Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'uso di pre-esistente antibiotico resistenza-cassette eliminazione costrutti come base per la fabbricazione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . Tali mutazioni di omissione possono essere mobilitati e inseriti il locus corrispondente di un ceppo destinatario mediante trasduzione del batteriofago P1.
Abstract
Un primo approccio per studiare la funzione di un gene sconosciuto nei batteri è quello di creare un knock-out di questo gene. Qui, descriviamo un protocollo robusto e veloce per trasferire le mutazioni di omissione del gene da un ceppo di Escherichia coli a altro mediante trasduzione generalizzata con il batteriofago P1. Questo metodo richiede che la mutazione sia selezionabile (ad es., basato su interruzioni di gene usando gli inserimenti cassetta antibiotico). Tali cassette antibiotici possono essere mobilitate da un ceppo di donatore e introdotto in un ceppo destinatario di interesse per rapidamente e facilmente generano un mutante di delezione del gene. La cassetta di antibiotica può essere progettata per includere siti di riconoscimento flippase che consentono l'asportazione della cassetta da una ricombinasi site-specific per produrre un knock-out pulito con solo una sequenza di ~ 100-base-coppia-lunga cicatrice nel genoma. Dimostriamo il protocollo battendo fuori il tamA gene codifica per un fattore di assemblaggio coinvolto nella biogenesi autotransporter e testare l'effetto di questo knock-out sulla biogenesi e funzione di due trimerico autotransporter adesine. Sebbene l'omissione del gene di trasduzione P1 ha i suoi limiti, la facilità e la velocità della sua attuazione rendono una valida alternativa ad altri metodi di omissione del gene.
Introduction
Un primo approccio comune per studiare la funzione di un gene è quello di eseguire la mutagenesi di knock-out e osservare il fenotipo risultante. Questo è definito anche genetica inversa. Il batterio e. coli è stato il cavallo di battaglia della biologia molecolare negli ultimi 70 anni o così, a causa della facilità della sua coltura e la sua disponibilità a manipolazione genetica1. Sono stati sviluppati diversi metodi per produrre le eliminazioni genica in Escherichia coli, compreso indicatore cambio mutagenesi2,3 e, più recentemente, recombineering utilizzando il λ rosso o Rac ET sistemi4,5 , 6.
In un sistema ampiamente usato, sequenze di codificazione dei geni individuali vengono sostituiti da una cassetta di resistenza agli antibiotici che possa successivamente essere asportata dal cromosoma5,7. Le sequenze di codificazione sono sostituite, per esempio da una cassetta di resistenza alla kanamicina (Kan), fiancheggiata da siti di destinazione (FRT) riconoscimento flippase (FLP) su entrambi i lati. I siti FRT sono riconosciuti dalla ricombinasi FLP, che media site-specific di ricombinazione tra i siti FRT che conduce all'eliminazione della cassetta Kan. In questo modo, è possibile una cancellazione completa della sequenza codificante di un dato gene, lasciando dietro di sé solo una sequenza di cicatrice minima di circa 100 coppie di basi (bp) (Figura 1).
Poco più di un decennio fa, è stata sviluppata il cosiddetta collezione di Keio. Si tratta di una libreria batterica basata su un ceppo di e. coli K12, standard di laboratorio dove quasi tutti i geni non essenziali sono stati eliminati singolarmente da λ ricombinazione rosso7,8. I cloni all'interno della raccolta ogni hanno una sequenza di codificazione sostituito con una cassetta di resistenza Kan soggetti ad accisa. La collezione di Keio ha dimostrato di essere uno strumento utile per molte applicazioni9. Una tale applicazione è la produzione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . La cassetta di Kan da un clone di eliminazione specificato possa essere mobilitata da generalmente transducing batteriofagi, ad esempio P110,11,12,13,14. Un brodo di fago preparato da una simile tensione quindi può essere utilizzato per infettare un destinatario Escherichia coli ceppo di interesse, dove ad una frequenza bassa ma affidabile il Kan regione contenente cassette possa essere incorporate nel genoma del destinatario tramite la ricombinazione omologa (Figura 2). Transductants possono essere selezionati per la crescita sul supporto di Kan-contenente. In seguito, se si desidera la rimozione della cassetta di resistenza agli antibiotici, la ricombinasi FLP possono essere forniti al ceppo transductant in trans. Dopo l'indurimento il plasmide contenente FLP, che trasporta un marcatore di resistenza all'ampicillina (Amp), Kan e Amp-sensibile cloni sono schermati per, e la corretta asportazione del selvaggio-tipo sequenza di codificazione e la cassetta di Kan sono verificate mediante PCR della Colonia.
Qui, un protocollo dettagliato è presentato, che descrive tutti i passaggi nella produzione di un knock-out ceppo di e. coli sulla base della strategia descritta sopra. Ad esempio, è dimostrata un'omissione del gene di tamA . tamA codifica per una proteina del β-barilotto di membrana esterna che è una parte del trasporto e montaggio modulo (TAM), che è coinvolto nella biogenesi di determinate proteine autotransporter e pili15,16,17. Questo ceppo di knock-out è stato poi utilizzato per esaminare l'effetto dell'eliminazione tamA sulla biogenesi di due trimerico autotransporter adesine (TAA), l'adesina di Yersinia YadA e l'immunoglobulina (Ig) di Escherichia coli -associazione TAA EibD 18,19.
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Protocol
1. ceppi e plasmidi
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Ceppi batterici
- Utilizzare l'e. coli ceppi BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21 (DE3)20e BL21ΔABCF21. Per ulteriori informazioni, vedere Tabella materiali .
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Batteriofagi
- Utilizzare il fago P1vir per la trasduzione generale. Memorizzare il fago come un brodo liquido con poche gocce di cloroformio (Vedi punto 2.2). Per ulteriori informazioni, vedere Tabella materiali.
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Plasmidi
- Utilizzare i plasmidi seguenti in questo protocollo: pCP2022, pIBA2-YadA23e pEibD1024. Come plasmidi di controllo, utilizzare pASK-IBA2 e pET22b (Vedi Tabella materiali).
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Condizioni di crescita
- Propagare i batteri in Lisogenesi brodo (LB) medio25 con agitazione vigorosa (180 – 200 giri/min) a 37 ° C o 30 ° C nel caso di BL21ΔABCF e pCP20 dei ceppi.
- Eseguire il plasmide indurimento a 43 ° C.
- Per un mezzo solido, supplemento LB con agar 1% (p/v).
- Per top agar, supplemento LB con 0,7% agar e 10 mM CaCl2 ed autoclave il mezzo. Utilizzo medio SOC per il recupero dopo l'elettroporazione26.
- Utilizzare le seguenti concentrazioni di antibiotici: 100 μg/mL per Amp e 25 μg/mL per kan.
2. preparare un fago lisato
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Infezione del ceppo donatore
- Crescere il ceppo donatore JW4197 in 5 mL di LB medium supplementato con 10 mM di CaCl2 e, facoltativamente, con Kan (25 µ g/mL) di densità ottica a 600 nm (OD600) di ~ 1.0. Misurare il valore di600 OD utilizzando uno spettrofotometro.
- Fare una serie di diluizioni di uno stock di fago P1 esistente nel medio LB: consigliato diluizioni sono tra 10-3 a 10-7.
- Mix 200 μL della sospensione batterica e 100 μL di una diluizione dei fagi dato in una provetta da centrifuga da 15 mL o equivalente. Preparare le provette come molti come diluizioni dei fagi. Incubare le provette per 20 min a 37 ° C senza agitazione.
- Aggiungere circa 3 mL di agar superiore fusa (~ 50 ° C) completati con 10 mM di CaCl2 ai tubi, mescolare il contenuto accuratamente nel Vortex le provette poco e versare le miscele sulle piastre LB preriscaldate a fare strati anche.
- Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.
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Preparazione del lysate
- Il giorno seguente scegliere un piatto con un semi-confluente crescita delle placche dei fagi. Su una piastra semi-confluente, circa metà della superficie della piastra è chiara (Figura 3).
- Raschiare lo strato di agar superiore da tale piastra utilizzando un ciclo di inoculazione o uno strumento simile e posizionare l'agar superiore in una provetta da centrifuga. Aggiungere 1 – 2 mL di LB e una goccia di cloroformio e vortexare la provetta vigorosamente per ~ 1 min. Aggiungi il cloroformio in una cappa aspirante.
- Centrifugare la provetta per 15 min a 4.000 x g o più veloce per agglomerare le cellule batteriche e agar.
- Spostare il surnatante in una microcentrifuga fresca, evitando di trasportare più di eventuali detriti dal pellet. Aggiungere 2 gocce di cloroformio e memorizzare il lisato 4 – 10 ° c. Aggiungere cloroformio in una cappa aspirante. Non congelare il fago lisato come questo si tradurrà in una riduzione significativa del numero di particelle infettive.
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Determinare il titolo lisato
- Crescere BW25113 in LB completati con 10 mM di CaCl2 a 37 ° C fino a quando la cultura raggiunge un OD600 di ~ 1.0.
- Preparare una serie di diluizioni del fago lisato in LB (ad es., 10-6-10-9).
Nota: Fare attenzione a dispensare il campione dalla parte superiore del lisato per evitare di trasferire il cloroformio per le diluizioni. - Mix 200 μL della sospensione batterica e 100 μL di una diluizione dei fagi dato in una provetta da centrifuga da 15 mL o equivalente. Preparare le provette come molti come diluizioni dei fagi. Incubare le provette per 20 min a 37 ° C senza agitazione.
- Aggiungere circa 3 mL di agar superiore fusa (~ 50 ° C) completati con 10 mM di CaCl2 ai tubi, mescolare il contenuto accuratamente nel Vortex le provette poco e versare il composto su piatti preriscaldati della libbra a fare strati anche.
- Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.
- Il giorno seguente contare il numero delle placche (regioni libere nella stuoia batterica) per ogni piatto e calcolare il titolo del lisato utilizzando la seguente formula:
Esempio: Su piastre con le diluizioni 10-7, 10-8e 10-9, ci sono 231, 27 e 2 placche, rispettivamente. Come 100 μL di ogni diluizione è stato usato per l'infezione, e perché il titolo è espresso come diformazione unità (pfu) / mL, il fattore di placcatura è 10. Questi numeri vengono inseriti nella formula:
Così, il titolo è di circa 2 x 1010 infettiva dei fagi particelle/mL.
3. P1 trasduzione
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Preparare le cellule recettive
- Crescere il destinatario ceppo BL21ΔABCF in LB completati a densità ottica a 600 nm (OD600) di ~ 1.0. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare il valore di600 OD.
- Calcolare il volume del fago lisato necessario per raggiungere una molteplicità di valore di infezione (MOI) pari a 0,5. Per calcolare il MOI, stimare il numero di batteri basata sulla OD600 della cultura. Si supponga che un valore di600 OD di 1.0 corrisponde a ~ 109 cfu/mL. Calcolare il volume richiesto basato sul noto titolo del lisato.
Esempio (basato sul titolo calcolato nell'esempio dopo passo 2.3.6):
- Aggiungere CaCl2 alla cultura destinatario ceppo a 10 mM e mescolare. Prelevare 1 mL della cultura per la trasduzione.
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Esecuzione di trasduzione
- Aggiungere il volume appropriato di lisato dei fagi a 1 mL di coltura destinatario (compreso CaCl2 a 10 mM) calcolata al punto 3.1.2 e mescolare delicatamente.
Nota: Fare attenzione a dispensare il campione dalla parte superiore del lisato per evitare di trasferire cloroformio al mix. - Incubare in modo statico il mix per 20 min a 37 ° C.
- Fermare l'infezione con l'aggiunta di citrato di sodio, pH 5.5, a 100 mM.
- Centrifugare i batteri (5.000 x g per 2 min) e rimuovere il supernatante, quindi li risospendere in 1 mL di LB fresco completati con citrato di sodio 100 mM, pH 5.5.
- Lavare le cellule due volte più come descritto al punto 3.2.4 per garantire la rimozione di fagi gratis e di calcio.
- Risospendere i batteri in 1 mL di LB fresco completati con citrato di sodio 100 mM, pH 5.5. Incubare i batteri a 30 ° C per 1 h con agitazione (> 100 giri/min).
- Raccogliere i batteri mediante centrifugazione (5.000 x g per 2 min) e li risospendere in ~ 100 μL di LB con citrato di sodio 100 mM, pH 5.5.
- Diffondere i batteri su una piastra di LB completati con Kan 25 µ g/mL e citrato di sodio di 10 mM, pH 5.5 e crescere i batteri a 30 ° C fino a quando le colonie apparire (~ 24 h).
- Aggiungere il volume appropriato di lisato dei fagi a 1 mL di coltura destinatario (compreso CaCl2 a 10 mM) calcolata al punto 3.1.2 e mescolare delicatamente.
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Selezionando il transductants
- Una volta colonie cresciute sulla piastra di selezione, li restreak su LB + Kan per singole colonie e crescono a 30 ° C fino a singole colonie appaiono.
4. asportare la cassetta Kan
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La trasformazione con il plasmide di ricombinazione
- Rendere il electrocompetent del ceppo di BL21ΔABCF Kan-resistente.
- Crescere il ceppo da una singola Colonia in fresco LB (5 mL) completati con Kan (25 µ g/mL) a 30 ° C fino a quando il OD600 è ~0.5 – 0,7.
- Da qui, procedere nel modo seguente a 4 ° C o su ghiaccio. Centrifugare i batteri (5.000 x g per 10 min) e rimuovere il surnatante.
- Lavare il pellet cellulare con gelida acqua distillata due volte ripetendo il passaggio precedente di centrifugazione e, infine, risospendere le cellule in 100 µ l di gelida glicerolo al 10%.
- Raffreddare le provette di elettroporazione di 1 mm sul ghiaccio.
- Aggiungere 1 pg del plasmide DNA (pCP20) per la sospensione di eritrociti, mescolare delicatamente la sospensione e trasferirlo in una provetta di elettroporazione raffreddato.
- Impostare il electroporator a 1,8 kV ed electroporate le cellule.
- Salvataggio di cellule trasformate aggiungendo 1 mL di terreno SOC e coltivarle per 1 h a 30 ° C.
- Piastra di 100 µ l di cellule su LB + Amp piastre e crescere le cellule a 30 ° C durante la notte.
- Rendere il electrocompetent del ceppo di BL21ΔABCF Kan-resistente.
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Induzione della ricombinazione
- Pick singole colonie dal LB + Amp piastra e inoculare LB fresco omettendo tutti gli antibiotici.
- Crescere le cellule alla temperatura non permissivi (43 ° C) durante la notte per indurre l'espressione della ricombinasi FLP.
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Selezionando ricombinanti
- Effettuare diluizioni seriali e piastra 50 µ l di una diluizione di6 105-10 su piastre non selettivi e crescere in una notte a 30 ° C.
5. Verifica della delezione genica
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Verifica della perdita del plasmide e ricombinazione di successo
- Colonie di singola striscia da piastre preparate al punto 4.3.1 su Kan, LB, LB + Amp e piatti della libbra senza antibiotici, in questo ordine. Per facilitare le striature, utilizzare una griglia di Colonia (vedere complementare File 1). Crescere le piastre a 30 ° C fino a quando le colonie apparire (~ 24 h).
- Prendere 10 – 20 cloni che hanno cresciuto sulla piastra non selettiva, ma non è riuscito a crescere su terreni selettivi per ulteriori verifiche.
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Verifica aggiuntiva di PCR della Colonia
- Eseguire una colonia PCR con primer che fiancheggiano il tamA sequenza di codificazione (Vedi Tabella materiali).
- Preparare un mix PCR master. La quantità di miscela necessaria dipende dal numero delle colonie da testare (vedere l'esempio in tabella 1). Mescolare i reagenti sul ghiaccio, aggiungere la polimerasi Ultima.
- Mescolare accuratamente il PCR master mix, quindi dispensare 20 µ l in tubi di una striscia PCR. Prendere una piccola quantità di ogni Colonia sarà proiettato utilizzando una pipetta sterile e aggiungerlo ad un tubo. Ricordati di includere il ceppo originario di destinatario per il confronto. Facoltativamente, includono anche il ceppo di donatore.
- Eseguire una reazione di PCR (Vedi tabella 2 per il programma utilizzato).
- Preparare un gel di agarosio all'1%.
- Per un gel 50 mL, 0,5 g di agarosio di misurare e aggiungere 50 mL di tampone TAE (40 mM Tris, acido acetico 20 mM e 1 mM EDTA, pH 8.0). Riscaldare la miscela in un forno a microonde fino a sciolta tutti i agarosio.
- Una volta che ha dissolto l'agarosio, raffreddare la soluzione a circa 50 ° C e quindi aggiungere 5 μL di DNA che macchia di tintura. Mescolare bene la soluzione e versarlo in un vassoio di gel in una camera di fusione. Inserire una o più righe di pettini bene in modo che ci sono pozzi sufficiente per tutti i campioni, così come marcatori di dimensioni molecolari. Lasciare che il gel da impostare per 30 min.
- Una volta che viene completata l'esecuzione PCR, aggiungere 4 µ l di 6 x tintura di caricamento del DNA di ciascun campione. Mettere il gel nella camera di elettroforesi e aggiungere tampone TAE finche ' i pozzi sono coperti.
- Applicare 10 – 15 µ l da ogni reazione di PCR ad un pozzo nel gel. Anche aggiungere 5 µ l di marcatore molecolare. Quindi, eseguire il gel per 30 min a 75 V.
- Una volta che viene completata l'esecuzione, l'immagine del gel usando un imager di luce blu.
6. altre tecniche
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Espressione della proteina
Nota: L'espressione delle proteine di prova (YadA ed EibD) è stato descritto dettagliatamente altrove23,24. Si tratta di un breve riassunto delle principali operazioni.- Trasformare BL21ΔABCF ΔtamA with i plasmidi necessari (pIBA2-bla e pEibD10 e i corrispondente plasmidi di controllo) e selezionare per trasformanti su LB + Amp.
- Per l'espressione della proteina, inoculare 100 mL di LB medium + Amp con 1 mL di una coltura durante la notte di batteri trasformati e crescere questi a 30 ° C fino al medio-registro fase, momento in cui, inducono la produzione di proteine con entrambi anidrotetraciclina (a 100 ng/mL) o isopropilico thiogalactoside (a 0,5 mM).
- Dopo 2 h di induzione a 30 ° C, misurare la torbidità delle culture e raccogliere un numero di celle corrispondenti a 50 mL al OD600 = 1.0 mediante centrifugazione le culture per 15 min a 4.000 x g. Lavare la pallina 1x con 10 mM HEPES, pH 7.4 e quindi sia conservare a-20 ° C o processo esso più ulteriormente come descritto al punto 6.2.
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Estrazione della membrana esterna
Nota: L'estrazione della membrana esterna è effettuata come descritto in dettaglio da Leo et al. 27. i passi principali sono riassunte di seguito.- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 10 mM HEPES, pH 7.4, completati con 10mm MgCl2 e MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) e un pizzico di dnasi I.
- Lisare le cellule (per esempio, utilizzando un battitore di tallone).
- Centrifugare le cellule poco (2 min a 15.600 x g) per rimuovere i detriti cellulari e spostare il surnatante in una nuova provetta.
- Centrifugare le cellule per 30 min a 16.000 x g, dopo di che, risospendere il pellet in 400 μL di 1% N-lauroyl sarcosine in 10 mM HEPES, pH 7,4.
- Incubare le cellule con agitazione per 30 min a temperatura ambiente, dopo di che, li Centrifugare per 30 min come sopra.
- Lavare il traslucido a pellet 1x con 200 μL di 10 mM HEPES, pH 7.4 e quindi esso risospenda in 30 μL di 10 mM HEPES e aggiunga 10 μL di tampone di SDS-PAGE: 4x.
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Analisi di attività
Nota: Eseguire analisi SDS-PAGE e di attività per YadA ed EibD come descritto28. I passaggi principali sono riassunte di seguito. -
SDS-PAGE
- Riscaldare i campioni a 50 ° C per 5 min prima di caricarle su un gel di poliacrilammide, per evitare di denaturare le proteine.
- Dopo la separazione in SDS-PAGE, è possibile trasferire le proteine ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF).
- Dopo il trasferimento, bloccare la membrana con latte scremato in polvere 2% in PBS.
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Macchia occidentale lontano YadA-collagene
- Dopo il blocco, aggiungere il tipo di collagene bovino che diluito in tampone bloccante a una concentrazione di 10 μg/mL e incubare la membrana per 1 h.
- Lavare la membrana 2 x con PBS + 0.05% Tween20 (PBS-T).
- Aggiungere l'anticorpo primario (monoclonale anti-collagene COL-1) alla membrana, 1:2,000 diluito in tampone bloccante.
- Dopo incubazione la membrana per 1 h, lavare 2x come indicato al punto 6.3.2.2 e quindi aggiungere l'anticorpo secondario [coniugato con perossidasi (HRP) di capra anti-topo IgG-rafano], diluito 1: 10.000 in tampone bloccante.
- Incubare la membrana per 1 h, poi lavarlo 2 volte con PBS-T. Aggiungere un substrato chemiluminescente avanzato alla membrana secondo le istruzioni del produttore e rilevare la band utilizzando una telecamera CCD.
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EibD-IgG analisi obbligatoria
- Dopo il blocco, aggiungere un anticorpo secondario (capra anti-coniglio HRP), diluito 1:2,000 in tampone bloccante.
- Incubare la membrana per 1 h, poi lavarlo 2 volte con PBS. Eseguire la rilevazione chemiluminescente come indicato al punto 6.3.2.5.
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Representative Results
Generazione di un tamA Knock-out di BL21ΔABCF:
La strategia delineata sopra è stata utilizzata in precedenza per produrre un ceppo derivato di BL21 (DE3), un ceppo di laboratorio standard utilizzato per la produzione di proteine, che è ottimizzata per la produzione di proteine di membrana esterna e denominata BL21ΔABCF21. Questo ceppo non dispone di quattro geni che codificano per proteine della membrana esterna abbondanti e, di conseguenza, è in grado di produrre proteine della membrana esterna più heterologously espresse rispetto al ceppo selvaggio-tipo. Per verificare se il TAM è coinvolto nella biogenesi TAA, il gene di tamA è stato eliminato in questo sfondo.
Un lisato di P1 è stato preparato dal ceppo collezione Keio JW4179, dove la sequenza di codificazione del gene di tamA (precedentemente chiamata yftM) è sostituito da una cassetta di resistenza di Kan. Quindi, un esperimento di trasduzione è stato effettuato con BL21ΔABCF come il ceppo destinatario. Diverse colonie di Kan-resistenti sono stati ottenuti, dopo che due sono stati scelti per l'asportazione della cassetta Kan. Il plasmide pCP20, codifica la ricombinasi FLP, è stato introdotto in questi cloni e, successivamente, curato da una crescente a 43 ° C in assenza di una selezione antibiotica. Un numero di cloni sono stato schermato per sensibilità sia Amp (che è un indicatore di pCP20) e Kan, e sono stati ottenuti diversi cloni sensibili ad entrambi. Questi cloni sono stati verificati da Colonia PCR utilizzando primers che fiancheggiano il tamA sequenza codificante e trovato che il gene di tamA era stato eliminato correttamente (Figura 4).
Ruolo di TamA nella biogenesi TAA:
TamA ha dimostrato di essere coinvolti nella biogenesi di alcuni classici autotransporters16 e l'inversa autotransporter intimin15. Per verificare se TamA è importante per la biogenesi di TAA, BL21ΔABCF ΔtamA è stato trasformato con plasmidi che codificano per due proteine di prova, l'adesina di Yersinia YadA e l'Escherichia coli Ig-binding protein EibD. Queste proteine sono noti per esprimere bene in e. coli e sono stati utilizzati come modelli per la biogenesi TAA in precedenti studi23,28.
Dopo l'induzione della produzione di proteine, le frazioni di membrana esterna delle culture espressione sono state isolate e analizzate da SDS-PAGE. I campioni non sono stati bolliti per dimostrare trimerizzazione delle proteine. I trimeri eseguire alle dimensioni sopra 100 kDa, considerando che i monomeri hanno previsto misure di 45 kDa (bla) e 51 kDa (EibD). Sono state osservate differenze principali tra i livelli di espressione in BL21ΔABCF e BL21ΔABCF ΔtamA, sebbene YadA sembra essere prodotto a livelli leggermente inferiori nel ceppo ditamA Δ (Figura 5A). Tuttavia, il contrario sembra essere il caso per EibD.
Per esaminare se la mancanza di TamA possa influenzare la corretta pieghevoli o trasporto delle proteine, la loro capacità di legarsi ai leganti è stato testato. Per YadA, questo è stato compiuto da una macchia di lontano-occidentale di collagene (figura 5B). YadA, in entrambi i ceppi, associato collagene a un livello simile, dimostrando che la proteina sia correttamente piegato e funzionale. Allo stesso modo, attività di IgG-associazione di EibD a due ceppi correlata con il livello di espressione (Figura 4). Questi risultati dimostrano che l'eliminazione di tamA non hanno un effetto significativo sulla biogenesi TAA, almeno non per questi due modello TAAs.
Figura 1: generazione di knock-out con cassette di antibiotici soggetti ad accise. Per produrre il gene knock-out, un gene di interesse (Gene B in questo esempio) è sostituito da una cassetta di resistenza Kan affiancata da siti FRT. La cassetta di FRT-Kan, a sua volta, è affiancata da breve (~ 50 bp) si estende della sequenza omologa alle regioni a Monte e a valle del Gene B. La sequenza codificante del Gene B viene scambiata per la cassetta di FRT-Kan di λ rosso ricombinazione. Una volta che questo è compiuto, la cassetta di Kan stessa può essere rimosso introducendo la ricombinasi FLP, che mediano una ricombinazione del sito tra i siti FRT. Questo accise la cassetta Kan, lasciando un minimo (~ 100 bp) cicatrice sequenza in luogo del B. Per informazioni dettagliate, vedere Baba et al. 7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: omissione del Gene di trasduzione P1. Il donatore ceppo (beige) trasporta una cassetta Kan che ha sostituito il gene di interesse (giallo) sul cromosoma (blu). Il donatore è stato infettato del batteriofago P1. Il fago moltiplica nel ceppo donatore, producendo un gran numero di progenie. Sono più selvaggio-tipo (rosso genoma), ma una frazione sono transducing fagi che hanno incorporato una porzione del donatore ceppo cromosoma piuttosto che dei fagi DNA (genoma blu). Una parte di questi conterrà la cassetta Kan (giallo genoma). Alla fine, la cellula ospite infetto Lisi e rilascia i fagi nel mezzo. Questi sono usati per preparare un lisato. Nell'esperimento di trasduzione, il ceppo destinatario (blu chiaro) è infettato il lisato preparato dal ceppo donatore. In una minoranza dei casi, il destinatario è stato infettato da un trasduzione dei fagi che trasportano la cassetta Kan (mostrata qui). Se le regioni adiacenti alla cassetta Kan subiscono la ricombinazione omologa, la cassetta di Kan è incorporata nel cromosoma destinatario sostituendo l'allele endogeno, con conseguente cloni Kan-resistenti che possono essere selezionati per. L'aggiunta di ricombinasi FLP su un plasmide curabile accise la cassetta Kan, lasciando solo una cicatrice breve sequenza (mostrata qui in giallo), che ritorna il clone al fenotipo Kan-sensibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: esempi di piastre dopo un'infezione P1. (A), questo pannello mostra una piastra con placche individuali. (B), questo pannello mostra un piatto semi-confluente. (C) questo pannello mostra una piastra sopra-infettata, dove quasi tutti i batteri sono state fatte l'elettrolisi da fago. Alcune colonie resistenti sono cresciuti fuori dello strato di agar superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Eliminazione del tamA sequenza di codificazione. L'allele di eliminazione di tamA::kan è stato introdotto nel ceppo BL21ΔABCF di trasduzione del P1. Dopo l'asportazione della cassetta Kan, una sequenza di cicatrice (~ 100 bp) è ciò che resta del locus di tamA . Ciò è stata verificata mediante PCR, utilizzando primers fiancheggianti il sito di eliminazione. In BL21ΔABCF e ceppo parentale, BL21 (DE3), la PCR dà un prodotto la lunghezza del tamA (la dimensione prevista è di 1,7 kilobasi paia) sequenza di codificazione. In BL21ΔABCF, dove è stata asportata la cassetta Kan, il prodotto corrisponde alla sequenza previsto cicatrice (145 bp). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Espressione di TAAs da uno sforzo di eliminazione di tamA . (A), questo pannello spettacoli SDS-PAGE delle membrane esterne preparate dalle cellule che esprimono TAAs (YadA o EibD) e controlli di vettore (pIBA2 e pET22). I ceppi sono BL21ΔABCF e suoi derivato ceppo carente TamA (ΔtamA). (B), questo pannello mostra una macchia di lontano-occidentale di collagene di YadA campioni. I campioni di YadA e pIBA2 controlli da pannello A sono stati trasferiti su una membrana PVDF e incubati con collagene di tipo I. Erano quindi sondati con un anticorpo anti-collagene e rilevati da ECL. (C), questo pannello mostra un'analisi obbligatoria dell'anticorpo per campioni EibD. I campioni di EibD e pET22 controlli da pannello A erano trasferiti ad una membrana PVDF e incubati con un anticorpo secondario coniugato HRP e poi rilevati da ECL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | 1 x misto | mix di x 7 |
| Acqua di PCR-grado | 17 Μ l | 119 Μ l |
| della polimerasi tampone 10x | 2 Μ l | 14 Μ l |
| mix di deossiribonucleotide 10mm | 0,4 Μ l | 2,8 Μ l |
| Primer in avanti 100 µM | 0.2 Μ l | 1,4 Μ l |
| Reverse primer 100 µM | 0.2 Μ l | 1,4 Μ l |
| La Taq DNA polimerasi | 0.2 Μ l | 1,4 Μ l |
| Totale | 20 Μ l | 140 Μ l |
Tabella 1: Colony PCR master mix. La quantità di miscela dipende dal numero delle colonie da sottoporre a screening. Inoltre, preparare una reazione di controllo (ceppo destinatario originario). Ad esempio, se cinque cloni di screening, sono necessari sei reazioni, tra cui il controllo. Vale la pena di preparare una reazione supplementare per assicurarsi che ci sia abbastanza miscela di PCR per tutti i campioni (ripetuto pipettaggio amplifica piccoli errori di pipettaggio). In questo esempio, preparare una miscela di 7x (5 colonie, 1 controllo e 1 reazione supplementare).
| Passo | Temperatura | Tempo | Note |
| 1. | 94 ° C | 3 min | |
| 2. | 94 ° C | 30 s | |
| 3. | 50 ° C | 30 s | |
| 4. | 70 ° C | 2 min | 1 min/kb per essere amplificati, arrotondare |
| Ritorna al passaggio 2 24 volte | |||
| 5. | 70 ° C | 5 min | |
| 6. | 12 ° C | Per sempre | stretta finale |
Tabella 2: Colony PCR programma.
Complementare File 1: un esempio di griglia di Colonia. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La trasduzione P1 è un metodo veloce, robusto e affidabile per la generazione di delezioni del gene dentro e. coli. Questo è dimostrato qui di trasdurre un mutante di delezione di tamA da un ceppo di donatore Keio a un destinatario BL21-derivato. Le principali fasi del processo di trasduzione sono la produzione della trasduzione lisata, trasduzione del sé, l'asportazione della cassetta Kan resistenza e per la verifica di knock-out mediante PCR. In totale, il processo richiede circa 1 settimana e non richiede nessun metodi di biologia molecolare per essere utilizzato, a parte la PCR finale per la verifica. Così, P1 trasduzione può competere nello sforzo esaurito e nel tempo con λ rosso ricombinazione ed è molto più veloce di mutagenesi cambio tradizionale marcatore.
Il protocollo presentato è molto robusto e consente di effettuare modifiche di molti dei passaggi. Esistono, tuttavia, alcuni parametri critici. Per le infezioni di P1, è necessario aggiungere ioni calcio al mezzo. Il calcio è necessario per l'assorbimento del fago ai batteri e mancata aggiunta calcio sufficiente al medium ridurrà notevolmente l'efficienza dell'infezione. Alcuni batteri ceppi come BL21ΔABCF tendono ad aggregazione in presenza di CaCl221. In tali casi, i batteri possono essere coltivati senza CaCl2, che può essere aggiunto alla sospensione poco prima l'infezione. Tuttavia, per i ceppi più convenzionale, 10 mM CaCl2 possono essere inclusi nel mezzo di crescita dall'inizio.
Al contrario, è importante rimuovere il calcio libero dal mezzo dopo la trasduzione. Il citrato è un chelante degli ioni calcio, e perché queste informazioni sono necessarie per l'adsorbimento di P1 per contenere celle rimuovendo il calcio libero dal mezzo impedisce ulteriori infezioni. Se il calcio non viene rimosso, i fagi infetterà ulteriormente le cellule in tutta la cultura, riducendo al massimo l'efficienza della trasduzione del e nel peggiore dei casi Lisi tutta la cultura, tra cui il transductants.
Un altro passo fondamentale è coltura di batteri che trasportano il plasmide pCP20. pCP20 è un plasmide condizionalmente replicante che non replica alle temperature di 37 ° C o superiore; Pertanto, per stabilire il plasmide nelle cellule, le incubazioni con questo plasmide devono essere eseguite a 30 ° C (o inferiore), una temperatura permissiva per la replica di pCP20. Per la cura pCP20, viene utilizzata un'ad alta temperatura (43 ° C). Alcuni ceppi non crescono bene a questa temperatura; in tali casi, 37 ° C dovrebbe essere sufficiente, anche se il processo di reticolazione del plasmide sarà un po ' meno efficiente a questa temperatura.
Quando i batteri per verificare la sensibilità agli antibiotici di placcatura, l'ordine della piastra striature è importante. Il protocollo chiama per cloni essere striati prima su antibiotico-contenente piastre e infine su mezzo non selettivo. In questo modo, il ricercatore può essere sicuro che qualsiasi mancanza di crescita su terreni selettivi sarà a causa di sensibilità agli antibiotici e piuttosto che a una potenziale mancanza di materiale trasferito sulle piastre. Seguendo il protocollo, nessuna crescita sul LB + Kan piastra convalida l'asportazione della cassetta Kan resistenza; nessuna crescita sul LB + Amp piastra convalida la perdita di pCP20 di plasmide di ricombinazione; ceppi crescente sulla piastra LB (che non ha fatto crescere nello stesso esperimento striature sulle piastre selezione) conterrà i positivi ricombinanti.
La maggior parte degli altri passaggi consentono considerevole margine di manovra. Nel protocollo come presentato, BL21ΔABCF è coltivato a 30 ° C, come questo ceppo non cresce bene a 37 ° C. Tuttavia, ceppi di e. coli senza difetti di crescita possono essere coltivate a 37 ° C (tranne quando trasformato con pCP20).
Il numero di batteri usati per le infezioni può essere variato in una certa misura. Il rapporto tra OD600 e una conta vitale è grosso modo lineare tra un valore di600 OD di 0.1 e 1.0, dove il primo corrisponde a circa 108 cfu/mL e quest'ultimo a ~ 109 cfu/mL. Tuttavia, questo rapporto può variare in una certa misura a seconda del ceppo in questione, il mezzo di crescita e altri fattori. È consigliabile che il rapporto fra OD600 e la conta vitale dovrebbe essere stabilito per ogni ceppo, in particolare per il calcolo dei valori di MOI e di laboratorio. Il numero dei batteri utilizzati negli esperimenti di infezione non è particolarmente critico, e 109 cfu/mL rappresenta la fase stazionaria precoce, che è un compromesso ragionevole tra la densità delle cellule e la proporzione di cellule vitali nella cultura. Se un numero inferiore di batteri vitali è utilizzato per la trasduzione, il numero di fagi deve semplicemente essere regolati di conseguenza. Il MOI stessa può anche essere variato in una certa misura. Il protocollo richiede un valore MOI di 0,5, anche se nulla tra 0,1 e 0,5 dovrebbe provocare una buona efficienza. Presso un MOI di 0,5, il rapporto di fagi ai batteri è 1:2 (cioè, la metà del numero dei fagi rispetto al numero di batteri). Nell'esempio nel protocollo, la OD600 della cultura è 1.0, e 1 mL della coltura è utilizzato per la trasduzione; così, il numero di fagi richiesto è di 5 x 108. Un valore MOI di 0,5 dà un elevato livello di infezione ma riduce il numero di batteri che sono doppiamente infettati, che ridurrebbe l'efficienza di trasduzione come i fagi (infettivi) di selvaggio-tipo molto più numerosi i fagi trasduzione. Una doppia infezione con un fago trasduzione e un fago infettiva porterebbe alla cella Lisi, eliminando così questo transductant dal pool dei sopravvissuti. Di conseguenza, un MOI di 0,5 non deve essere superato.
Il protocollo consente inoltre di alcuni tasti di scelta rapida. Piuttosto che di preparazione lysates dalle piastre, alcuni autori sostengono la preparazione dei fagi lisati in medium liquido29. Questo può risparmiare tempo, come un passaggio di incubazione durante la notte non è necessario. Allo stesso modo, titolando il fago lisato potrebbe non essere necessario. Come notato sopra, il MOI non è molto critico, e ragionevole efficienza può essere ottenuta semplicemente assumendo un titolo di 1010 pfu/mL per una norma lisato.
Nonostante la semplicità della tecnica, trasduzione P1 non è universalmente applicabile, e diverse condizioni devono essere soddisfatte per essere utile. In primo luogo, un ceppo di donatore con un allele di knock-out selezionabile deve essere disponibile. Ciò è compiuta solitamente tramite un'omissione dove una cassetta di resistenza agli antibiotici ha sostituito il gene di interesse. La collezione di Keio è particolarmente utile a questo proposito, poiché offre una libreria di ready-to-use di antibiotico basato su cassetta gene knock-out che coprono quasi tutti i geni non essenziali in e. coli K12. Questa collezione è particolarmente utile per bussare conservate geni trovati nella maggior parte dei ceppi di Escherichia coli (cioè, costituenti del genoma del nucleo di e. coli ). Per geni meno comuni, quali i fattori di virulenza dei patogeni di e. coli ceppi o via metabolica rara geni, la mutazione potrebbe essere necessario essere creato de novo. In tali casi, P1 trasduzione del bene non può essere il metodo di scelta. Oltre ai geni essenziali, geni necessari per infezione P1, come galU, mutazioni che portano a P1 resistenza30, sono poveri bersagli per un'omissione di trasduzione del P1. Un'altra nota quando si utilizza l'insieme di Keio, in particolare, è che alcuni ceppi portano una duplicazione del gene bersaglio, dove solo una copia è stata interrotta da Kan resistenza cassetta8. In tali casi, il gene di interesse può essere essenziale; gli investigatori si consigliano di verificare le annotazioni aggiornate per tali geni8. Tuttavia, dato questi vincoli, trasduzione P1 consente l'eliminazione della maggior parte dei geni in ceppi di Escherichia coli di laboratorio. Ad esempio, le differenze tra BW25113 e BL21 (DE3) sono piccole e interessano solo una manciata di proteina-codificazione geni31.
In secondo luogo, è importante sottolineare che il ceppo destinatario deve essere capace di una ricombinazione omologa per la trasduzione di lavorare. Un ceppo carente la ricombinasi che reca può, pertanto, non essere modificate da questo metodo. Sono esclusi tutti i ceppi di clonazione standard, come DH5α, HB101, TOP10 e blu XL-1. RecA possa mediare le ricombinazioni tra identici tratti più brevi 8 bp; Tuttavia, una regione più a lungo di alta somiglianza aumenterà significativamente la probabilità di ricombinazione32,33. Un altro problema, specialmente con cliniche e. coli ceppi, è che lunghe catene di O-antigene possono mascherare il recettore per P1, che si trova nell'oligosaccaride core del lipopolisaccaride34. Oltre a questi requisiti per il ceppo di destinatario, il ceppo di P1 utilizzato per trasduzione dovrebbe essere un mutante di vir ; Questa mutazione è richiesta per un' infezione litica pieno35.
Un terzo avvertimento di P1 trasduzione è che il gene per essere buttato dovrebbe trovarsi in una regione con alta somiglianza nelle regioni fiancheggianti tra il donatore ed il destinatari ceppi. Se c'è una mancanza di sintenia tra i ceppi, la sostituzione del gene target sequenza con la cassetta di Kan di codificazione ben riesca, a causa delle differenze nel contenuto delle regioni fiancheggianti. Pertanto, prima di intraprendere l'omissione del gene P1-mediata, gli investigatori dovrebbero controllare le sequenze dei ceppi donatore e ricevente per assicurarsi che le sequenze fiancheggianti sono omologhe. Naturalmente, questo è possibile solo se i ceppi sono stati sequenziati. Nel caso di ceppi con una sequenza di sconosciuto, P1 trasduzione può non riesca o causare altri problemi, come una conversione genica nelle regioni fiancheggianti. P1 può transduce circa 90 paia di kilobase del DNA; Se ci sono differenze nel contenuto del gene nelle regioni intorno al gene bersaglio (ad es., piccole delezioni o inserzioni), è probabile che questi tornerà alla sequenza di donatore. Questo potrebbe avere conseguenze impreviste sul fenotipo del ceppo destinatario. Pertanto, ove possibile, le sequenze del donatore e del ricevente intorno al gene di interesse devono essere confrontate sempre prima della trasduzione del P1.
In conclusione, la trasduzione P1 è un modo rapido di trasferire un gene specifico knock-out per un numero di ceppi una volta che la mutazione di knock-out iniziale è stata generata. Anche se la tecnica ha i suoi limiti, la facilità e la velocità della sua attuazione rendono una valida alternativa ad altri metodi di omissione del gene. P1 solo infetta Escherichia coli, che normalmente ne limita l'uso di questa specie. Tuttavia, alcune varianti di P1 sono stati sviluppati che hanno una più ampia gamma di host e può infettare altre specie della famiglia delle enterobatteriaceee anche alcune altre specie di γ-proteobacterial, seppur a ridotta efficienza36, 37. anche la trasduzione di DNA clonato da Escherichia coli per xanthus di Myxococcus, un δ-proteobacterium, è stato segnalato38. In futuri esperimenti, queste varianti ha potuto essere aumentate con la mutazione di vir ad ampliare la gamma di destinatari ceppi utilizzati nell'omissione del gene antibiotico lettore di cassette di trasduzione generale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ceppi di Keio collezione sono stati ottenuti dal progetto nazionale BioResource (NIG, Giappone): e. coli. Ringraziamo Dirk Linke (dipartimento di scienze biologiche, Università di Oslo) per il suo continuo sostegno. Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca della Norvegia Young Researcher grant 249793 (per Jack C. Leo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
References
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