Her præsenterer vi en protokol til brug af allerede eksisterende antibiotisk resistens-kassette sletning konstruktioner som grundlag for at foretage sletning mutanter i andre E. coli stammer. Sådan sletning mutationer kan mobiliseres og indsættes i den tilsvarende locus af en modtagende stamme ved hjælp af P1 bacteriophage transduktion.
En første tilgang til at studere funktionen af en ukendt gen i bakterier er at skabe en knock-out af dette gen. Her, beskriver vi en robust og hurtig protokol til at overføre genmutationer sletning fra én Escherichia coli stamme til en anden ved hjælp af generaliseret transduktion med bacteriophage P1. Denne metode kræver, at mutationen er valgbar (f.eks. baseret på gen forstyrrelser ved hjælp af antibiotika kassette indrykninger). Sådanne antibiotika kassetter kan mobiliseres fra en donor stamme og tilføres en modtagende stamme af interesse for hurtigt og generere nemt en gen sletning mutant. Den antibiotiske kassette kan designes til at omfatte flippase anerkendelse steder der tillader excision af kassetten ved en lokationsspecifik recombinase at producere en ren knock-out med kun ~ 100-base par lange ar sekvens i genomet. Vi demonstrere protokollen ved at udskære tamA genet kodning en forsamling faktor involveret i autotransporter Biogenese og teste effekten af denne knock-out på Biogenese og funktion af to trimeric autotransporter adhesins. Selvom genet sletning af P1 transduktion har sine begrænsninger, gøre lethed og hastighed af dens gennemførelse det et attraktivt alternativ til andre metoder til gen sletning.
En fælles første tilgang til at studere funktionen af et gen er at udføre knock-out mutagenese og observere den resulterende fænotype. Dette kaldes også omvendt genetik. Bakterien E. coli har været arbejdshesten i Molekylærbiologi for de sidste 70 år eller så, på grund af lethed af dens dyrkning og sin imødekommenhed til genmanipulation1. Flere metoder er blevet udviklet for at producere gen sletninger i E. coli, herunder markør exchange mutagenese2,3 og mere for nylig, recombineering bruger λ rød eller Rac ET systemer4,5 , 6.
I et almindeligt anvendte system, er kodning sekvenser af enkelte gener erstattet af en antibiotisk resistens kassette, der senere kan være skåret ud fra kromosom5,7. De kodning sekvenser erstattes, for eksempel ved en kanamycin (Kan) modstand kassette, der er flankeret af flippase (FLP) genkendelsessekvenser mål (FRT) på begge sider. FRT websteder er anerkendt af recombinase FLP, der medierer lokationsspecifikke rekombination mellem FRT websteder fører til sletning af Kan kassette. På denne måde opnås en fuldstændig sletning af en given genet kodende sekvens på efterlod kun en minimal ar sekvens af ca. 100 basepar (bp) (figur 1).
Lidt over et årti siden, blev den såkaldte Keio samling udviklet. Dette er en bakteriel bibliotek baseret på en standard laboratorium E. coli K12 stamme, hvor næsten alle ikke-væsentlige gener var individuelt slettet af λ røde rekombination7,8. Kloner i denne samling har en kodende sekvens erstattet med en punktafgiftspligtige Kan modstand kassette. Samlingen Keio har vist sig for at være et nyttigt redskab for mange applikationer9. En sådan anvendelse er produktion af sletning mutanter i andre E. coli stammer. Kan kassette fra en given sletning klon kan tilvejebringes af generelt transducing Bakteriofager, som P110,11,12,13,14. En phage bestand fremstillet af sådan en stamme kan derefter bruges til at inficere en modtager E. coli stamme af interesse, hvor en lav, men pålidelige frekvens Kan kassette-holdige region kan indarbejdes i den modtagende genom af homologe rekombination (Figur 2). Transductants kan vælges for vækst på de Kan-holdige medium. Efter dette, eventuelt fjernelse af antibiotikaresistens kassette kan FLP recombinase også leveres til transductant stammen i trans. Efter hærdning FLP-holdige plasmidet, som bærer en ampicillin (Amp) modstand markør, Kan og Amp-følsomme kloner er screenet for, og den korrekte excision af vildtype kodende sekvens og Kan kassette er verificeret af kolonien PCR.
Her præsenteres en detaljeret protokol, der beskriver hvert af trinene i producerer en knock-out E. coli stamme baseret på den strategi, der er skitseret ovenfor. Som et eksempel, er en sletning af tamA -genet påvist. tamA koder en ydre membran β-tønde protein, der er en del af Transport og montage modul (TAM), som er involveret i Biogenese af visse autotransporter proteiner og pili15,16,17. Denne knock-out stamme blev derefter brugt til at undersøge effekten af tamA sletning på Biogenese to trimeric autotransporter adhesins (TAAs), Yersinia adhesin YadA og E. coli immunglobulin (Ig)-bindende TAA EibD 18,19.
P1 transduktion er en hurtig, robust og pålidelig metode til at generere gen sletninger i E. coli. Det fremgår her af transducing en tamA sletning mutant fra en Keio donor stamme til en BL21-afledte modtager. Hovedstadier i signaltransduktion proces er produktionen af den transducing lysate, transduktion selv, excision af Kan modstand kassette og verifikation af knock-out ved PCR. I alt, processen tager ca 1 uge og kræver ingen molekylærbiologiske metoder der skal anvendes, ud over den endelige PCR …
The authors have nothing to disclose.
Keio samling stammer blev indhentet fra de nationale BioResource projekt (NIG, Japan): E. coli. Vi takker Dirk Linke (Institut for biovidenskab, universitetet i Oslo) for hans fortsatte støtte. Dette arbejde blev finansieret af Forskningsrådet for Norge unge forsker grant 249793 (til Jack C. Leo).
Strains | |||
E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
Plasmids | |||
pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
Chemicals | |||
Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
Agar | BD Bacto | 214010 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Ampicillin | Applichem | A0839 | |
Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
Calcium chloride | Merck | 102382 | |
Chloroform | Merck | 102445 | |
Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
DNA dye | Thermo | S33102 | |
DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
DNase I | Sigma | DN25 | |
dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
EDTA | Applichem | A2937 | |
Glycerol | VWR | 24388 | |
goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
HEPES | VWR | 30487 | |
Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
Kanamycin | Applichem | A1493 | |
Lysozyme | Applichem | A4972 | |
Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
Sodium chloride | VWR | 27808 | |
tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
Tryptone | VWR | 84610 | |
Tween20 | Sigma | P1379 | |
Yeast extract | Merck | 103753 | |
Equipment | |||
Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
CCD camera | Kodak | 4000R | |
Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
Incubator | VWR | 390-0482 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Water bath | GFL | D3006 | |
Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |