Summary
Mechanosensitive Ionkanaler er ofte studerede i form af væske flow/shear kraft følsomhed med patch-clamp optagelse. Dog afhængig af forsøgsplan, kan resultatet på væske flow-forordninger af Ionkanaler være fejlagtig. Her, leverer vi metoder til at forebygge og rette sådanne fejl med et teoretisk grundlag.
Abstract
Flydende flow er et vigtigt miljømæssige incitament, der styrer mange fysiologiske og patologiske processer, såsom flydende flow-induceret vasodilation. Selv om de molekylære mekanismer for den biologiske reaktioner på væske flow/shear kraft ikke er fuldt forstået, kan fluid flow-medieret regulering af ion kanal gating bidrage kritisk. Derfor, fluid flow/shear kraft følsomhed af Ionkanaler er blevet undersøgt ved hjælp af patch-clamp-teknik. Dog afhængig af forsøgsplan, kan resultaterne og fortolkningen af data være fejlagtig. Vi præsenterer her, eksperimentelle og teoretiske dokumentation for væske flow-relaterede fejl og give metoderne til estimering og forebygge disse fejl rettes. Ændringer i krydset potentielle mellem Ag/AgCl referenceelektrode og badning væske blev målt med en åben pipette fyldt med 3 M KCl. flydende flow kan derefter skifte væske/metal junction potentielle til ca. 7 mV. Omvendt, ved at måle spænding Skift induceret af væskestrøm, vi skønnet ion koncentrationen i unstirred grænselag. I statisk tilstand, kan de virkelige ion koncentrationer støder op til den Ag/AgCl reference elektrode eller ion-kanal indløb på cellemembranen overfladen nå så lav som ca 30% af det i flow tilstand. Placere en Agarosen 3 M kan KCl bro mellem badning væske og reference elektrode have forhindret dette problem af krydset potentielle skiftende. Unstirred lageffekt støder op til cellemembranen overfladen kunne imidlertid ikke fastsættes på denne måde. Her, leverer vi en metode til måling af virkelige ion koncentrationer i unstirred grænselag med en åben patch-clamp pipette, understreger betydningen af at anvende en Agarosen salt-broen samtidig studerer væske flow-induceret regulering af ion strømninger. Derfor, denne nye fremgangsmåde, som tager hensyn til de reelle koncentrationer af ioner i unstirred grænselag, kan give nyttig indsigt på eksperimentelle design og data fortolkning relateret til fluid shear stress regulering af Ionkanaler .
Introduction
Flydende flow er en vigtig miljømæssige cue, der styrer mange fysiologiske og patologiske processer såsom flydende flow-induceret vasodilatation og væske shear kraft-afhængig vaskulære remodellering og udvikling1,2, 3,4,5. Selv om de molekylære mekanismer for den biologiske reaktioner på væskestrøm shear kraft ikke er fuldt forstået, menes det, at væske flow-medieret regulering af ion kanal gating kritisk kan bidrage til væske flow-induceret svar5 , 6 , 7 , 8. For eksempel aktivering af i endothelial indad ensretter Kir2.1 og Ca2 +-aktiverede K+ (KCa2,3, KCNN3) kanaler efter Ca2 + tilstrømning af flydende flow er blevet foreslået for at bidrage til væske flow-induceret vasodilation6,7,8. Derfor, mange Ionkanaler, især mekanisk aktiveret eller -hæmmet kanaler, er blevet undersøgt med hensyn til væske flow/shear kraft følsomhed med patch-klemme teknik6,9,10 , 11. afhængigt af forsøgsplan udføres under patch-clamp optagelse, resultaterne og fortolkningen af data på væske flow-forordninger af Ionkanaler kan dog fejlagtige10,11.
En kilde af væske flow-induceret artefakter i patch-clamp optagelse er fra krydset potentielle mellem bad væske og Ag/AgCl reference elektrode11. Det menes, at væske/metal krydset potentielle mellem badning væske og Ag/AgCl-elektrode er konstant som Cl- koncentration af badning væsken holdes konstant, i betragtning af den kemiske reaktion mellem badning løsning og Ag/AgCl-elektrode til at være:
AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (ligning 1)
Men i tilfælde hvor den samlede elektrokemiske reaktion mellem badning løsning og Ag/AgCl referenceelektrode (ligning 1) provenuet fra venstre til højre, Cl- koncentration af badning væske støder op til Ag/AgCl reference elektrode (unstirred grænselag12,13,14,15) kan være meget lavere end i hovedparten af badning løsning, medmindre nok convectional transport er sikret. Ved hjælp af en gammel eller ikke-ideelle Ag/AgCl-elektrode med utilstrækkelig chlorering af Ag kan øge denne risiko. Denne væske flow-relaterede artefakt på referenceelektrode, faktisk kan udelukkes ved blot at placere en konventionel Agarosen-salt bro mellem badning væske og reference elektrode, da artefakt er baseret på ændringer i det virkelige Cl- koncentration ved siden Ag/AgCl-elektrode11. Protokollen præsenteret i denne undersøgelse beskriver hvordan man forebygger flow-relaterede junction potentielle ændringer og måle reelle ion koncentrationer i unstirred grænselag.
Efter at placere en Agarosen KCl bro mellem badning væske og Ag/AgCl referenceelektrode, der er en anden afgørende faktor, der bør overvejes: bare som reference Ag/AgCl-elektrode fungerer som en Cl- elektrode, ionkanaler også kan fungere ligesom en ion-selektiv elektrode. Situationen for en unstirred grænselag mellem badning væske og Ag/AgCl referenceelektrode opstår under bevægelse af ioner mellem de ekstracellulære og intracellulære løsninger gennem Ionkanaler membran. Dette indebærer, at forsigtighed bør anvendes, når tolkning regulering af ion-kanaler af flydende flow. Som omtalt i vores tidligere studie11, bevægelse af ioner gennem en løsning, hvor en elektrokemisk gradient er til stede kan ske via tre forskellige mekanismer: diffusion, migration og konvektion, hvor diffusion er bevægelsen induceret af koncentration gradient, migration er den bevægelse drevet af elektrisk gradient, og konvektion er bevægelse gennem væske-flow. Blandt disse tre transportmekanismer bidrager konvektion tilstand mest til bevægelse af ioner11 (> 1.000 gange større end diffusion eller migration under sædvanlige patch-clamp indstillinger). Dette udgør den teoretiske basis for hvorfor junction potentielle mellem badning væske og Ag/AgCl referenceelektrode kan meget under forskellige statiske og væske-flow betingelser11.
Ifølge hypotesen ovenfor foreslåede, nogle facilitatory effekter af flydende flow på ion-kanal nuværende kan udledes af den konvektive restaurering af virkelige ion koncentrationer støder op til kanalen indløb på membranen overflade (unstirred grænselag) 10. I dette tilfælde væske flow-induceret virkningerne på ion-kanal strøm er simpelthen opstået fra elektrokemiske begivenheder, ikke fra regulering af ion kanal gating. En lignende idé blev tidligere foreslået af Barry og kolleger12,13,14,15 baseret på strenge teoretiske overvejelser og eksperimentelle bevismateriale, også kendt som det unstirred lag eller transport nummer effekt. Hvis nogle Ionkanaler har tilstrækkelig kan enkelt kanal ledningsevne og åben tid længe nok til at give tilstrækkelig transport satser gennem kanaler (en hurtigere transport sats i membranen end i unstirred membranen overflade), en grænselag effekt opstå . Således kan konvektion-afhængige transport bidrage til de endelige væske-flow-induceret lettelser af ion aktuelle10,12,13,14,15.
I denne undersøgelse, vi understrege betydningen af at anvende en agar eller Agarosen salt-broen samtidig studerer væske-flow-induceret regulering af ion strømninger. Vi tilbyder også en metode til måling af virkelige ion koncentrationen i den unstirred støder op til Ag/AgCl reference elektrode og membran Ionkanaler grænselag. Desuden, den teoretiske fortolkning af væske flow-induceret graduering af ion-kanal strøm (dvs. konvektion hypotese eller unstirred lag transport nummer effekt) kan give værdifuld indsigt for at designe og fortolke undersøgelser på shear kraft-reguleringen af Ionkanaler. Ifølge unstirred grænselag transport nummer virkning forudsige vi, at ion-kanal strømme gennem alle typer af membran Ionkanaler kan lettes ved væskestrøm, uafhængigt af deres biologiske følsomhed over for flydende flow shear kraft, men kun hvis Ionkanaler har tilstrækkelig enkelt kanal ledningsevne og længe åbent. Højere ion-kanal strømtætheder kan øge unstirred grænselag effekt på cellemembranen overflade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer Konkuk University.
1. Agarosen Salt broer mellem bad løsning og Ag/AgCl referenceelektrode
Bemærk: Agarosen 3M KCl salt broer er fremstillet som tidligere beskrevet12 med mindre variationer.
- Dannelsen af broer
- Bøje brand glas kapillarrør for at danne en U-form som passende. Den indvendige diameter af kapillærerne bør være stor nok til at reducere serie modstand, når du optager store ion strømninger. Rør med en indvendig diameter på 2-5 mm er normalt acceptabel.
- Forberedelse af Agarosen 3 M KCl-opløsning
- Forberede 100 mL 3 M KCl-opløsning (1 M eller 2 M er også acceptabel).
- Vej 3 g af agarosegelelektroforese.
- Opløse Agarosen i 100 mL af KCl (dvs. 3% Agarosen) på en varmeplade mellem 90 og 100 ° C.
- Lastning broer med 3 M KCl Agarosen
- Fordyb U-formet glas broer i Agarosen-KCl løsning for nem pålæsning.
Bemærk: Det er let at grave ud glas broer hvis Agarosen-KCl løsning er indeholdt i en lavvandet og bred container. - Holde dem natten over ved stuetemperatur (RT) for Agarosen at indstille og hærde.
- Omhyggeligt grave ud Agarosen-KCl-loaded glas broer fra sæt/hærdet Agarosen saltindhold.
- Fordyb U-formet glas broer i Agarosen-KCl løsning for nem pålæsning.
- Lagring af broerne
- Forberede nok volumen (dvs. 500 mL) 3 M KCl-opløsning i en bred hals flaske.
- Gemme de forberedte Agarosen-salt broer i flaske i køleskab.
2. anvendelsen af flydende Flow Shear kraft til celler i en Patch-fastspænding kammer
Bemærk: Et skematisk diagram over den patch-clamp eksperimentelle set-up er vist i figur 1.
- Sted en container fyldt med badning løsning (volumen og højde allerede bør måles) ovenfor lappe-klemme kammeret.
- Fyld patch-klemme kammeret med badning løsning ved sugning røret.
- For at stoppe den væskestrøm, klip røret på container's side at blokere den flydende flow, så klip røret på sugesiden at stoppe suge på samme tid. Dette er betingelsen "stationære" kontrol.
- For at anvende flydende flow shear kraft, skal du åbne begge rør på beholder og suge sider på samme tid.
- Før eller efter påføring af væske flow shear kraft til cellen, måle strømningshastigheden i mL/min.
- Beregne strømningshastigheden ved at måle fald i væske volumen over en given tid.
- Fra den målte strømningshastighed og geometri (struktur) for badning afdeling, bør den shear kraft cellen af de flydende flow vurderes (Se diskussion sektion).
- Alternativt, du kan styre strømningshastighed (for trin 2,3-2,6), bruge en perfusion pumpe. I dette tilfælde være omhyggelig med at sikre en konstant snarere end en pulsatile flow.
3. måling af ændringer i væske-Metal Junction potentiale af flydende Flow mellem bad løsning og Ag/AgCl referenceelektrode (figur 3A)
- Bruge Ag/AgCl-elektrode eller pellet, der er tilgængelige fra de færdiglavede produkter, uden Agarosen salt broen.
- Forberede en normal fysiologisk salt saltvand til badning kammer (f.eks.143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucose, og pH justeret til 7.4 med NaOH).
- Placer en patch pipette indeholdende en 3 M KCl løsning i salen til at minimere junction potentielle Skift mellem pipette og badning løsninger.
- Lave spænding-clamp forstærkeren til den aktuelle klemme tilstand ("jeg = 0" eller "CC").
- Efter ophæve den oprindelige offset potentiale, måles ændringer i spænding induceres ved forskellige strømningshastigheder.
- For at kontrollere, at ændringer i spænding væske/metal junction potentialer, igen undersøge effekten af flydende flow på krydset potentiale ved hjælp af Agarosen-salt broen mellem bad løsning og Ag/AgCl-elektrode.
4. eksperimentelle estimering af virkelige Cl- koncentration i Unstirred lag støder op til Ag/AgCl-elektrode Under statisk tilstand (figur 3B)
- Fra resultaterne af trin 3, tegne junction potentiale-strømningshastighed relationer og anslå maksimal (mætte) værdien af krydset potentielle skift af den supra-væske flow.
- Forberede opløsninger med forskellige koncentrationer af Cl (dvs. 50, 99, 147, 195 og 288 mM af NaCl).
- Ved at ændre Cl- koncentration i badning væske, tegne junction potentielle-[Cl-] forholdet. Bemærk, at den væske sats bør være konstant og tilstrækkelig høj (> 30 mL / min.) at forhindre fald i Cl- koncentration som i den tilstødende Ag/AgCl-referenceelektrode.
- Fra to forhold kurverne, vurdere ændringer i Cl- koncentration fra den målte junction potentielle Skift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele celle spænding-afhængige L-type Ca2 + -kanal (VDCCL) strømninger blev registreret i enzymatisk spredte rotte mesenteriallymfeknuderne arteriel myocytes, som tidligere beskrevet11. De arterielle myocytes var dialysebehandling med en Cs-rige pipette løsning under konfigurationen af nystatin-perforeret med divalent kation-fri badning opklaring hen til lette den aktuelle flow gennem VDCCL11,16. Kort depolariserende spænding ramper eller spænding trin, på en bedrift potentiale -70 mV, blev anvendt til at fremkalde VDCCL strømninger. En repræsentativ nuværende spænding (jeg-V) forholdet i VDCCL i fravær og tilstedeværelsen af flydende flow (5 mL/min. eller ca 0,004 m/s), indspillet med en Agarosen KCl bridge, er vist i figur 2A. Flydende flow steget en smule VDCCL aktuelle i en spænding-uafhængig måde. Denne lette effekt af flydende flow på VDCCL nuværende er sammenfattet i figur 2B.
Spænding-uafhængig lettelse af VDCCL nuværende af flydende flow er en ordentlig svar af VDCCL væske eller shear Force. 5 mL/min. eller ca 0,004 m/s af flydende flow i den aktuelle opsætning af eksperimentelle blev anslået til at repræsentere ca 0,1 dyn/cm2 for shear kraft (Se diskussion). Men når Ag/AgCl reference elektrode var direkte forbundet med badning væske uden en Agarosen KCl bro, jeg-V forholdet i overværelse af flydende flow flyttet til højre sammenlignet med VDCCL strømme under en statisk tilstand (figur 2 c og 2D). Dette resulterede i hæmning af VDCCL nuværende på negative spændinger og lettelse af VDCCL nuværende på mere depolariseret eller positive potentialer. Dette eksemplificerer den væske flow-induceret artefakt i patch-clamp optagelse som en spænding skift af jeg-V relationen ikke skyldtes en ændring af kanal gating men var faktisk på grund af en krydset potentielle Skift mellem badning væske og Ag/AgCl reference elektrode11. Direkte bevis for væske flow-induceret junction potentielle Skift er vist i figur 3.
Krydset potentielle forskydninger blev målt efter trin 3. Ændringerne, som følge af væskestrøm, blev målt ved hjælp af en åben pipette fyldt med 3 M KCl, som tidligere beskrevet11. Med en åben pipette fyldt med 3 M KCl, krydset potentielle mellem pipetten og badning løsninger kunne minimeres, og de potentielle ændringer på grund af flydende flow var primært fra badning løsning og Ag/AgCl referenceelektrode. Uden en Agarosen 3 M KCl bro mellem badning væske og Ag/AgCl referenceelektrode, flydende flow flyttet potentielle krydset mellem væske og Ag/AgCl-elektrode i en væskestrøm sats-afhængige måde (figur 3A). Den maksimale junction potentielle ændring blev ekstrapoleret for at være ~ 7 mV fra krydset potentiale-væske flow forhold (figur 3A, nederst). Derimod når Agarosen 3 M KCl broen blev brugt, flydende flow ikke ændrede krydset potentielle mellem badning væske og reference elektrode (sammenfattet i nederste graf på figur 3A, nederst).
For at måle koncentrationen forskelle mellem statisk og væske flow betingelser, i hvilke nok konvektion virkningsmekanismer er funktionel, undersøgte vi effekten af at ændre Cl- koncentrationer på badning væske-Ag/AgCl-elektrode krydset potentielle henhold til trin 4. Cl- koncentration flyttet krydset potentiale i en koncentration-afhængige måde (figur 3B, top) ligesom væskestrøm flyttet krydset potentiale i et sats-afhængige måde. Ved hjælp af KCl Agarosen bro, var krydset potentiale forhindret i at ændre i en Cl- koncentration-afhængige måde (figur 3 c), der angiver, at krydset potentielle ændring opstod mellem bad løsning og reference elektrode, ikke mellem bad og pipette løsningerne. Den semi-log plot af krydset potentiale-[Cl-] forholdet er vist i det nederste panel af figur 3B. Ifølge resultaterne i figur 3B, ekstrapoleret maximal værdien af ~ 7 mV i krydset potentielle Skift (fra figur 3A) tyder på, at Cl- koncentration støder op til Ag/AgCl-referenceelektrode falder til ~ 70% af den gennemsnitlige koncentration af bulk badning væske når væske flow er fraværende (figur 3B, nederst).
I vores tidligere undersøgelse, blev Kir2.1 strømninger rapporteret at lettes af flydende flow af convectively genoprette (stigende) [K+] på kanal inlet10. Denne idé udspringer af fænomener opstår mellem badning væske og Ag/AgCl-elektrode, som Kir2.1 Kanalen kan fungere som en K+ elektrode ligesom Ag/AgCl-elektrode funktioner som en Cl- elektrode. Denne idé illustreres skematisk i figur 4A og 4B. Et repræsentativt eksempel på væske flow-induceret lettelse af Kir2.1 strømme er vist i figur 4 c. Kir2.1 strømninger blev fremkaldt af et hyperpolarizing spænding skridt af en bedrift potentiale fra 0 -100 mV i rotte baserig leukæmi (RBL) celler. Anvendelse af flydende flow (5 mL/min. eller 0,004 m/s) øget let Kir2.1 strøm (figur 4 c). Denne lettelse af flydende flow blev tidligere foreslået at være medieret af cellulær signalering men af den elektrokemiske effekt af konvektive transporter af K+ ioner til unstirred grænselag10.
Figur 1: skematisk viser opsætningen af badning kammer til væske-flow regulering af Ionkanaler i patch-clamp optagelse. Nederste panel er visningen side (sagittal sektion) af patch-klemme kammeret. Det opsummerer sti af flydende flow og placeringer af en studerede celle, elektroder og indløb/udløb af væsken. Fordi væsken er løbende pumpes ud gennem outlet rør af suge, bevares højden af væsken i salen på et forholdsvis konstant niveau. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Effekter af væske flow på L-type spænding-afhængige Ca2 + -kanal (VDCCL) strømme med og uden Agarosen 3 M KCl bridge. VDCCL strømninger blev registreret i enzymatisk spredte rotte mesenteriallymfeknuderne arteriel myocytes med nystatin perforeret patch-clamp optagelse. Normal tyrode fysiologiske saltopløsning med 4,2 mM EDTA uden divalent kationer blev brugt som badning løsning11. Pipette løsning indeholdt CsCl, 140 mM; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; EGTA 0,05 mM; pH justeret til 7,2 med CsOH. (A og B) Med Agarosen 3M KCl-broen. A en repræsentant, jeg-V forhold for VDCCL aktuelle og virkningerne af flydende flow. (B) Resumé væske virkninger på jeg-V forhold af VDCCL strømninger. (C og D) Uden Agarosen 3M KCl broen. (C) jeg-V relationer af VDCCL strømninger. (D) sammenfattet jeg-V relationer af peak VDCCL strømninger i fravær og tilstedeværelsen af flydende flow. Figurer af spænding trin for at fremkalde VDCCL strømme er vist i figur indsatser. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkningerne af flydende flow på flydende-metal junction potentielle mellem badning væske og Ag/AgCl reference elektrode og estimering af virkelige Cl- koncentration i unstirred lag støder op til referenceelektrode fra den målte junction potentiale. (A) A repræsentative sporing af krydset potentielle ændringer som følge af forskellige satser for flydende flow (øverste panel). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation11. Krydset potentiale-væske flow hastighed forholdet (n = 5). (B) øverste panel: repræsentant optagelse af krydset potentielle ændringer som følge af forskellige koncentrationer af NaCl løsninger. Nederste panel: den semi-log plot af krydset potentiale-[Cl-] forholdet (n = 5). Den lige linje i rødt repræsenterer den bedste pasform af en modificeret Nernst-ligningen for ligevægt potentiale med en billeddetaljerne skråning af 49 mV. På grund af Na+, sammenlignet med Cl-, til at generere væske/metal krydset potentielle, finite selektivitet værdien hældning af 49 mV, i stedet for 58 mV, produceret den bedste pasform i krydset potentiale-[Cl-] forholdet på værelse temperatur. 49-mV hældningen angiver Cl- afhængighed (eller selektivitet) Ag/AgCl reference elektrode > 95% over de andre ion (i dette tilfælde, Na+), efter Goldman-Hodgkin-Katz spænding ligning. Et skift af 7 mV på en Cl- koncentration af 150 mM angiver et fald af ~ 30% i Cl- koncentration. C en repræsentant sporing af krydset potentiale i forskellige koncentrationer af NaCl løsninger med anvendelse af 3 M KCl Agarosen bro (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk af virkningerne af konvektionsovn model af flydende flow på ion koncentrationer støder op til de åbne kanaler under ion aktuelle flux. (A) under statiske betingelser med lille Konvektiv transport af ioner i opløsningen med elektrisk felt, K+ ion flux gennem K+-selektiv Ionkanaler kan forårsage et fald i K+ koncentrationer i microdomain støder op til den kanal indløb. B flydende flow kan convectively genoprette faldet i K+ koncentration støder op til åben kanal indløb. (C) virkning af flydende flow på indadgående ensretter Kir2.1 kanal strømninger. Flydende flow øges straks Kir2.1 strømninger. Form af trinnet spænding er vist i figur indsatser. Kir2.1 strømninger blev registreret ved hjælp af høj K+-badning og -pipette løsninger. Badning løsning: 148,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glucose; pH justeret til 7.4 med NaOH. Afpipetteres løsning: 135 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 mM Mg-ATP, 10 mM HEPES, 5 mM ethylenglycol-bis (2-aminoethyl)-N, N, N', N',-tetraacetic syre (EGTA), pH 7,2 (justeret med KOH). Da RBL - 2H 3 celler er stærkt modtagelige for hypo-osmotisk hævelse og deraf følgende udløser af volumen-aktiveret Cl- strømninger, 38 mM saccharose blev føjet til badning løsning til at justere for osmolaritet og forhindre cell hævelse. Desuden blev en Cl- kanal blokker [4, 4'-diisothiocyano-2, 2'-stilbenedisulfonic syre (DIDS, 30 µM)] føjet til pipette løsning til at fjerne enhver form for kontaminering af Cl- strømninger. Panelet C er blevet ændret fra en tidligere publikation10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse viste vi en metode til at måle reelle Cl- koncentration i unstirred lag støder op til Ag/AgCl-referenceelektrode ved at bestemme flydende-metal krydset potentielle med en åben patch-clamp pipette fyldt med en høj KCl koncentration. Ændringen i Cl- koncentration i troposfærens kan resultere i en forskydning af krydset potentiale ved skift fra statisk til væske-flow betingelser. Blot at bruge en Agarosen KCl bro mellem referenceelektrode og badning væske kan forhindre Cl- koncentration-relaterede fejl eller artefakter under patch-clamp optagelse.
Udover understreger betydningen af en agar eller Agarosen salt bro, er en anden anvendelse af denne metode i estimeringen af virkelige ion koncentration i unstirred grænselag som følger. Fordi plasmalemmal Ionkanaler kan fungere som ion-selektiv elektroder (lige som de Ag/AgCl elektrode funktioner som en Cl- elektrode), den virkelige ion koncentration i unstirred grænse lag støder op til kanalen indløb på cellemembranen overfladen kan være forskellig fra den gennemsnitlige koncentration af bulk væske. Denne forskel i ion koncentration mellem hovedparten væske og unstirred lag støder op til cellemembranen er den virkelige scenario under kliniske indstillinger og bør adskilles fra den biologiske graduering af kanal gating af væske flow/shear kraft. Desværre, i modsætning til unstirred lag virkningen mellem Ag/AgCl referenceelektrode og badning væske, kan vi fastsætte unstirred lageffekt støder op til cellemembranen overfladen når man studerer regulering af Ionkanaler af væske flow/shear kraft.
Men, i betragtning af den observation at virkelige ion koncentration i det unstirred lag er ca 70% af det i bulk væske (figur 3), vi kan gøre nogle ændringsforslag i den eksperimentelle data til at skelne den biologiske graduering af Ionkanaler fra "elektrokemisk fænomen unstirred lageffekts". Den virkelige ion koncentration i det unstirred lag på cellemembranen overfladen var forventes at være ca 70% af den gennemsnitlige koncentration af bulk badning løsning i en nylig undersøgelse10. Da væskestrøm restaureret nedsat ion koncentration, lettere det Kir2.1 nuværende uafhængigt af cellulær signalering10. I vores tidligere undersøgelse, strømtæthed var betydeligt høj (2,5 et / m2) med en høj ekstracellulære K+ koncentration og høj udtryk for Kir2.1 i RBL celler10. Men for reel cellemembraner med forskellige ion-kanal strømtæthed amplituder, unstirred lageffekt på cellemembranen overflade kan afhænger i høj grad amplitude af ion-kanal strømtæthed. Desuden, dette kan medføre nogle ion kanal strømninger, (især dem med relativt lavere strømtætheder) for at være ufølsom over for væske-flow regulering; selv om unstirred lag effekten reguleres elektrokemisk og ikke biologisk. Dette kan således påvirke den teknik beskrevet her. Derfor undersøgt mulighed for at udvikle en kvantitativ metode, der er passende for korrigere eksperimentelle resultater bør være i fremtidige undersøgelser.
I figur 3konstaterede vi, at flydende-metal junction potentiale mellem Ag/AgCl referenceelektrode og badning væske var stærkt afhængig af tilstanden af Ag/AgCl-elektrode. I virkeligheden, da Ag/AgCl-elektrode var perfekt i stand, ændringer i krydset potentielle på grund af flydende flow var minimal (data ikke vist). Men stakkels chlorering af Ag/AgCl-elektrode forårsaget en større skift i krydset potentielle. Da Ag/AgCl-referenceelektrode er meget modtagelige for forskellige eksterne stimuli, såsom ultraviolet lys og oxidativ stress, anbefales ved hjælp af en agar eller Agarosen KCl bro altid. Selv om ændringer i krydset potentiale af væske flow mellem badning væske og referenceelektrode er en potentiel kilde til fejl, vi med held anslået virkelige ion koncentrationen i unstirred grænselag ved at måle forskydningen af krydset potentiale under forskellige væske-strømningshastigheder (figur 3A og 3B).
Det kritiske punkt i trin 4 for at forberede Standardkurven for vurdering af virkelige Cl- koncentration i de unstirred grænse lag fra skift af krydset potentiale er at standardkurven skal registreres under en tilstrækkelig strømningshastighed (30 mL / min i dette eksperiment). Selv om denne strømningshastighed er meget hurtigt, i konkrete tilfælde hurtigere væsken, jo mindre koncentration faldet er på grænsen lag (figur 3). Derudover skal den åbne pipette udfyldes med høj KCl, i stedet for en regelmæssig pipette løsning, for at en patch-clamp undersøgelse at forhindre skift i krydset potentielle mellem en pipette og badning løsning.
Shear kraften i indstillingen patch-clamp kan estimeres ud fra de følgende forhold11:
Τ = (6μQ) / (bh2) (ligning 2)
Hvor: τ er shear stress (N/cm2); Μ er viskositet (0,001 N m/s2 for vand ved 20 ° C); Q er den væske flow (m3s); b er kammeret bredde (m); og h er kammer højde (m). Når væske flow er 30 mL/min., er shear kraft patch-her vist i figur 1 anslået til at være ~0.75 dyn/cm2 efter ovenstående ligning. Dette er en lav shear kraft plan i forhold til den fysiologiske shear kraft; endotelceller i blodkar kan blive udsat for at vride styrker på op til 40 dyn/cm18,19. Derfor, forudsat at ion-kanalerne ikke er følsomme over for shear styrker mindre end 0,75 dyn/cm2, kan vi studere væske flow/shear kraft følsomhed af Ionkanaler efter undtagen unstirred grænselag effekt af indstillingstilstanden kontrol til 0,75 dyn/cm2. Nogle Ionkanaler, herunder Kir2.1, synes dog at være opmærksom på shear styrker mindre end 0,75 dyn/cm2,3,4,5,6.
Unstirred lageffekt blev oprindeligt foreslået af Barry og kolleger12,13,14,15. Her, leverer vi en metode til at vurdere virkelige ion koncentration i det unstirred lag ved at måle ændringer i krydset potentiale med åben patch-clamp pipette. Vi foreslår også, at denne unstirred grænselag virkning kan bidrage til væske flow-induceret regulering af ion-kanal strømninger og bør overvejes, mens studerer væske flow-mechanosensitivity af Ionkanaler. Men, baseret på denne hypotese, kan man spørge hvorfor nogle ion-kanal strøm er ikke følsomme over for væske flow-afhængig regulering hvis unstirred grænselag virkning er en elektrokemisk snarere end biologisk bekæmpelse. Som kort behandlet ovenfor er det sandsynligvis fordi kun ion strømme gennem kanaler med stor nok enkanalet ledningsevne og længe nok open-tid kan lettes ved flydende flow. Det vil sige, for etablering af det unstirred lag, som ion koncentration er forskellig fra gennemsnittet i bulk løsning, flux i membran fasen bør være hurtige nok i forhold til at i den vandige fase14. Vi har for nylig foreslået at nuværende gennem Kir2.1 kanaler, hvis ledningsevne og åben tid er tilstrækkelig høj, lettes af flydende flow via mekanismer af konvektive restaurering af ion koncentration i unstirred grænselag af cellemembranen overflade11.
Afslutningsvis, præsenterer vi en metode til måling af ion koncentration i unstirred grænselag støder op til den reference elektrode og cellemembranen overflade med en åben patch-clamp pipette. Udover understreger betydningen af en Agarosen KCl bro, også giver denne metode en måde at tage højde for unstirred lageffekt mens tolkning væske flow/shear kraft kontrol af Ionkanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Pioneer Research Center Program (2011-0027921), af grundlæggende videnskab forskningsprogrammer (2015R1C1A1A02036887 og NRF-2016R1A2B4014795) gennem de nationale Research Foundation Korea finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT & Fremtidige planlægning, og af et tilskud af Korea sundhed Technology R & D projekt gennem Korea sundhed industri udvikling Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed & velfærd, Republikken Korea (HI15C1540).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
