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Neuroscience

Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58229
Automatic Translation
1
1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

Summary

Hier präsentiert sich ein Protokoll, das frühe Effekte von Amyloid-β (Aβ) im Gehirn zu untersuchen. Dies zeigt, dass Aβ Clathrin-vermittelte Endozytose und Zusammenbruch der axonalen Wachstum Kegel induziert. Das Protokoll ist nützlich bei der Untersuchung der frühen Auswirkungen von Aβ auf axonale Wachstum Kegel und Prävention der Alzheimer-Krankheit erleichtern kann.

Abstract

Amyloid-β (Aβ) bewirkt, dass Gedächtnisstörungen bei der Alzheimer-Krankheit (AD). Obwohl Therapeutika haben gezeigt, dass Aβ in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten zu reduzieren, verbessern diese Memory-Funktionen nicht. Da Aβ im Gehirn vor dem Aufkommen von Gedächtnisstörungen Aggregate, kann gezielt Aβ ineffizient sein zur Behandlung von Alzheimer-Patienten, die bereits Gedächtnisdefizite ausstellen. Daher sollten nachgeschaltete Signalisierung durch Aβ Ablagerung vor AD Entwicklung blockiert werden. Aβ induziert axonalen Degeneration, führt zu einer Störung der neuronalen Netzwerke und Gedächtnisstörungen. Obwohl es viele Studien über die Mechanismen der Aβ-Toxizität gibt, ist die Quelle von Aβ-Toxizität unbekannt. Um die Quelle zu ermitteln, schlagen wir eine neuartige Protokoll, die Mikroskopie, gen Transfektion und live Cell imaging zu frühen Veränderungen durch Aβ axonale Wachstum Zapfen von kultivierten Neuronen untersuchen verwendet. Dieses Protokoll zufolge Aβ induziert Clathrin-vermittelte Endozytose in axonale Wachstum Kegel gefolgt von Wachstum Kegel Zusammenbruch, zeigen, dass die Hemmung der Endozytose Aβ Toxizität verhindert. Dieses Protokoll wird in der frühen Auswirkungen von Aβ nützlich sein und kann dazu führen, effizienter und vorbeugende Behandlung der AD.

Introduction

Ablagerungen von Amyloid-β (Aβ) befinden sich im Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD) und gelten als eine kritische Ursache von AD1 , die neuronale Netze stören zu Speicher Beeinträchtigungen2,3,4. Viele klinische Wirkstoffkandidaten nachweislich effektiv verhindern Amyloid-β (Aβ) Produktion oder Aβ Ablagerungen entfernen. Jedoch ist keine Verbesserung der Gedächtnisfunktion AD Patienten5gelungen. Aβ lagert sich bereits im Gehirn vor dem Beginn der Speicher Beeinträchtigungen6; Daher können Verminderung der Aβ-Zahl in den Gehirnen von Patienten ausstellenden Gedächtnisstörungen unwirksam sein. Aβ Ablagerung ist in präklinischen Alzheimer-Patienten; Allerdings stellen diese Patienten selten mit neuronalen Degeneration und Speicher Defizite6. Gibt es eine zeitliche Verzögerung zwischen Aβ-Ablagerungen und Gedächtnisstörungen. Daher ist eine kritische Strategie zur Prävention von AD Aβ Toxizität während der frühen Stadien von AD, vor der Entwicklung von Gedächtnisstörungen Signalisierung blockiert. Ablagerung von Aβ induziert Axon Degeneration7,8,9,10,11,12,13, führen zu einer Störung der neuronale Netze und dauerhafte Beeinträchtigung der Memory-Funktion. Viele Studien haben die Mechanismen der Aβ-Toxizität untersucht; zum Beispiel zeigten die degenerierten Axone AD Mäuse Gehirne Autophagie14gestiegen. Calcineurin-Aktivierung wurde als ein möglicher Mechanismus der Aβ-induzierte axonalen Degeneration15gemeldet; die direkte Auslöser der axonalen Degeneration bleibt jedoch unbekannt.

Diese Studie konzentriert sich auf den Zusammenbruch der axonalen Endungen genannt Wachstum Kegel. Der Zusammenbruch der axonalen Wachstum Zapfen kann durch axonale Wachstum Repellentien wie semaphorin-3A und Ephrin-A516,17,18,19,20verursacht werden. Kollaps-wie dystrophischen axonale Endungen sind in den Gehirnen von AD Patienten21,22beobachtet worden. Darüber hinaus kann ein Versagen des Wachstums Kegel funktionieren axonalen Degeneration23provozieren. Es ist jedoch unbekannt, ob Aβ Wachstum Kegel Zusammenbruch induziert. Diese Studie stellt daher eine neuartige Protokoll um die frühen Auswirkungen von Aβ in kultivierten Neuronen zu beobachten und untersuchen Aβ-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch.

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Protocol

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren auf dem Sugitani-Campus der Universität Toyama und wurden vom Ausschuss für Animal Care und Verwendung von Labortieren auf dem Sugitani Campus der genehmigten die Universität Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

(1) Zusammenbruch Assay

  1. Poly-D-Lysin-Beschichtung
    1. 8-Well Kultur Folien mit 400 μl 5 μg/mL Poly-D-Lysin (PDL) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu beschichten und sie über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
    2. Die PDL-Lösung entfernen und die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser zu waschen.
  2. Neuron Kultur24
    1. Hackfleisch frisch isolierte zerebrale Rinde aus embryonalen Tag 14 (E14) DdY Mäuse mit Microscissors in Neuron Kulturmedium mit 12 % Pferd Serum, 0,6 % Glukose und 2 mM L-Glutamin (Medium A). Fügen Sie keine Antibiotika.
      Hinweis: In diesem Protokoll wird die DdY Maus verwendet. Dies ist eine outbred Sorte, die häufig in Japan verwendet. Dieses Neuron-Kultur-Protokoll kann auch für Ratte kortikale Neuronen7,25angewendet werden.
    2. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 87 X g für 3 min.
    3. Den Überstand zu entfernen. Fügen Sie dann zum Pellet, 2 mL 0,05 % Trypsin und 15 min bei 37° c inkubieren Durch Tippen auf alle 5 min. mischen.
    4. Durch Antippen 4 mL mittlere A und Mischung hinzugeben.
    5. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 178 X g für 3 min.
    6. Den Überstand zu entfernen, und das Gewebe mit 600 U/mL DNase I und 0,3 mg/mL Soja-Trypsin-Inhibitor aufgelöst mit PBS-Puffer für 15 min bei 37 ° c inkubieren Durch Tippen auf alle 5 min. mischen.
    7. Hinzugeben Sie nach der Inkubation 4 mL mittlere A und Mischung durch Antippen.
    8. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 178 X g für 3 min.
    9. Nach dem Entfernen des Überstands, fügen Sie 4 mL Medium A und das Gewebe mit einer polierten Pasteurpipette genannte.
    10. Das triturierten Gewebe mit einem 70 µm Porengröße Netz zu filtern. Berechnen Sie nach der Filtration die Dichte der Zellen mit einem Hemocytometer.
    11. Kultur der Zellen in der 8-Brunnen-Kultur auf 0,8 x 104 Zellen/Brunnen mit Medium A schieben und halten sie in einem CO2 Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre 10 % CO2 bei 37 ° C.
    12. Ersetzen Sie nach 4 h der Kultivierung das Kulturmedium zu einem mit 2 % Zuschlag für neuronale Kultur, 0,6 % Glukose und 2 mM L-Glutamin (Medium B).
      Hinweis: Die Reinheit der Neuronen war ca. 75 %, wie zuvor beschrieben26.
  3. Kollaps-Assay27
    1. Lösen Sie im Handel erhalten Full-length Amyloid β1-42 (Aβ1 42) in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,5 mM und 7 Tage bei 37 ° C inkubieren. Bewahren Sie nach der Inkubation die aggregierte Aβ1-42-Lösung in einem-30 ° C-Gefrierschrank bis zur Verwendung auf.
      Hinweis: Diese Inkubation ist notwendig für die Aggregation und Toxizität von Aβ27,28,29,30.
    2. Nach 4 Tagen der neuronalen Kultur behandeln die Brunnen mit 100 μL der neue mittlere B, aggregiert, enthält 0,5 μM Aβ1-42 oder Fahrzeug-Lösung (destilliertes Wasser) für 1 h.
      Hinweis: Auswirkungen des Aβ1-42 wurden Dosis-Abhängigkeit stieg von 0,1 bis 5 μM, und erreichte 0,5 μM bereits27beschrieben. Ähnliche Ergebnisse können als durch Aβ1-42-Behandlung für 1 h nach 3 Tagen der neuronalen Kultur31beobachtet werden.
    3. Das Kulturmedium zu entfernen und sofort die Neuronen mit 4 % Paraformaldehyd, enthält 4 % Saccharose mit PBS-Puffer für 1 h bei 37 ° C auf einer heißen Platte befestigen.
    4. Nach der Fixierung die Neuronen 3 Mal mit PBS waschen und mit einer wässrigen Eindeckmedium montieren. Trocknen Sie das Eindeckmittel bei 4 ° C für 2 – 4 Tage.
    5. Das gesamte Gebiet (7,8 x 9 mm2) von jedem Bohrloch mit einem 20 X trocken Objektiv auf einem inversen Mikroskop zu erfassen.
    6. Klassifizieren Sie die längste Neuriten jedes Neuron in Stufe 3 oder 4 als Axone, als zuvor beschriebenen32,33.
    7. Klassifizieren Wachstum Kegel nach folgenden Kriterien: (1) axonale Wachstum Zapfen fehlt Lamellipodia oder (2) besitzen weniger als drei Filopodien gelten zusammengebrochen Wachstum Zapfen, wie zuvor beschrieben17.
      Hinweis: Gesundes Wachstum Zapfen werden als 0-Punkt gewertet; reduzierte Wachstum Zapfen werden als 1 Punkt gewertet. Bedeuten Sie Zusammenbruch, die Scores berechnet werden für jede Behandlung.

(2) Amyloid β Immunostaining

  1. Kultur Maus kortikale Neuronen für 3 Tage, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  2. Behandeln mit aggregierten Aβ1-42 (5 μM) oder Fahrzeug für 4 h bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator.
  3. Ohne das Medium zu entfernen, fügen Sie ein gleiches Volumen von 4 % Paraformaldehyd, enthält 4 % Saccharose in PBS in jede Vertiefung und pflegen Sie die Kultur bei 37 ° C auf einer heißen Platte für 5 min.
  4. Ersetzen Sie die Lösung mit 400 μl 4 % Paraformaldehyd, enthält 4 % Saccharose mit PBS-Puffer und pflegen bei 37 ° C auf der Heizplatte für 1 h. Diese Fixierung-Protokoll wurde von einem vorherigen Bericht34geändert.
  5. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS.
  6. Block mit 5 % normalem Ziegenserum in PBS.
  7. Inkubieren Sie die Neuronen mit Maus Anti-Amyloid β Immunglobulin G (IgG) (01:50) und 1 % Rinderserumalbumin mit PBS-Puffer bei 4 ° C über Nacht.
  8. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS.
  9. Inkubieren Sie die Nervenzellen mit einem Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (1: 400) und 1 % Rinderserumalbumin mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur für 2 h.
  10. Die Neuronen 3 Mal mit PBS waschen und mit einer wässrigen Eindeckmedium montieren.
  11. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder und Hellfeld Bilder mit Schrägbeleuchtung mithilfe eine 40 X trocken Objektiv auf inversen Mikroskop B.

(3) axonalen Immunostaining27

  1. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS nach kultivierten Neuron Fixierung, wie unter Punkt 1.3.3 beschrieben.
  2. Inkubieren Sie die Neuronen mit Maus anti-tau-1 IgG (1: 500), Kaninchen Anti-Mikrotubuli assoziierten Protein 2 (MAP2) IgG (1: 500) in normalem Ziegenserum 5 % und 0,3 % t- Octylphenoxypoly-Ethoxyethanol mit PBS-Puffer bei 4 ° C über Nacht.
  3. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS.
  4. Inkubieren Sie die Neuronen mit Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (1: 400) und 0,3 % t- Octylphenoxypolyethoxyethanol mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur für 2 h.
  5. Die Neuronen 3 Mal mit PBS waschen und mit einer wässrigen Eindeckmedium montieren.
  6. Erfassen Sie Fluoreszenz und Differential Interferenzbilder Kontrast (DIC) mit einem 20 × trocken Objektiv auf inversen Mikroskop A.

4. live Cell Imaging27

  1. Beschichtung von Glas basierende Gerichte mit 500 μL der PDL (5 μg/mL), wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
    Hinweis: In diesem Protokoll wurden hausgemachte Glas basierende Gerichte verwendet. Handelsübliche Glas basierende Gerichte können auch für live-Aufnahmen verwendet werden. Glas-basierten Hausmannskost wurden wie folgt hergestellt: (1) stellen Sie ein Loch von ca. 1,4 mm Durchmesser in der Mitte einer 35-mm-Schale mit einer Hand, und (2) ein Glas-Deckglas (Durchmesser 22 mm) auf der Rückseite des Tellers mit Silikon befestigen.
  2. Die Platten mit destilliertem Wasser zu waschen, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben und Kultur der kortikalen Neuronen in der Glas-basierten Schale auf 3 x 104 Zellen/Schüssel mit mittlerer A, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  3. Nach 4 Tage der Zellkultur, ersetzen Sie das Medium mit 2 mL des neuen Mediums B und Transfer invertiert das Gericht für Mikroskop A. pflegen die Kultur in eine feuchte Atmosphäre 10 % CO2 bei 37 ° C.

(5) Endozytose Experiment

  1. Kultur der Maus kortikale Neuronen, wie unter Punkt 1.2 beschrieben.
  2. Ersetzen Sie vier Tage später, das Medium mit 100 μL des neuen Mediums B mit 20 μM-Fluoreszenz-Membran-Sonde für 1 min.
  3. Fügen Sie 1 μL von 0,05 mM aggregierten Aβ1-42 (letzte 0,5 μM) oder Fahrzeuglösung (destilliertes Wasser) und Mischen von pipettieren. 20 min inkubieren.
  4. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Brunnen zweimal mit Medium B, das auf 37 ° c vorgewärmt worden ist
  5. Beheben Sie, waschen Sie, und montieren Sie die Neuronen zu, wie in den Schritten 1.3.3 und 1.3.4 beschrieben.
  6. Erfassen Sie Leuchtstofflampen und DIC-Bilder mit einem 63 X Öl Objektiv auf inversen Mikroskop A.
  7. Quantifizieren Sie die Dichte der Fluoreszenz Membran Sonde-positiven Bereich in jeder gesunden Wachstum Kegel mithilfe einer Image-Software.

6. gen Transfektion

  1. Bereiten Sie kortikale Neuronen, wie unter Punkt 1.2 beschrieben. Nach Abschluss der Schritte 1.2.1, 1.2.10, Zentrifugieren der Neuronen bei 178 X g für 3 min.
  2. Den Überstand zu entfernen, fügen Sie 4 mL Ca2 +-frei und Mg2 +-frei Hanks ausgeglichene Salzlösung (CMF-HBSS) und Mischen von pipettieren.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 178 X g für 3 min.
  4. Entfernen des Überstands, 4 mL CMF-HBSS hinzufügen und Mischen von pipettieren. Als Nächstes berechnen Sie die Zelldichte, wie in Schritt 1.2.10 beschrieben.
  5. Übertragen Sie 5 x 106 Zellen auf einem 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.677 x g für 1 min.
  6. Den Überstand zu entfernen, fügen 100 μL der Transfektion Lösung mit Beilage und 3 μg DNA Plasmid Codierung EGFP oder EGFP-AP180 C-Terminus und mischen durch pipettieren.
  7. Übertragen Sie die obige Lösung (Schritt 6,6) auf eine zertifizierte Küvette und transfizieren mit einem Electroporator laut Protokoll des Herstellers.
  8. Unmittelbar nach der Transfektion 500 μl Medium A in die Küvette hinzufügen und die Lösung auf eine 1,5-mL-Tube mit einer zertifizierten Pipette übertragen. Als Nächstes berechnen Sie die Zelldichte, wie in Schritt 1.2.10 beschrieben.
  9. Kultur der Zellen in einer 8-Well Kultur-Folie in 0,8 x 104 Zellen/gut, wie in den Schritten 1.2.11 und 1.2.12 beschrieben.
  10. Führen Sie nach 4 Tagen der Zellkultur einen Zusammenbruch-Assay wie unter Punkt 1.3 beschrieben.

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Representative Results

In diesem Protokoll wurde Aβ1-42 für 7 Tage vor dem Gebrauch, bei 37 ° C inkubiert, denn Inkubation Aβ1 / 42 nötig war für die Herstellung von toxischen Formen27,28,30,35. Nach dieser Inkubationszeit beobachtet aggregierte Formen von Aβ (Abbildung 1A). Es wurde berichtet, dass ähnliche Inkubation von Aβ1-42 Fibrille Form von Aβ36produziert. Nach der Behandlung mit dieser aggregierten Aβ1-42 Immunostaining mit einem Antikörper für die toxischen Oligomer Aβ35,37 wurde durchgeführt und positive Färbung an kultivierten Neuronen (Abbildung 1 b) erkannt wurde. In Anbetracht des vorstehenden produziert diese Inkubation Protokoll die toxischen Formen von Aβ.

Mehrere Tage waren für die Induktion der axonalen Degeneration nach Aβ Exposition erforderlich. Die Ereignisse vor der axonalen Degeneration sind unklar. Daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Mechanismen besser zu verstehen. Unter Verwendung dieses Protokolls, waren die frühen Phänomene induziert durch Aβ Behandlung analysiert. Kortikale Neuronen waren für 4 Tage kultiviert. Die längste Neuriten in den kultivierten Neuronen wurden als Axone identifiziert; Diese wurden durch positive Immunostaining für die axonale Marker, Tau-1 und negative Immunostaining für den dendritischen Marker, MAP2 bestätigt (Abbildung 2). Nach 1 h Fahrzeug Behandlung hatte Wachstum Kegel Lamellipodia zu verbreiten und mehrere Filopodien verarbeitet. Diese wurden als gesundes Wachstum Kegel identifiziert. Umgekehrt führte 1 h Aβ1-42-Behandlung zur geschrumpften Wachstum Zapfen, die keine Lamellipodia oder Filopodien entwickelt. Diese wurden als reduzierte Wachstum Kegel identifiziert. Zusammenbruch-Scores wurden berechnet, wie im Schritt 1.3.7 beschrieben. Als Formen von Wachstum Zapfen unklar waren, wurden sie von der Analyse eliminiert. Aβ1-42 Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg der Zusammenbruch der Gäste, erhöhte axonale Wachstum Zusammenbruch, im Vergleich zu den Zusammenbruch Score von Fahrzeug behandelt Wachstum Kegel27entspricht.

Axonale Wachstum Kegel wurden vor und nach der Behandlung mit Aβ1-42 (Abbildung 3) beobachtet. Zellen wurden in der inversen Mikroskop mit einer befeuchteten Atmosphäre 10 % CO2 bei 37 ° c beibehalten. Die Bilder wurden alle 5 min. aufgenommen. Wie in Abbildung 3dargestellt, stürzte ein Wachstum Zapfen zwischen 21 und 26 min. nach Aβ1-42-Behandlung. Wachstum Kegel wurden ausgeschlossen, von live Cell imaging, wenn sie nicht ihre gesunde Form für 1 h vor jeder Behandlung zu behalten.

Um die frühen Auswirkungen der Aβ1-42-Behandlung zu visualisieren, wurde Endozytose im Mittelpunkt dieser Analyse verwendet, da Aβ1-42-induzierte Wachstum-Kegel Zusammenbruch27Endozytose-Hemmer blockiert werden können. Endozytose wurde mit einer Fluoreszenz-Membran-Sonde visualisiert (d. h.., ein Fluoreszenzfarbstoff, der bindet an Plasmamembranen und spontan Endocytosed). Eine frühere Studie hat gezeigt, dass Wachstum Kegel nicht bei 20 min nach Aβ1-42-Behandlung27zusammenbrechen; Daher wurden gesundes Wachstum Kegel von DIC imaging in Fahrzeug - oder Aβ1-42-behandelten Zellen nach 20 min ausgewählt. Nach der Aβ1-42-Behandlung zahlreichen fluoreszierende Membran Sonde-positiven Puncta verzeichneten Wachstum Kegel (Abbildung 4). Die Dichte der Fluoreszenz Membran Sonde-positiven Puncta in Wachstum Zapfen war signifikant erhöhte27. Dies deutet darauf hin, dass diese Aβ1-42-induzierte Wachstum Kegel Endozytose vor Zusammenbruch tritt.

Um die Rolle der Endozytose zu bestätigen, wurde eine DNA Plasmid Codierung EGFP-AP180 C-Terminus in kultivierten kortikalen Neuronen transfiziert. Zellen mit dem Ausdruck der AP180 C-Terminus selektiv gehemmt Clathrin-vermittelte Endozytose38,39. Wenn EGFP Ausdruck am Zellkörper in der Nervenzelle beobachtet wurde, galt die AP180 C-Terminus in das axonale Wachstum Kegel des Neurons ausgedrückt werden. Transfektion von AP180 C-Terminus blockiert Aβ1-42-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch (Abbildung 5)27.

Figure 1
Abbildung 1 : Inkubation von A Β1-42 Aggregate Aβ. (A) Aβ1-42 war aufgelöst in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,5 mM und für 7 Tage (nach der Inkubation) bei 37 ° C inkubiert, oder bei-30 ° C ohne Inkubation (keine Inkubation) gespeichert. Jede Aβ-Lösung wurde auf 0,1 mM verdünnt; 10 μL jeder verdünnte Lösung war dann, fiel auf Objektträgern und mit Deckgläsern abgedeckt. Bright-Feld Aufnahmen mit Schrägbeleuchtung wurden mithilfe von inversen Mikroskop B. Scale bar = 20 μm. (B) aggregiert Aβ1-42 oder Fahrzeug Pflege auf kultivierten Neuronen für 4 h. Nach der Behandlung die Neuronen wurden behoben und Immunostained für giftige Aβ-Oligomere. Fluoreszenz Bilder (rot) und Hellfeld Bilder mit Schrägbeleuchtung (grau) angezeigt werden. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : A Β1-42-induzierte axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch. Nach Aβ1-42 oder Fahrzeug-Behandlung Neuronen wurden behoben und Immunostained für Tau-1 (rot) und Mikrotubuli associated Protein 2 (MAP2, grün). Fluoreszenz und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Bilder angezeigt werden. Vergrößerte Ansichten der Regionen von Interesse (ROI, Rechtecke) finden Sie unten die entsprechenden Bilder. Weiße Maßstabsleisten = 50 μm; schwarze Skala Balken = 10 μm. Diese Zahl wurde von Kuboyama Et al., 201527geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Live Cell Imaging vor und nach A Behandlung der β1-42. Nach 4 Tagen Kultur, Zellen wurden zu einem inversen Mikroskop und DIC Aufnahmen wurden alle 5 min. Zeitraffer Bilder angezeigt werden. Die Ziffern stehen für Minuten: Sekunden nach dem Auftragen der aggregierten Aβ1-42 (Endkonzentration, 0,5 μM). Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : 20 Minuten von A Β1-42 Behandlung induzierte Endozytose. Kortikale Neuronen waren für 4 Tage kultiviert und mit einem Fluoreszenz-Membran-Sonde behandelt. Neuronen wurden dann 20 min mit Aβ1-42 oder Fahrzeug behandelt. Fluoreszenzbilder der Wachstum Zapfen werden angezeigt. Die gelbe gepunktete Linien repräsentieren die Umrisse der Wachstum Kegel. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Ausdruck des AP180-C-Terminus blockiert Aβ1-42-induzierte Kollaps. Vier Tage nach der Transfektion von EGFP (A, B) oder EGFP-AP180 C-Terminus (C, D); Aβ1-42 (B, D) oder Auto (A, C) wurde hinzugefügt, um kortikale Neuronen für 1 h DIC (oberen Platten) und (untere Verkleidungen) Fluoreszenzbilder angezeigt werden. Pfeile zeigen Wachstum Kegel. Skalieren von Balken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das Protokoll in dieser Studie beschriebenen aktiviert die Beobachtung der frühen Phänomene in axonale Wachstum Zapfen nach Aβ1-42-Behandlung. Aβ1-42 induzierte Endozytose in axonale Wachstum Zapfen innerhalb von 20 min, und Wachstum Kegel Zusammenbruch wurde innerhalb 1 h nach Behandlung beobachtet. Diese Endozytose wurde wahrscheinlich durch Clathrin vermittelt. Durch die Verwendung dieses Protokolls, bestätigte die Hemmung der Clathrin-vermittelte Endozytose um Aβ1-42-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch und axonalen Degeneration in kultivierten Neuronen27zu verhindern. Darüber hinaus vermindert die Hemmung der Clathrin-vermittelte Endozytose Aβ1-42-induzierte axonale Degeneration und Speicher Defizite in Vivo27. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Clathrin-vermittelte Endozytose ist eine vielversprechende therapeutische Möglichkeit zur AD-Prävention.

Dieses Protokoll wurde entwickelt von Zusammenbruch Assays für die axonale Wachstum Repellentien wie semaphorin 3A und Ephrin-A516,17,18,19,20. Kollaps-Assays wurden in Studien, die Beurteilung der Entwicklung der neuronalen Netzwerke verwendet. Ich habe gezeigt, dass dieses Protokoll auf pathologische Analysen, insbesondere solche, die Mechanismen der AD angewendet werden kann. jedoch möglicherweise eine Einschränkung, dass ca. 40 % Wachstum Zapfen in den gesunden Zustand zusammengebrochen. Dieser Anteil ist höher als Ergebnisse von kultivierten dorsalen Wurzel Ganglion Neuronen, die häufiger, in verwendet werden Tests16,17,18,19,20reduzieren. Daher könnte die unterschiedliche Zelltypen auf Unterschiede in den Zusammenbruch Verhältnissen verknüpft werden. Der Zusammenbruch Verhältnisse fanden in dieser Studie waren konsistent mit denen in früheren Studien mit normalen kultivierten kortikalen Neuronen40,41. Darüber hinaus induziert Aβ1-42 ähnliche hohen Wachstum Kegel Zusammenbruch im Vergleich mit anderen Zusammenbruch Faktoren, wie z. B. die semaphorin 3A und Ephrin-A527. Daher ist dieses Protokoll gültig für die Quantifizierung von Aβ1-42-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch. Diese Fixierung-Protokoll ist wichtig, die Form von Kegeln Wachstum beizubehalten. Wenn die Zellen konventionell mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert waren, können mehr Wachstum Zapfen durch die Fixierung-Verfahren (Daten nicht gezeigt) zusammengebrochen. Alternativ stehen Glutaraldehyd und Fixierung Puffer für starre Fixierung, wie zuvor beschrieben42; Allerdings weist Glutaraldehyd Autofluoreszenz, das ist eine erhebliche Behinderung für die Fluoreszenz-Bildgebung.

Eine kürzlich durchgeführte Studie mit dem gleichen Protokoll hat gezeigt, dass der Wasser-Extrakt aus Radix Polygalae (Wurzeln von Polygala Tenuifolia) Aβ1-42-induzierte Endozytose in kultivierten Neuronen gehemmt, axonalen Degeneration verhindert und Gedächtnisdefizite in reduziert eine transgenen Mausmodell der AD31. Ein neuer Kandidat für AD Prävention wurde mit diesem Protokoll festgestellt. Eine Kombination aus gen Transfektion und live Cell Imaging in diesem Protokoll könnte die andere zelluläre Ereignisse fanden in Axone und ihre Terminals vor und nach der Aβ Behandlung, z. B. Ca2 + Bildgebung Mikrotubuli Dynamik und Adhäsion Zelldynamik, zeigen die sind angeblich im Zusammenhang mit axonale Wachstum43,44,45. Dieses Protokoll kann helfen, genauere Mechanismen der Aβ-Toxizität zeigen und kann helfen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von AD führen.

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Disclosures

Der Autor hat nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von Forschungsstipendien von JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan und Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddY mice SLC
Eight-well culture slide Falcon 354108
poly D lysine Wako 168-19041
Culture medium, Neurobasal medium Gibco 21103-049
house serum Gibco 26050-088
glucose Wako 049-31165
L-glutamine Wako 074-00522
0.05% trypsin Gibco 25300-054
DNase I Worthington DP
soybean trypsin inhibitor Gibco 17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer Falcon 352350
B-27 supplement Gibco 17504-044
CO2 incubator Astec SCA-165DS
Amyloid β1-42 Sigma-Aldrich A9810
paraformaldehyde Wako 162-16065
sucrose  Wako 196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount polysciences 18606-20
Inverted microscope A Carl Zeiss Axio Observer Z1  Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20x Carl Zeiss 420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63x Carl Zeiss 440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X Nikon
anti-MAP2 IgG Abcam ab32454
anti-tau-1 IgG Chemicon MAB3420
anti-amyloid β antibody IBL 10379 clone 11A1
normal goat serum Wako 143-06561
bovine serum albumin Wako 010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanol Wako 169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 Invitrogen A11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 Invitrogen A11029
hot plate NISSIN NHP-M30N
cover glass Fisher Scientific 12-545-85
35 mm dish IWAKI 1000-035
Silicone RTV Shin-Etsu KE42T
hand punch Roper Whitney No. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX Invitrogen F35355
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution Gibco 14175-095
Transfection solution, Nucleofector solution Lonza VPG-1001
Electroporator, Nucleofector I Amaxa
Inverted microscope B Keyence BZ-X710
Image software, ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurowissenschaften Ausgabe 140 Amyloid β Axon Wachstum Kegel Zusammenbruch Endozytose live Cell Imaging
Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen
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Kuboyama, T. Visualizing Axonal… More

Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (140), e58229, doi:10.3791/58229 (2018).

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