggen, convectie hypothese of ongemengde vervoer nummer laageffect) kunnen waardevolle inzichten voor het ontwerpen en het interpreteren van onderzoeken op de shear kracht-regulatie van ionenkanalen. Volgens het ongemengde grenslaag vervoer nummer effect voorspellen we dat ion kanaal stromen via alle soorten membraan ionenkanalen kunnen worden vergemakkelijkt door vloeistofstromen, onafhankelijk van hun biologische gevoeligheid voor vloeistofstromen schuintrekken kracht, maar alleen als de ionenkanalen hebben voldoende enkellijns geleidingsvermogen en open-lang. Hogere ion kanaal huidige dichtheden kan verhogen de ongemengde grenslaag effect op het oppervlak van de celmembraan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele richtsnoeren van Konkuk Universiteit.

1. Agarose zout bruggen tussen het bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode

Opmerking: Agarose 3M KCl zout bruggen worden geproduceerd zoals eerder beschreven12 met kleine variaties.

  1. Vorming van bruggen
    1. Buig de brand glazen capillaire buizen vormen een U-vormige zo nodig. De binnendiameter van de haarvaten moet groot genoeg zijn voor het verminderen van de serie weerstand bij het opnemen van grote ion stromen. Buizen met een binnendiameter van 2-5 mm zijn meestal acceptabel.
  2. Bereiding van agarose 3 M KCl oplossing
    1. Bereiden van 100 mL 3 M KCl oplossing (1 M of 2 M is ook acceptabel).
    2. Weeg 3 g van agarose.
    3. Los de agar in 100 mL KCl (dat wil zeggen, 3% agarose) op een hete plaat tussen 90 en 100 ° C.
  3. Laden van de bruggen met 3 M KCl agarose
    1. Dompel de U-vormige glazen bruggen in de agarose-KCl oplossing voor het eenvoudig laden.
      Opmerking: Het is gemakkelijk te graven uit de bruggen van glas als de agarose-KCl oplossing is opgenomen in een ondiep en breed container.
    2. Houd ze 's nachts bij kamertemperatuur (RT) voor de agarose instellen en harden.
    3. Zorgvuldig graven uit de agarose-KCl-loaded glas bruggen uit de reeks/gehard agarose-zout.
  4. Opslaan van de bruggen
    1. Genoeg volume voor te bereiden (dat wil zeggen, 500 mL) van de 3 M KCl oplossing in een fles met brede hals.
    2. Bewaar de bruggen agarose-zout bereid in de fles in een koelkast.

2. toepassing van vloeistofstromen Shear kracht naar cellen in een kamer Patch-klemmen

Opmerking: Een schematisch diagram van de experimentele opstelling van patch-clamp is weergegeven in Figuur 1.

  1. Plaats een container geladen met zwemwater oplossing (volume en hoogte moeten reeds worden gemeten) boven de patch-clamp-zaal.
  2. Vul de patch-clamp-zaal met de zwemwater-oplossing door het suctioning van de buis.
  3. Om te stoppen met de vloeistofstromen, illustraties van de buis aan de zijkant van de container voor het blokkeren van de vloeistofstromen en illustraties van de buis aan de zuiging kant om te stoppen met de zuiging op hetzelfde moment. Dit is de voorwaarde "stationair" controle.
  4. Om toe te passen vloeistofstromen schuintrekken kracht, opent u beide buizen op de zijkanten van de container en zuig op hetzelfde moment.
  5. Voor of na de vloeistofstromen schuintrekken kracht op de cel toe te passen, meten de stroomsnelheid in mL/min.
  6. Het debiet berekenen door het meten van de afname van de vloeistof volume na verloop van een bepaalde tijd.
  7. Van de gemeten debiet en meetkunde (structuur) van de kamer van de Baden, moet de kracht van de shear die naar de cel door de vloeistofstromen worden geschat (zie sectie discussie).
  8. Anderzijds om te bepalen van de stroomsnelheid (voor stappen 2.3-2.6), gebruik een perfusie pomp. In dit geval, wees voorzichtig om ervoor te zorgen een constante in plaats van een gepulseerde stroom.

3. meten van veranderingen in Liquid-Metal Junction potentieel door vloeistofstromen tussen Bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode (figuur 3A)

  1. Gebruik de Ag/AgCl-elektrode of pellet, die beschikbaar is vanaf de kant en klare producten, zonder de agarose zoutbrug.
  2. Een normale fysiologische zout zout voorbereiden op de zwemwater-zaal (b.v., 143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0.5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucose, pH aangepast aan 7.4 met NaOH).
  3. Plaats een patch-pipet met een 3 M KCl oplossing in de zaal om te minimaliseren van de potentiële verschuiving van de kruising tussen de pipet en Baden oplossingen.
  4. Bevestigen van de spanning-clamp versterker aan de huidige modus van de klem ("ik = 0" of "CC").
  5. Meet na het ontkrachten van de eerste verschoven potentieel, veranderingen in spanning geïnduceerd door verschillende debiet.
  6. Om te verifiëren dat de veranderingen in spanning vloeistof/metaal-kruising potentieel zijn, het effect van vloeistofstromen op het potentieel van de kruising met de agarose-zout-brug tussen het bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode opnieuw te onderzoeken.

4. experimentele schatting van de concentratie van de echte Cl- in de ongemengde laag grenzend aan Ag/AgCl-elektrode onder rusttoestand (figuur 3B)

  1. Uit de resultaten van stap 3, trekken de kruising potentieel-debiet relaties en schatting van de waarde van de maximale (verzadigen) junction potentiële variatie door het debiet van supra-vloeistof.
  2. Bereiden van oplossingen met verschillende concentraties van Cl (dat wil zeggen, 50, 99, 147, 195 en 288 mM van NaCl).
  3. Door het veranderen van de Cl- concentratie in de vloeistof van Baden, tekent u de relatie junction potentiële-[Cl-]. Merk op dat de vloeistof tarief constant en hoog genoeg moet (> 30 mL / min) om te voorkomen dat de daling van de concentratie van de Cl- met die van de aangrenzende Ag/AgCl-elektrode.
  4. Schatten van de relatie van de twee bochten, de veranderingen in de concentratie van de Cl- van de gemeten junction potentiële verschuiving.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele cel spanning-afhankelijke L-type Ca2 + kanaal (VDCCL)-stromingen werden geregistreerd in de mesenterische arteriële myocytes enzymatisch verspreide rat, als eerder beschreven11. De arteriële myocytes waren dialyzed met een Cs-rijke Pipetteer oplossing onder de configuratie van nystatine-geperforeerd met divalente kationen-gratis zwemmen oplossing ter vergemakkelijking van de huidige stroom door VDCCL11,16. Korte depolarizing hellingen van de spanning of spanning stappen, op een bedrijf potentieel van-70 mV, werden toegepast om te ontlokken de VDCCL stromingen. Een representatieve stroom-spanning (Ik-V) relatie in VDCC,L in de afwezigheid en aanwezigheid van vloeistofstromen (5 mL/min of ongeveer 0,004 m/s), opgenomen met een agarose KCl brug, is weergegeven in figuur 2A. Vloeistofstromen verhoogd iets de VDCCL huidige in een spanning-onafhankelijke manier. Dit stimulerende effect van vloeistofstromen op de VDCCL huidige is samengevat in figuur 2B.

De versoepeling van de spanning onafhankelijk van VDCCL huidige door vloeistofstromen is een goede reactie van het VDCCL op de kracht van vloeistof of schuintrekken. De 5 mL/min of ongeveer 0,004 m/s van vloeistofstromen in de huidige experimentele opzet werd geschat op ongeveer 0,1 dyn/cm2 in termen van shear kracht vertegenwoordigen (zie discussie). Echter wanneer de Ag/AgCl verwijst naar was elektrode direct gekoppeld aan de Baden vloeistof zonder een agarose KCl brug, de ik-V relatie in aanwezigheid van vloeistofstromen verschoven naar rechts ten opzichte van de VDCCL stromingen onder een statische voorwaarde (figuur 2C en 2D). Dit resulteerde in de remming van VDCCL stroomafname bij negatieve spanningen en versoepeling van de VDCCL actueel op meer depolarized of positieve mogelijkheden. Dit is een voorbeeld van de vloeistof stroom-geïnduceerde artefact in patch-clamp opname waarin een verschuiving van de spanning van de ik-V relatie niet als gevolg van de wijziging van het kanaal gating maar was eigenlijk te wijten aan een potentiële verschuiving van de kruising tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl referentie elektrode11. Direct bewijs voor de mogelijke verschuiving van vloeistof stroom-geïnduceerde junction is afgebeeld in Figuur 3.

De kruising mogelijke verschuivingen werden gemeten volgens stap 3. De veranderingen, als gevolg van vloeistofstromen, werden gemeten met behulp van een open precisiepipet gevuld met 3 M KCl, zoals eerder beschreven11. Met een open pipet gevuld met 3 M KCl, de kruising potentiële tussen de pipet en Baden oplossingen kan worden geminimaliseerd, en de mogelijke wijzigingen als gevolg van vloeistofstromen waren voornamelijk uit de oplossing van de Baden en Ag/AgCl-elektrode. Zonder een agarose 3 M KCl overbruggen tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode, vloeistofstromen verschoven de potentiële kruising tussen de vloeistof en de Ag/AgCl-elektrode in een vloeistofstromen tarief-afhankelijke manier (figuur 3A). De maximale junction mogelijke verandering was geëxtrapoleerd te ~ 7 mV uit de kruising potentieel-vloeistof stroom relatie (figuur 3A, bodem). In tegenstelling, wanneer de agarose 3 M KCl brug werd gebruikt, vloeistofstromen niet gewijzigd de kruising tussen de zwemwater-vloeistof en referentie-elektrode potentiële (samengevat in de onderste grafiek van figuur 3A, onderaan).

Om te meten van de concentratieverschillen tussen het statische en vloeiende stromingscondities, in welke genoeg convectie wijzen van optreden functioneel zijn, onderzochten we het effect van het wijzigen van Cl- concentraties op de zwemwater-vloeistof-Ag/AgCl-elektrode Junction potentiële volgens stap 4. Verhoging van de concentratie van Cl- de kruising potentieel in een concentratie-afhankelijke manier verschoven (figuur 3B, top) net zoals vloeistofstromen de kruising potentieel in een tarief-afhankelijke manier verschoven. Met behulp van een KCl agarose bridge, werd de kruising potentieel verhinderd veranderen in een Cl- concentratie-afhankelijke manier (Figuur 3 c), die aangeeft dat de kruising mogelijke verandering is opgetreden tussen de bad-oplossing en referentie-elektrode, niet tussen de bad en Pipetteer oplossingen. De semi-logaritmisch plot van de kruising potentieel-[Cl-] relatie wordt weergegeven in het onderste deelvenster van figuur 3B. Volgens de resultaten in figuur 3B, de geëxtrapoleerde maximale waarde van ~ 7 mV bij de potentiële overgang junction (van figuur 3A) suggereert dat de grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode Cl- -concentratie ~ 70% van vermindert de gemiddelde concentratie van de bulk Baden vloeistof wanneer vloeistofstromen afwezig is (figuur 3B, bodem).

In onze eerdere studie, werden Kir2.1 stromingen gemeld worden vergemakkelijkt door vloeistofstromen door (toenemende) [K+] bij de inlaat kanaal10convectively te herstellen. Dit idee komt voort uit de fenomenen die zich voordoen tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode, zoals het Kir2.1-kanaal als een K+ -elektrode, net als de Ag/AgCl-elektrode fungeert als een Cl- -elektrode functioneren kan. Dit idee is schematisch weergegeven in figuur 4A en 4B. Een representatief voorbeeld van vloeistof stroom-geïnduceerde versoepeling van de stromingen van de Kir2.1 wordt weergegeven in figuur 4C. De Kir2.1 stromingen waren ontlokte door een hyperpolarizing stap van de spanning van een bedrijf potentieel van 0 naar-100 mV in rat basofiele leukemie (RBL) cellen. Toepassing van vloeistofstromen (5 mL/min of 0,004 m/s) verhoogd gemakkelijk de huidige Kir2.1 (figuur 4C). Deze versoepeling door vloeistofstromen was eerder voorgesteld te worden bemiddeld niet door cellulaire signalering, maar door de elektrochemische effect van convectie transporten van K+ -ionen op de ongemengde grenslaag10.

Figure 1
Figuur 1: schematische setup van de kamer van de zwemmen voor de regulering van de vloeistof-stroom van ionenkanalen in de opname van de patch-clamp tonen. Lagere paneel is het zijaanzicht (Sagittaal sectie) van de patch-clamp-kamer. Het geeft een overzicht van het pad van vloeistofstromen en locaties van een bestudeerde cel, elektroden en inlaat/uitlaat van de vloeistof. Omdat de vloeistof voortdurend via stopcontact buis door afzuigen weggepompt is, wordt de hoogte van de vloeistof in de zaal op een relatief constant niveau gehandhaafd. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Effecten voor fluid flow op L-type spanning-afhankelijke Ca2 + kanaal (VDCCL) stromingen met en zonder de agarose 3 M KCl brug. VDCCL stromingen werden opgenomen in de mesenterische arteriële myocytes enzymatisch verspreide rat met nystatine geperforeerde patch-clamp opname. Normale tyrode fysiologische zoutoplossing met 4,2 mM EDTA zonder divalente kationen werd gebruikt als de Baden oplossing11. De pipet oplossing opgenomen CsCl, 140 mM; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; EGTA 0.05 mM; pH aangepast aan 7.2 met CsOH. (A en B) Met agarose 3M KCl-brug. (A) een representatieve ik-V relatie voor de huidige VDCCL en de effecten van vloeistofstromen. (B) samenvatting van de vloeistof effecten op de ik-V relatie van VDCCL stromingen. (C en D) Zonder agarose 3M KCl overbruggen. (C) ik-V relaties van de stromingen van VDCCL . (D) samengevat ik-V relaties van de piek VDCCL stromingen in de afwezigheid en aanwezigheid van vloeistofstromen. De vormen van spanning stappen voor het opwekken van VDCCL stromingen worden weergegeven in het verzonken vlak van de figuur. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Overzicht van effecten van vloeistofstromen op liquid-metal kruising potentiële tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode en schatting van echte Cl- -concentratie in de ongemengde laag grenzend aan de referentie-elektrode van de gemeten junction potentieel. (A) A representatieve tracering van eventuele veranderingen van de kruising te wijten aan verschillende tarieven van vloeistofstromen (bovenste deelvenster). Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie11. De kruising potentieel-vloeistof stroom tarief relatie (n = 5). (B) bovenste deelvenster: vertegenwoordiger opname van junction potentiële veranderingen als gevolg van verschillende concentraties van NaCl oplossingen. Lagere paneel: de semi-logaritmisch plot van de kruising potentieel-[Cl-] relatie (n = 5). De rechte lijn in het rood vertegenwoordigt de beste pasvorm door een gemodificeerde Nernst-vergelijking voor evenwicht potentiële met een tienvoudige helling van 49 mV. Als gevolg van de eindige selectiviteit van nb+, vergeleken met die van Cl-, voor het genereren van de vloeistof/metaal-kruising potentieel, de waarde van de helling van 49 mV, in plaats van 58 mV, geproduceerd van de beste pasvorm in de kruising potentieel-[Cl-] relatie op kamer temperatuur. De 49-mV-helling geeft aan de Cl- afhankelijkheid (of selectiviteit) van de Ag/AgCl referentie-elektrode > 95% over de andere ion (in dit geval, nb+), volgens de vergelijking van de spanning Goldman-Hodgkin-Katz. Een verschuiving van 7 mV bij een concentratie van de Cl- van 150 mM geeft een daling van ~ 30% in de Cl- -concentratie. (C) een representatieve tracering van kruising potentieel in verschillende concentraties van NaCl oplossingen met een gebruik van 3 M KCl agarose brug (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: schematische van de gevolgen van convectie model van vloeistofstromen voor de ion concentraties grenzend aan de open kanalen tijdens ion huidige flux. (A) onder statische omstandigheden met weinig convectieve transport van ionen in de oplossing met elektrisch veld het K+ -ion flux door K+-selectieve ionenkanalen kunnen leiden tot een afname van de concentraties van K+ in de microdomain naast de inlaat van kanaal. (B) vloeistofstromen kunt convectively herstellen voor de afname van de concentratie van K+ grenzend aan de inlaat van de open kanaal. (C) effect van vloeistofstromen op de innerlijke gelijkrichter Kir2.1 kanaal stromingen. Vloeistofstromen verhoogd onmiddellijk de Kir2.1 stromingen. De vorm van de spanning-stap wordt weergegeven in het verzonken vlak van de figuur. De stromingen van de Kir2.1 werden opgenomen met behulp van hoge K+-Baden en -pipet oplossingen. Baden oplossing: 148.4 mM KCl, 0.33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0.5 mM MgCl2,2CaCl 1,8 mM, 11 mM D-glucose; pH aangepast aan 7.4 met NaOH. Pipetteer oplossing: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethyl)-N, N, N', N',-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA), pH 7,2 (aangepast met KOH). Omdat RBL - 2H 3 cellen zeer gevoelig voor hypo-osmotische zwelling zijn en daaruit voortvloeiende trekker van volume-geactiveerde Cl- stromingen, 38 mM sacharose is toegevoegd aan de Baden-oplossing aanpassen voor osmolariteit te voorkomen zwelling van de cel. Bovendien, een Cl- kanaal blocker [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic zuur (DIDS, 30 µM)] toevoegde aan de oplossing van de pipet voor het elimineren van verontreiniging door Cl- stromingen. Deelvenster C is gewijzigd van een eerdere publicatie10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit onderzoek aangetoond we een methode voor het meten van echte Cl- -concentratie in de ongemengde laag grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode door bepaling van de potentiële vloeistof-metaal-kruising met een open patch-clamp pipet gevuld met een hoge KCl concentratie. De veranderingen in de concentratie van de Cl- in de grenslaag kan resulteren in een verschuiving van kruising potentieel Wanneer overschakelen van statisch naar vloeistof-stromingscondities. Eenvoudig met behulp van een agarose KCl brug tussen de referentie-elektrode en Baden vloeistof kan voorkomen dat de Cl- concentratie-gerelateerde fouten of artefacten tijdens het patch-clamp opnemen.

Naast de nadruk op het belang van een agar of agarose zoutbrug, is een andere toepassing van deze methode bij het schatten van echte ion concentratie in de ongemengde grenslaag als volgt. Omdat plasmalemmal ionenkanalen kunnen functioneren als ion-Ionselectieve electroden (net als de Ag/AgCl-elektrode functies zoals een elektrode Cl- ), de echte ion-concentratie in de ongemengde grens laag grenzend aan de inlaat van kanaal op de celmembraan oppervlak kan afwijken van de gemiddelde concentratie van de vloeistof van de bulk. Dit verschil in ion concentratie tussen de bulk vloeistof en ongemengde laag grenzend aan het celmembraan is de echte scenario onder klinische instellingen en moet worden onderscheiden van de biologische modulatie van kanaal gating vloeistof stroom/schuifspanning gewapenderhand. Helaas, in tegenstelling tot de ongemengde laageffect tussen de Ag/AgCl-elektrode en Baden vloeistof, we niet worden opgelost de ongemengde laageffect grenzend aan het oppervlak van de celmembraan bij de studie van de regulering van de ionenkanalen vloeistof stroom/schuifspanning gewapenderhand.

Echter, gezien de opmerking dat echte ion concentratie in de ongemengde laag ongeveer 70% van die in bulk vloeistof (Figuur 3 is), kunnen we enkele amendementen in de experimentele gegevens te onderscheiden van de biologische modulatie van ionenkanalen van de "elektrochemische fenomeen van ongemengde laageffect". De echte ion-concentratie in de ongemengde laag aan de oppervlakte van de celmembraan werd verwacht dat ongeveer 70% van de gemiddelde concentratie van de oplossing in een recente studie10Baden bulk. Aangezien vloeistofstromen hersteld de verminderde ion concentratie, vergemakkelijkt het de huidige onafhankelijk van cellulaire signalering van10Kir2.1. In onze eerdere studie, stroomdichtheid was aanzienlijk hoog (2,5 A / m2) met een hoge extracellulaire K+ concentratie en hoge uitdrukking van Kir2.1 in RBL cellen10. In het geval van echte celmembranen met verschillende ion kanaal stroomdichtheid amplitudes, kan de ongemengde laageffect op het oppervlak van de celmembraan hangen echter sterk de amplitude van ion kanaal stroomdichtheid. Bovendien, dit kan veroorzaken sommige ion kanaal stromingen (vooral die met relatief lagere stroom dichtheden) zijn ongevoelig voor vocht-flow verordening; Hoewel de ongemengde laageffect elektrochemisch en niet biologisch is geregeld. Dus, kan dit invloed hebben op de hier beschreven techniek. Daarom, de mogelijkheid van het ontwikkelen van een kwantitatieve methode die voldoende is voor experimentele resultaten te corrigeren moet worden onderzocht in de toekomst studies.

In Figuur 3vastgesteld we hebben dat liquid-metal kruising potentieel tussen de Ag/AgCl-elektrode en Baden vloeistof sterk afhankelijk van de conditie van de Ag/AgCl-elektrode was. In feite, toen de Ag/AgCl-elektrode was perfect in staat, veranderingen in de kruising potentieel als gevolg van vloeistofstromen was minimaal (gegevens niet worden weergegeven). Nochtans, arme chlorering van de Ag/AgCl-elektrode veroorzaakt een grotere verschuiving van het kruispunt dat potentiële. Altijd aangezien de Ag/AgCl-elektrode zeer gevoelig voor verschillende externe stimuli, zoals ultraviolet licht en oxidatieve stress is, een agar of agarose KCl brug wordt aanbevolen gebruiken. Hoewel de veranderingen in de kruising potentieel door vloeistof stroom tussen Baden vloeistof en de referentie-elektrode is een potentiële bron van de fout, we met succes de echte ion-concentraties in de ongemengde grenslaag geschat door het meten van de verschuiving van de kruising potentieel onder verschillende vloeistof-debiet (figuur 3A en 3B).

Het kritieke punt in stap 4 voor het voorbereiden van de standaard curve voor de schatting van echte Cl- -concentratie in de ongemengde grens lagen van de verschuiving van kruising potentieel is dat de standaard curve moet worden geregistreerd onder een voldoende debiet (30 mL / min in dit experiment). Hoewel dit debiet zeer snel is, in concrete gevallen sneller de vloeistof, hoe kleiner de daling van de concentratie is bij de grens lagen (Figuur 3). Bovendien moet de open pipet met hoge KCl, in plaats van een regelmatige Pipetteer oplossing, om een patch-clamp studie om te voorkomen dat de verandering in de kruising tussen een pipet en Baden oplossing potentiële worden gevuld.

De shear kracht in de instelling van de patch-clamp kan uit de volgende relatie11worden geschat:

Τ = (6μQ) / (bh2) (vergelijking 2)

Waar: τ is de schuifspanning (N/cm2); Μ is de viscositeit (0,001 N m/s2 voor water bij 20 ° C); Q is de vloeistof stroomsnelheid (m3/s); b is de kamer breedte (m); en h is de hoogte van de zaal (m). Wanneer de vloeistofstromen dan 30 mL/min bedraagt, wordt de kracht van de schuintrekken in het patch-kamer afgebeeld in Figuur 1 geschat op ~0.75 dyn/cm2 volgens de bovenstaande vergelijking. Dit is een lage schuintrekken kracht niveau in vergelijking met de kracht van de fysiologische schuintrekken; endotheliale cellen in bloedvaten kunnen worden onderworpen als u wilt schuintrekken krachten van maximaal 40 dyn/cm18,19. Dus, mits de ionenkanalen niet gevoelig zijn voor het schuintrekken krachten minder dan 0,75 dyn/cm2, we kunnen bestuderen de vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid van ionenkanalen na exclusief het ongemengde grenslaag effect door de voorwaarde van controle naar 0,75 dyn/cm2. Echter, sommige ionenkanalen, met inbegrip van Kir2.1, lijken te zijn gevoelig voor het schuintrekken krachten minder dan 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6.

De ongemengde laageffect werd oorspronkelijk voorgesteld door Barry en collega's12,13,14,15. Wij bieden hier een methode voor het schatten van echte ion concentratie in de ongemengde laag door het meten van veranderingen in de kruising potentieel met open patch-clamp pipet. Wij stellen ook voor dat dit ongemengde grenslaag effect aan vloeistof stroom-geïnduceerde verordening van ion kanaal stromen bijdragen kan en moet worden beschouwd, terwijl het bestuderen van de vloeistof stroom-mechanosensitivity van ionenkanalen. Echter, op basis van deze hypothese, het kan worden gevraagd waarom sommige ion kanaal stromingen zijn niet gevoelig voor vloeistof stroom-afhankelijke verordening als het ongemengde grenslaag effect een elektrochemische is in plaats van biologische bestrijding. Als kort aan de orde komen boven is dit waarschijnlijk omdat alleen ion stromen via kanalen met grote genoeg eenkanalig geleidingsvermogen en lang genoeg open-tijd kan worden vergemakkelijkt door vloeistofstromen. Dat wil zeggen, voor de vaststelling van de ongemengde laag waarin de concentratie van de ion van het gemiddelde in bulk oplossing afwijkt, flux in de membraan-fase moet worden snel genoeg vergeleken met dat in de waterige fase14. We hebben onlangs gesuggereerd dat de huidige via Kir2.1 kanalen, waarvan de geleidbaarheid en de open tijd voldoende hoog zijn, wordt bevorderd door vloeistofstromen via mechanismen van convectie restauratie van ion concentratie in de ongemengde grenslaag van celmembraan oppervlakte11.

Tot slot presenteren we een methode voor het meten van ion concentratie in de ongemengde grenslaag grenzend aan het referentie-elektrode en celmembraan oppervlak met een open patch-clamp pipet. Naast wijzend op het belang van een agarose KCl brug, biedt deze methode ook een manier om de rekening voor de ongemengde laageffect terwijl vloeistof stroom/schuifspanning kracht controle van ionenkanalen interpreteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door de Pioneer Research Center Program (2011-0027921), door fundamentele wetenschap onderzoeksprogramma's (2015R1C1A1A02036887 en NRF-2016R1A2B4014795) door de National Research Foundation Korea gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & Toekomst Planning, en door een subsidie van de Korea Health Technology R & D Project via de Korea gezondheid industrie Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van gezondheid & welzijn, Republiek Korea (HI15C1540).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RC-11 open bath chamber Warner instruments, USA W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet World Precision Instruments, USA EP1
Agarose Sigma-aldrich, USA A9793
Voltage-clamp amplifier HEKA, Germany EPC8
Voltage-clamp amplifier Molecular Devices, USA Axopatch 200B
Liquid pump KNF Flodos, Switzerland FEM08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
  2. Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
  3. Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
  4. Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
  5. Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
  6. Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
  7. Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
  8. Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
  9. Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
  10. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
  11. Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
  12. Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
  13. Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
  14. Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
  15. Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
  16. Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
  17. A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
  18. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
  19. Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).

Tags

Biochemie kwestie 143 vloeistofstromen schuintrekken kracht ongemengde laag patch-clamp Ag/AgCl-elektrode vloeistof/metaal-kruising potentieel convectie ionkanaal
Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. G., Park, S. W., Shin, K.More

Kim, J. G., Park, S. W., Shin, K. C., Kim, B., Byun, D., Bae, Y. M. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. J. Vis. Exp. (143), e58228, doi:10.3791/58228 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter