Summary
כאן מוצג פרוטוקול לחקור את ההשפעות המוקדמות של עמילואיד-β (Aβ) במוח. זה מראה Aβ גורם אנדוציטוזה בתיווך clathrin וכיווץ של צמיחת עצב קונוסים. הפרוטוקול שימושי בלימוד ההשפעות המוקדמות של Aβ על צמיחת עצב קונוסים, עשוי להקל על מניעת מחלת אלצהיימר.
Abstract
עמילואיד-β (Aβ) גורמת ליקויי הזיכרון מחלת אלצהיימר (AD). למרות הרפוי הוכחו להפחית את רמות Aβ במוחם של חולי אלצהיימר, אלה לא לשפר זיכרון פונקציות. מאז Aβ אגרגטים במוח לפני הופעתו של ליקויי הזיכרון, מיקוד Aβ עשוי להיות יעיל לטיפול בחולי לספירה אשר כבר תערוכת זיכרון גירעונות. לכן, איתות במורד הזרם עקב Aβ התצהיר לחסום לפני פיתוח לספירה. Aβ גורם ניוון עצב, שמוביל שיבוש רשתות עצביים, ליקויי הזיכרון. למרות שיש מחקרים רבים על המנגנונים רעילות Aβ, המקור של רעילות Aβ נותר עלום. כדי לסייע בזיהוי המקור, אנו מציעים הרומן פרוטוקול העושה שימוש במיקרוסקופ ג'ין תרביות תאים, תא חי הדמיה כדי לחקור מוקדם השינויים שנגרמו על ידי Aβ ב צמיחת עצב קונוסים של נוירונים בתרבית. פרוטוקול זה חשף כי Aβ המושרה בתיווך clathrin אנדוציטוזה בתוך גביעי צמיחת עצב ואחריו התמוטטות חרוט הצמיחה, הוכחת כי עיכוב של אנדוציטוזה מונעת Aβ רעילות. פרוטוקול זה יהיה שימושי ללמוד את ההשפעות המוקדמות של Aβ, עלול להוביל יותר יעיל, מונעת טיפול לספירה.
Introduction
משקעי עמילואיד-β (Aβ) נמצאים במוח של חולי מחלת אלצהיימר (AD) והם נחשבים מטרה קריטית לספירה1 לשבש רשתות עצביים, המוביל אל זיכרון ליקויי2,3,4. מועמדים סמים קליניים רבים הוכחו יעיל למנוע ייצור עמילואיד-β (Aβ) או להסיר משקעים Aβ. עם זאת, איש לא הצליח לשיפור הזיכרון הפונקציה ב- AD חולים5. Aβ כבר נצבר במוח לפני תחילתה של ליקויי זיכרון6; לכן, הפחתת רמות Aβ במוחם של חולי מפגין ליקויי הזיכרון עשוי להיות לא יעיל. Aβ התצהיר נוכחת חולי אלצהיימר פרה; עם זאת, חולים אלו להציג רק לעתים רחוקות עצביים ניוון וזיכרון גירעונות6. יש פער-זמן בין התצהיר Aβ ליקויי הזיכרון. לכן, אסטרטגיה קריטי למניעת לספירה חוסם רעילות Aβ איתות כבר בשלבים המוקדמים של AD, לפני הפיתוח של זיכרון גירעונות. Aβ התצהיר המניע האקסון ניוון7,8,9,10,11,12,13, דבר שעלול להוביל לשיבוש רשתות עצביות, ליקוי הקבע של פונקציית הזיכרון. מחקרים רבים חקרו את המנגנונים רעילות Aβ; לדוגמה, האקסונים מנוונת של המוח עכברים לספירה הוכחו הגדילו autophagy14. הפעלת Calcineurin דווחה כמנגנון אפשרי של Aβ-induced ניוון עצב15; עם זאת, הגורם הישיר של ניוון עצב נותר עלום.
מחקר זה מתמקד ההתמוטטות של קצות עצב הנקרא צמיחה קונוסים. נפילת קונוסים צמיחת עצב יכול להיגרם על ידי דוחי צמיחת עצב, כגון semaphorin-3A ו- ephrin-A516,17,18,19,20. קצות עצב dystrophic כמו התמוטטות נצפו במוחם של המודעה חולים21,22. בנוסף, כישלון של תפקוד חרוט הצמיחה יכול לעורר ניוון עצב23. עם זאת, לא ידוע אם Aβ גורם לקריסת חרוט הצמיחה. לפיכך, מחקר זה מציג פרוטוקול הרומן לבחון את ההשפעות המוקדמות של Aβ בנוירונים בתרבית ולחקור התמוטטות חרוט הצמיחה הנוצרות על-ידי Aβ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה Sugitani בקמפוס של האוניברסיטה של טויאמה, אושרו על ידי ועדת לצורך טיפול בעלי חיים, שימוש של חיות מעבדה בקמפוס Sugitani של האוניברסיטה של טויאמה (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. התמוטטות Assay
- ציפוי פולי-D-ליזין
- מעיל 8-ובכן תרבות שקופיות עם μL 400 של μg/mL 5 poly-D-ליזין (PDL) בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS), דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- הסר את הפתרון PDL ולשטוף הבארות 3 פעמים עם מים מזוקקים.
- נוירון תרבות24
- מינצ cortices מוחי טרי מבודד מן היום עובריים (E14) 14 ddY עכברים עם microscissors במדיום תרבות נוירון המכיל 12% הסוס סרום, 0.6% גלוקוז ו- 2 מ מגלוטמין (בינוני A). אל תוסיף אנטיביוטיקה.
הערה: ב פרוטוקול זה, העכבר ddY משמש. זהו זן outbred נפוץ ביפן. פרוטוקול זה תרבות נוירון ניתן להחיל גם על החולדה הנוירונים קורטיקלית7,25. - Centrifuge הרקמות ב g x 87 למשך 3 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע. אז בגדר, להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C. מערבבים על-ידי הקשה כל 5 דקות.
- להוסיף 4 מיליליטר A בינונית ומיקס על ידי הקשה.
- Centrifuge הרקמות ב g x 178 במשך 3 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר דגירה הרקמות עם 600 DNase U/mL ו- 0.3 מ"ג/מ"ל סויה מעכבי טריפסין מומס PBS למשך 15 דקות ב 37 º C. מערבבים על-ידי הקשה כל 5 דקות.
- לאחר דגירה, להוסיף 4 מיליליטר A בינונית ומיקס על ידי הקשה.
- Centrifuge הרקמות ב g x 178 במשך 3 דקות.
- לאחר הסרת את תגובת שיקוע, להוסיף 4 מיליליטר בינוני A, triturate הרקמות עם פיפטה מלוטשת פסטר.
- לסנן את רקמות triturated עם רשת שינוי גודל הנקבוביות 70 מיקרומטר. לאחר סינון, חישוב הצפיפות של תאים עם hemocytometer.
- התרבות התאים בתרבות 8-ובכן גולשים 0.8 x 104 תאים/טוב בינונית A ולתחזק אותם ב חממה2 CO עם אווירה humidified של 10% CO2 ב 37 º C.
- לאחר 4 שעות של culturing, להחליף את תרבות בינוני אחד המכיל 2% תוספת תרבות עצביים, 0.6% גלוקוז של 2 מ מגלוטמין (בינוני B).
הערה: הטוהר של נוירונים היה כ- 75%, כפי שתואר לעיל26.
- מינצ cortices מוחי טרי מבודד מן היום עובריים (E14) 14 ddY עכברים עם microscissors במדיום תרבות נוירון המכיל 12% הסוס סרום, 0.6% גלוקוז ו- 2 מ מגלוטמין (בינוני A). אל תוסיף אנטיביוטיקה.
- התמוטטות assay27
- להמיס מסחרית שהושג באורך מלא עמילואיד β1-42 (Aβ1-42) במים מזוקקים-ריכוז של 0.5 מ מ, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים. לאחר הדגירה, לאחסן את הפתרון Aβ1-42 צבורים במקפיא למינוס 30 מעלות עד השימוש.
הערה: הדגירה הזה הוא הכרחי עבור צבירה ורעילות של Aβ27,28,29,30. - לאחר 4 ימים של תרבות עצביים, להתייחס הבארות עם 100 μL של B בינוני חדש, המכיל 0.5 μM המצטברים Aβ1-42 או הרכב פתרון (מים מזוקקים) לשעה.
הערה: השפעות Aβ1-42 היו במינון-dependently עלה מ 0.1 ל 5 μM, לשיאה ב- 0.5 μM כפי שתואר לעיל27. יכול להיות שנצפו תוצאות דומות כאשר על ידי טיפול Aβ1-42 1 h אחרי 3 ימים של תרבות עצביים31. - להסיר את המדיום תרבות, מיד לתקן את הנוירונים עם 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז ב- PBS עבור h 1-37 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
- לאחר קיבוע, לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS והר אותם בינונית הרכבה מימית. יבש המדיום הרכבה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-4 ימים.
- ללכוד את כל האזור (7.8 x 9 מ מ2) של כל טוב עם 20 X יבש המטרה עדשה במיקרוסקופ הפוכה.
- לסווג את neurites הארוך של כל נוירון בשלב 3 או 4 כמו אקסונים, כפי שתואר לעיל32,33.
- לסווג את הצמיחה קונוסים לפי הקריטריונים הבאים: צמיחה 1) עצב קונוסים חסר lamellipodia או 2) הפו filopodia פחות משלושה נחשבים התמוטט גביעי צמיחה, כפי שתואר לעיל17.
הערה: גידול בריא קונוסים הם הבקיע כנקודת 0; צמיחה התמוטט קונוסים הם הבקיע כמו 1 נקודה. כלומר כיווץ הציונים מחושבים עבור כל טיפול.
- להמיס מסחרית שהושג באורך מלא עמילואיד β1-42 (Aβ1-42) במים מזוקקים-ריכוז של 0.5 מ מ, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים. לאחר הדגירה, לאחסן את הפתרון Aβ1-42 צבורים במקפיא למינוס 30 מעלות עד השימוש.
2. עמילואיד β Immunostaining
- תרבות נוירונים בקליפת המוח העכבר במשך 3 ימים, כפי שמתואר בשלב 1.2.
- לטפל עם Aβ1 צבור-42 (5 μM) או רכב במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO.
- מבלי להסיר את המדיום, הוסף אמצעי שווה של 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז ב- PBS כדי מכל קידוח, לשמור על התרבות ב 37 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך 5 דקות.
- החלף את הפתרון μL 400 של 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז ב- PBS, ולתחזק ב- 37 מעלות צלזיוס על הכיריים לשעה. פרוטוקול קיבוע זה שונה מן הדו ח הקודם34.
- לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS.
- בלוק עם הנסיוב עז רגילה 5% ב- PBS.
- דגירה נוירונים עם העכבר נגד עמילואיד β אימונוגלובולין G (IgG) (1:50) של 1% אלבומין בסרום שור ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS.
- דגירה הנוירונים עם פלורסצנטיות מצומדת נוגדנים משניים (1:400), 1% שור אלבומין ב- PBS בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
- לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS והר אותם בינונית הרכבה מימית.
- לכידת תמונות פלורסצנטיות ותמונות שדה בהיר עם תאורה עקיפה על-ידי שימוש 40 X יבש המטרה עדשה מיקרוסקופ הפוכה B.
3. עצב Immunostaining27
- לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS לאחר קיבוע נוירון בתרבית, כפי שמתואר בשלב 1.3.3.
- דגירה הנוירונים עם העכבר אנטי-tau-1 IgG (שבערך), ארנב microtubule אנטי המשויך חלבון 2 (MAP2) IgG (שבערך) 5% עז נורמלית בסרום, 0.3% t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS.
- דגירה הנוירונים עם פלורסצנטיות מצומדת נוגדנים משניים (1:400), 0.3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol ב- PBS בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
- לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS, והר באמצעות בינוני של הרכבה מימית.
- לכידת פלורסצנטיות דיפרנציאלית ותמונות חדות (DIC) הפרעה על-ידי שימוש 20 × יבש המטרה עדשה מיקרוסקופ הפוך א
4. חיים תא הדמיה27
- מעיל המבוסס על זכוכית מנות עם 500 μL של PDL (5 μg/mL), כמתואר בשלב 1.1.1.
הערה: ב פרוטוקול זה, מנות ביתיות המבוסס על זכוכית שימשו. כלים מבוססי-זכוכית זמינים מסחרית יכול לשמש גם עבור הדמיה בשידור חי. מנות ביתיות המבוסס על זכוכית הוכנו כדלקמן: 1) תעשה חור כ 1.4 מ מ קוטר במרכזה של צלחת 35 מ מ עם אגרוף ביד ולאחר 2) לצרף את coverslip של זכוכית (קוטר 22 מ מ) לחלק האחורי של המנה עם סיליקון. - לשטוף הצלחות עם מים מזוקקים, כפי שמתואר בשלב 1.1.2, תרבות הנוירונים קורטיקלית בצלחת זכוכית מבוססי-3 x 104 תאים/תבשיל עם A בינוני, כפי שמתואר בשלב 1.2.
- לאחר 4 ימים של התרבות תאים, להחליף את המדיום 2 מ"ל של מדיום חדש B, והעברה המנה כדי הפוכה מיקרוסקופ א שמור על התרבות באווירה humidified של 10% CO2 ב 37 º C.
5. אנדוציטוזה ניסוי
- תרבות נוירונים בקליפת המוח את העכבר כפי שמתואר בשלב 1.2.
- ארבעה ימים לאחר מכן, החלף את המדיום μL 100 של מדיום חדש B המכיל 20 μM פלורסצנטיות רגש קרום 1 דקות.
- להוסיף 1 μL 0.05 מ"מ צבורים Aβ1-42 (סופי 0.5 μM), תערובת או רכב (מים מזוקקים) פתרון על-ידי pipetting. תקופת דגירה של 20 דקות.
- להסיר את המדיום. ולשטוף את בארות פעמיים עם בינוני B כי כבר מראש ומחוממת ל- 37 מעלות צלזיוס.
- לתקן, לשטוף, והר הנוירונים כפי שתואר בשלבים 1.3.3 ו 1.3.4.
- לכידת פלורסנט ותמונות DIC עם 63 X עדשה המטרה שמן על מיקרוסקופ הפוך א
- לכמת הצפיפות של אזור בדיקה-חיוביות ממברנה זריחה בחרוט גידול בריא כל באמצעות תוכנה תמונה.
6. גנים תרביות תאים
- להכין נוירונים בקליפת המוח כפי שמתואר בשלב 1.2. לאחר השלמת השלבים 1.2.1 כדי 1.2.10, centrifuge את הנוירונים ב g x 178 במשך 3 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 4 מ של Ca2 +-חינם ו- Mg2 +-חינם של הנקס מאוזנת תמיסת מלח (CMF-HBSS), ומערבבים על ידי pipetting.
- Centrifuge התאים ב g x 178 במשך 3 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 4 מיליליטר CMF-HBSS ומערבבים על ידי pipetting. בשלב הבא, לחשב את צפיפות התאים, כפי שמתואר בשלב 1.2.10.
- להעביר 5 x 106 תאים, צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה ב 1,677 x g עבור 1 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 100 μL של תרביות תאים פתרון עם תוספת μg 3 של ה-DNA פלסמיד קידוד EGFP או EGFP-AP180 קצה קרבוקסילי ומערבבים על ידי pipetting.
- להעביר את הפתרון שלעיל (שלב 6.6) cuvette מוסמך, transfect עם electroporator, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
- מיד לאחר תרביות תאים, להוסיף 500 μL בינוני A cuvette ולהעביר את הפתרון צינור 1.5-mL עם פיפטה מוסמך. בשלב הבא, לחשב את צפיפות התאים, כפי שמתואר בשלב 1.2.10.
- התרבות התאים שקופית 8-ובכן תרבות-0.8 x תאים4 10/טוב, כפי שתואר בשלבים 1.2.11 ו- 1.2.12.
- לאחר 4 ימים של תרבית תאים, לבצע assay התמוטטות כפי שמתואר בשלב 1.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ב פרוטוקול זה, Aβ1-42, נדגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים לפני השימוש, כי דגירה של Aβ1-42 שהיה נחוץ לייצור צורות רעילים27,28,30,35. לאחר דגירה הזה, נצפו צורות צבורים של Aβ (איור 1 א'). בעבר דווח כי דגירה דומה של Aβ1-42 המיוצר fibril בצורת Aβ36. לאחר הטיפול עם Aβ1 הזה צבור-42, immunostaining עם נוגדן עבור אוליגומר רעילים של35,Aβ37 בוצע, צביעת חיובי זוהה על הנוירונים בתרבית (איור 1B). בהתחשב לעיל, פרוטוקול זה הדגירה מייצרת הצורות רעילים של Aβ.
מספר ימים נדרשו אינדוקציה של ניוון עצב לאחר החשיפה Aβ. האירועים לפני ניוון עצב נותרו בלתי ברורים. לכן, פרוטוקול זה פותחה עוד יותר להבין את המנגנונים המעורבים. באמצעות פרוטוקול זה, התופעות מוקדם המושרה על ידי טיפול Aβ נותחו. נוירונים בקליפת המוח היו תרבותי במשך 4 ימים. Neurites הארוך ביותר בהנוירונים בתרבית אותרו כ אקסונים; אלה שאושרו על-ידי immunostaining חיובי עבור סמן עצב, טאו-1, immunostaining שליליות עבור דה מרקר דנדריטים, MAP2 (איור 2). לאחר h 1 הטיפול ברכב, צמיחה קונוסים להפיץ את lamellipodia, מעובד מספר filopodia. אלה זוהו כמו קונוסים צמיחה בריאה. לעומת זאת, h 1 של טיפול Aβ1-42 הובילה גביעי צמיחה הגמדי, שהתפתחה ללא lamellipodia או filopodia. אלה זוהו כמו קונוסים צמיחה התמוטט. התמוטטות ציונים חושבו כפי שמתואר בשלב 1.3.7. כאשר צורות של צמיחה גביעי אינן ברורות, הם חוסלו מניתוח. טיפול Aβ1-42 הוביל לעליה משמעותית הציון התמוטטות, המתייחס גדל גדילה עצב התמוטטות, כאשר לעומת הציון התמוטטות של צמיחה שטופלו הרכב קונוסים27.
צמיחת עצב קונוסים נצפו לפני ואחרי הטיפול עם Aβ1-42 (איור 3). התאים היו מתוחזקים המיקרוסקופ הפוך עם אווירה humidified של 10% CO2 ב 37 º C. תמונות נלכדו כל 5 דקות. כפי שמוצג באיור3, צמיחה קונוסים קרס בין 21 ו-26 דקות לאחר טיפול Aβ1-42. קונוסים צמיחה לא נכללו תא חי הדמיה, אם הם לא ישמרו על צורתם בריא עבור h 1 לפני כל טיפול.
כדי להמחיש את ההשפעות המוקדמות של Aβ1-42-טיפול, אנדוציטוזה שימש המוקד של ניתוח זה, כי אנדוציטוזה מעכבי יכול לחסום Aβ1-42-induced צמיחה-חרוט התמוטטות27. אנדוציטוזה היה מדמיין גשש ממברנה זריחה (כלומר., הפלורסנט נקשר ממברנות פלזמה והיא endocytosed באופן ספונטני). מחקר קודם הראה כי הצמיחה קונוסים אינן מתכווצות ב 20 דקות אחרי Aβ1-42-טיפול27; לכן, גידול בריא קונוסים נבחרו על ידי DIC הדמיה של הרכב או Aβ1-42-שטופלו תאים לאחר 20 דקות. בעקבות Aβ1-42-טיפול, puncta בדיקה-חיוביות ממברנה פלורסנט רבים נצפתה צמיחה קונוס (איור 4). הצפיפות של קרינה פלואורסצנטית ממברנה בדיקה-חיוביות puncta ב צמיחה קונוסים היה מוגבר באופן משמעותי27. הדבר מצביע על שזה אנדוציטוזה חרוט הצמיחה Aβ1-42-induced מתרחשת לפני התמוטטות.
כדי לאשר את התפקיד של אנדוציטוזה, פלסמיד ה-DNA קידוד EGFP-AP180 קצה קרבוקסילי היה transfected לתוך בתרבית נוירונים בקליפת המוח. התאים לבטא את AP180 קצה קרבוקסילי באופן סלקטיבי עכבות אנדוציטוזה בתיווך clathrin38,39. אם הביטוי EGFP נצפתה לגוף התא של הנוירון, AP180 קרבוקסילי נחשב לבוא לידי ביטוי בקונוס צמיחת עצב של הנוירון. תרביות תאים של AP180 קצה קרבוקסילי חסם לצמיחה Aβ1-42-induced חרוט התמוטטות (איור 5)27.
איור 1 : דגירה של A Β1-42 אגרגטים Aβ. (א) Aβ1-42 היה מומס במים מזוקקים-ריכוז של 0.5 מ מ, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים (לאחר דגירה), או המאוחסנים ב-30 ° C ללא דגירה (אין דגירה). כל הפתרונות Aβ היה מדולל עד 0.1 מ"מ; לאחר מכן, 10 μL של כל פתרון מדולל היה הפיל בשקופיות זכוכית, מכוסה coverslips. ברייט-שדה תמונות עם תאורה עקיפה נלכדו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה בקנה מידה ב' בר = 20 μm. (B) טיפול Aβ1-42 המצטברים או רכב על נוירונים בתרבית במשך 4 שעות. בעקבות הטיפול, תוקנו הנוירונים ו immunostained עבור oligomers Aβ רעילים. קרינה פלואורסצנטית תמונות (אדום), מוצגים שדות מוארים תמונות עם תאורה עקיפה (אפור). סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : A צמיחת עצב β1-42-induced חרוט התמוטטות. לאחר Aβ1-42-רכב-טיפול או, נוירונים תוקנו ומקושרת immunostained טאו-1 (אדום) ו microtubule חלבון 2 (MAP2, ירוק). קרינה פלואורסצנטית דיפרנציאלית ותמונות חדות (DIC) הפרעה מוצגים. נוף המוגדל של האזורים עניין (רועי, מלבנים) מוצגים להלן תמונות המתאימות שלהם. לבן סרגלי קנה מידה = 50 μm; שחור סרגלי קנה מידה = 10 μm. איור זה השתנה מ Kuboyama ואח ', 201527. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : לחיות תא הדמיה לפני ואחרי A טיפול β1-42- לאחר 4 ימים של תרבות, הועברו תאים במיקרוסקופ הפוכה, DIC תמונות נלכדו כל 5 דק מוצגות תמונות בצילום מואץ. הספרות מייצגות דקות: שניות לאחר היישום של Aβ1 צבור-42 (הריכוז הסופי, 0.5 μM). סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : 20 דקות של A טיפול β1-42 המושרה אנדוציטוזה. נוירונים בקליפת המוח היו בתרבית למשך 4 ימים, מטופלים עם מכשיר בדיקה ממברנה זריחה. לאחר מכן, נוירונים טופלו במשך 20 דקות עם Aβ1-42 או רכב. קרינה פלואורסצנטית תמונות של קונוסים צמיחה מוצגים. הקווים המנוקדים צהוב מייצגים את קווי המתאר של הקונוסים צמיחה. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : הביטוי של AP180-C טרמינוס בלוקים התמוטטות Aβ1-42-induced. ארבעה ימים לאחר תרביות תאים של EGFP (A, B) או EGFP-AP180 קצה קרבוקסילי (C, D); Aβ1-42 (B, D) או רכב (א, ג) נוספה נוירונים בקליפת המוח עבור 1 ה DIC (לוחות העליון), מוצגות תמונות קרינה פלואורסצנטית (לוחות התחתון). חיצים מציינים צמיחה קונוסים. גודל ברים = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתוארים במחקר זה מאפשר התבוננות תופעות בראשית צמיחת עצב קונוסים לאחר טיפול Aβ1-42. Aβ1-42 המושרה אנדוציטוזה ב צמיחת עצב קונוסים בתוך 20 דקות, התמוטטות חרוט הצמיחה נצפתה בתוך h 1 של הטיפול. אנדוציטוזה הזה היה כנראה בתיווך clathrin. באמצעות פרוטוקול זה, עיכוב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin אושר כדי למנוע התמוטטות חרוט הצמיחה Aβ1-42-induced, ניוון עצב נוירונים בתרבית27. בנוסף, עיכוב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin הקלוש Aβ1-42-induced ניוון עצב ו זיכרון גירעונות ויוו27. תוצאות אלה לציין שאת אנדוציטוזה בתיווך clathrin יש שדרה טיפולית מבטיחה למניעת לספירה.
פרוטוקול זה פותחה מתוך לכווץ את מבחני עבור דוחי צמיחת עצב, כגון semaphorin 3A ו- ephrin-A516,17,18,19,20. מבחני התמוטטות השתמשו במחקרים להערכת ההתפתחות של רשתות עצביים. הראיתי כי פרוטוקול זה ניתן להחיל על ניתוחים פתולוגיים, במיוחד אלו שמערבים מנגנוני לספירה; עם זאת, הגבלה ייתכן כי כ-40% של צמיחה גביעי התמוטט במצב בריא. אחוז זה הוא גבוה יותר מאשר תוצאות של נוירונים גנגליון המתורבתות שורש העזוב, אשר משמשות בדרך כלל יותר לכווץ את מבחני16,17,18,19,20. לכן, ההבדל בין סוגי תאים יכול להיות קשור הבדלי יחס כיווץ. יחס כיווץ נמצאו במחקר זה היו בקנה אחד עם אלה שנמצאו במחקרים קודמים עם נורמלי נוירונים בקליפת המוח בתרבית40,41. יתר על כן, Aβ1-42 המושרה רמות דומות של התמוטטות חרוט הצמיחה בהשוואה עם גורמים אחרים התמוטטות, כמו semaphorin 3A ו- ephrin-A527. לכן, פרוטוקול זה בתוקף עבור כימות של התמוטטות חרוט הצמיחה Aβ1-42-induced. פרוטוקול קיבוע זה חשוב לשמור על צורת הצמיחה קונוסים. אם התאים היו כמקובל קבוע עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר, קונוסים צמיחה נוסף יכול להיות שהתמוטטתי בשל ההליך קיבעון (נתונים לא מוצג). לחלופין, מאגרי גלוטראלדהיד, קיבוע הינם זמינים עבור קיבוע נוקשה, כפי שתואר לעיל42; עם זאת, גלוטראלדהיד תערוכות autofluorescence, וזו ליקוי משמעותי עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה.
מחקר שנערך לאחרונה באותו הפרוטוקול הראה כי החילוץ מים מבסיס Polygalae (שורשי Polygala דקת-עלים) מעוכבים אנדוציטוזה Aβ1-42-induced בנוירונים בתרבית, למנוע ניוון עצב, זיכרון לגירעונות הקטינה העכבר הטרנסגניים מודל של המודעה31. מועמד הרומן למניעת לספירה נמצאה עם פרוטוקול זה. שילוב של תרביות תאים ג'ין והדמיה תא חי ב פרוטוקול זה יראה את האירועים הסלולר האחרים נמצאו אקסונים ומסופי שלהם לפני ואחרי טיפול Aβ, כגון הדמיה2 + Ca, דינמיקה microtubule ו תא אדהזיה דינמיקה, אשר הם הדיווחים הקשורים עצב צמיחה43,44,45. פרוטוקול זה עשוי לסייע לחשוף את המנגנונים מפורט יותר רעילות Aβ והוא עשוי לעזור להוביל מניעה ו/או טיפול של המודעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן בחלקו על ידי מענקי מחקר של JSPS (KAKENHI 18K 07389), יפן, טקדה למדע, יפן ו קוביאשי פרמצבטיקה ושות', בע מ, יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Perl, D. P.
- Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
- Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
- Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
- Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
- Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
- Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
- Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
- Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
- Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
- Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
- Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
- Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
- Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
- Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
- Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
- Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
- Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
- Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
- Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
- Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
- Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
- De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
- Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
- Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
- Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
- Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
- Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
- Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
- Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
- Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
- Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
- Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).
