Summary

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Abstract

Een eerste benadering voor het bestuderen van de functie van een onbekend gen in bacteriën is het creëren van een knock-out van dit gen. Hier beschrijven we een krachtige en snelle protocol voor het overbrengen van genmutaties schrapping van een Escherichia coli -stam naar de andere met behulp van gegeneraliseerde transductie met de bacteriofaag P1. Deze methode vereist dat de mutatie selecteerbare (bijvoorbeeld op basis van gene verstoringen met behulp van antibiotica cassette invoegingen). Dergelijke antibiotica cassettes kunnen worden gemobiliseerd van een donor-stam en geïntroduceerd in een ontvangende stam van belang om snel en eenvoudig genereren van een gen schrapping mutant. De antibiotica cassette kan worden ontworpen om flippase erkenning sites waarmee de excisie van de cassette door een site-specific recombinase tot een schone knock-out met alleen een opeenvolging van ~ 100-base-paar-lang litteken in het genoom. We tonen het protocol door het gen van de tamA codering een vergadering factor die betrokken zijn bij de autotransporter biogenese uitsparen en testen van het effect van deze knock-out op de biogenese en functie van twee trimeric autotransporter adhesines. Hoewel gene schrapping door P1 transductie zijn beperkingen heeft, maken het gemak en de snelheid van de uitvoering ervan het een aantrekkelijk alternatief voor andere methoden van gene verwijdering.

Introduction

Een gemeenschappelijke eerste aanpak voor het bestuderen van de functie van een gen is het uitvoeren van knock-out mutagenese en observeren van de resulterende fenotype. Dit heet ook omgekeerde genetica. De bacterie van E. coli is het werkpaard van de moleculaire biologie om de laatste 70 jaar of zo, ten gevolge van het gemak van het kweken en haar inschikkelijkheid aan genetische manipulatie-1. Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het produceren van gene verwijderingen in E. coli, waaronder markeerdraad uitwisseling mutagenese2,3 en, meer recent, recombineering met de λ rood of Rac ET systemen4,5 , 6.

In een veelgebruikt systeem, worden codering sequenties van afzonderlijke genen vervangen door een antibiotica-resistentie-cassette die later kan worden weggesneden uit de chromosoom5,7. De codering sequenties worden vervangen, bijvoorbeeld door een cassette kanamycine (Kan) weerstand, die wordt geflankeerd door flippase (FLP) erkenning doel (FRT) sites aan beide zijden. De FRT sites worden herkend door de recombinase FLP, die site-specifieke recombinatie tussen de sites van de FRT leiden tot het schrappen van de cassette Kan doorgeeft. Op deze manier kan een volledige schrapping van een bepaalde de codering gensequentie worden bereikt, weggaand achter slechts een minimale litteken opeenvolging van ongeveer 100 basenparen (bp) (Figuur 1).

Iets meer dan een decennium geleden, werd de zogenaamde Keio-collectie ontwikkeld. Dit is een bacteriële bibliotheek op basis van een standaard laboratorium E. coli K12 stam, waar bijna alle niet-essentiële genen individueel werden geschrapt door λ rode recombinatie7,8. De klonen binnen deze collectie hebben één codering opeenvolging een accijns Kan weerstand cassette hebt vervangen. De Keio-collectie heeft bewezen een nuttig hulpmiddel voor veel toepassingen9. Een dergelijke toepassing is de productie van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . De cassette Kan uit een bepaalde schrapping kloon kan worden gemobiliseerd door in het algemeen transducing bacteriofagen, zoals P110,11,12,13,14. Een voorraad van de bacteriofaag bereid uit een dergelijke stam kan vervolgens worden gebruikt om te infecteren een geadresseerde E. coli stam van belang, waar met een laag maar betrouwbare frequentie de Kan cassette-bevattende regio kan worden opgenomen in het ontvangende genoom van homologe recombinatie (Figuur 2). Transductants kunnen worden geselecteerd voor de groei op het medium Kan bevatten. Na dit, indien verwijdering van de antibiotica-resistentie-cassette is gewenst, kan het FLP-recombinase worden geleverd aan de transductant-stam in trans. Na het uitharden van het FLP-bevattende plasmide, die draagt een marker van de weerstand ampicilline (Amp), Kan en Amp-gevoelige klonen zijn gescreend en de juiste excisie van de wild-type codering sequentie en de cassette Kan worden geverifieerd door PCR van de kolonie.

Hier, wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd, met een beschrijving van elk van de stappen in het produceren van een knock-out E. coli stam gebaseerd op de hierboven beschreven strategie. Als voorbeeld, wordt een schrapping van de tamA gen aangetoond. tamA codeert een buitenmembraan β-vat-eiwit dat behoort tot het vervoer en de vergadering Module (TAM), die bij de biogenese van bepaalde autotransporter eiwitten en pili15,16,17 betrokken is. Deze spanning knock-out werd vervolgens gebruikt om te onderzoeken van het effect van de schrapping van de tamA op de biogenese van twee trimeric autotransporter adhesines (TAAs), de Yersinia antistoffen YadA en de E. coli immunoglobulin (Ig)-bindende TAA EibD 18,19.

Protocol

1. de stammen en plasmiden Bacteriestammen Gebruik de E. coli stammen BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7en BL21(DE3)20BL21ΔABCF21. Zie Tabel van materialen voor meer informatie. Bacteriofagen Gebruik de bacteriofaag P1vir voor de algemene transductie. De faag opslaat als een vloeibare voorraa…

Representative Results

Generatie van een tamA Knock-out van BL21ΔABCF: De hierboven beschreven strategie heeft eerder gebruikt voor de productie van een afgeleide stam van BL21(DE3), de stam van een standaard laboratorium gebruikt voor de productie van eiwitten, die is geoptimaliseerd voor de productie van de eiwitten van de buitenmembraan en genaamd BL21ΔABCF21. Deze spanning mist vier genen die coderen voor overvloedi…

Discussion

P1 transductie is een snelle, robuuste en betrouwbare methode voor het genereren van gene verwijderingen in E. coli. Dit blijkt hier uit een tamA schrapping mutant van een Keio donor-stam naar een geadresseerde BL21-afgeleide transducing. De grote fasen in het proces van de transductie zijn de productie van de transducing lysate de signaaltransductie zelf, de besnijdenis van de cassette Kan weerstand en de verificatie van de knock-out door PCR. In totaal, het proces duurt ongeveer 1 week en vereist geen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Keio collectie stammen zijn afkomstig van de nationale BioResource Project (NIG, Japan): E. coli. Wij danken Dirk Linke (departement van biowetenschappen, Universiteit van Oslo) voor zijn voortdurende steun. Dit werk werd gefinancierd door de Onderzoeksraad van Noorwegen Young Researcher subsidie 249793 (aan Jack C. Leo).

Materials

Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

References

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering–new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) – Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
  38. O’Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).

Play Video

Cite This Article
Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

View Video