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Genetics

Produisant des destructions de gène chez Escherichia coli par Transduction P1 avec des Cassettes de la résistance aux antibiotiques soumis à accises

doi: 10.3791/58267 Published: September 1, 2018

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation des préexistants de résistance aux antibiotiques-cassette suppression des constructions comme base pour l’établissement des mutants de délétion dans autres souches d’e. coli . Ces mutations de délétion peuvent être mobilisées et insérées dans le locus correspondant d’une souche à l’aide de transduction bactériophage P1.

Abstract

Une première approche pour étudier la fonction du gène inconnu chez les bactéries est de créer un knock-out de ce gène. Nous décrivons ici un protocole robuste et rapide pour transférer des mutations de délétion des gènes d’une souche d’Escherichia coli à l’autre à l’aide de transduction généralisée avec le bactériophage P1. Cette méthode nécessite que la mutation soit sélectionnable (p. ex., issu des perturbations de gène à l’aide d’insertions de cassette antibiotique). Ces cassettes antibiotiques peuvent être mobilisés à partir d’une souche de donateur et introduit dans une souche réceptrice d’intérêt à rapidement et facilement génèrent un mutant de délétion du gène. La cassette d’antibiotiques peut être conçue pour inclure des sites de reconnaissance de flippase qui permettent à l’excision de la cassette par une recombinase spécifique au site pour produire un knock-out propre avec seulement une séquence de ~ 100-base-paire-longue cicatrice dans le génome. Nous démontrer le protocole en assommant le tamA gène codant pour un facteur d’assemblage impliqué dans la biogenèse autotransporter et tester l’effet de cette knock out sur la biogenèse et fonction de deux adhésines autotransporter trimère. Bien que la délétion du gène par transduction P1 a ses limites, la facilité et la rapidité de sa mise en œuvre font une alternative intéressante aux autres méthodes de suppression de gène.

Introduction

Une première approche commune pour étudier la fonction d’un gène doit effectuer knock out mutagenèse et observer le phénotype résultant. C’est aussi nommé génétique inverse. La bactérie e. coli a été le cheval de bataille de la biologie moléculaire pour les 70 dernières années ou ainsi, en raison de la facilité de sa culture et sa susceptibilité de manipulation génétique1. Plusieurs méthodes ont été développées pour produire des destructions de gène chez e. coli, y compris le marqueur échange mutagénèse2,3 et, plus récemment, recombineering utilisant le λ rouge ou Rac ET systèmes4,5 , 6.

Dans un système largement utilisé, les séquences codantes de gènes individuels sont remplacées par une cassette de résistance aux antibiotiques qui peut plus tard être excisée du chromosome5,7. Les séquences codantes sont remplacés, par exemple par une cassette de résistance kanamycine (Kan), qui est flanquée de sites de cible (FRT) de reconnaissance flippase (FLP) de chaque côté. Les sites FRT sont reconnus par la recombinase FLP, qui intervient dans la recombinaison site-spécifique entre les sites FRT conduisant à la suppression de la cassette de Kan. De cette façon, une suppression complète de la séquence codante d’un gène donné peut être atteint, laissant derrière lui qu’une suite de cicatrice minime d’environ 100 paires de bases (PB) (Figure 1).

Juste plus de dix ans, la collection dite de Keio a été développée. Il s’agit d’une bibliothèque bactérienne basée sur un standard de laboratoire souche d’e. coli K12, où presque tous les gènes non essentiels ont été individuellement supprimés par λ recombinaison rouge7,8. Les clones au sein de cette collection chaque ont une séquence codante remplacée avec une cassette de résistance Kan soumis à accises. La collection de Keio s’est avéré pour être un outil utile pour nombreuses applications9. Une telle application est la production de mutants de délétion dans autres souches d’e. coli . La cassette Kan d’un clone de suppression donné peut être mobilisée par transduction généralement les bactériophages, telles que P110,11,12,13,14. Un stock de phage préparé à partir d’une telle souche peut alors servir à infecter un destinataire la souche e. coli d’intérêt, où à une fréquence faible mais fiable la Kan région cassette contenant peut être incorporée dans le génome du destinataire par recombinaison homologue (Figure 2). Transductants peuvent être sélectionnés pour la croissance sur le milieu contenant du Kan. Suite à cela, si le retrait de la cassette de résistance aux antibiotiques est souhaitée, la recombinase FLP peut être fournie à la souche transduites en trans. Après durcissement du plasmide contenant du FLP, qui transporte un marqueur de résistance ampicilline (Amp), clones Kan et Amp sensibles sont testées pour, et l’excision correcte de la séquence codante de type sauvage et la cassette Kan sont vérifiées par PCR sur colonie.

Ici, un protocole détaillé est présenté, décrivant chacune des étapes dans la production d’un knock-out souche e. coli , basé sur la stratégie décrite ci-dessus. À titre d’exemple, une délétion du gène tamA est démontrée. tamA , code pour une protéine β-Canon de la membrane externe qui est une partie du Transport et de montage Module (TAM), qui est impliqué dans la biogenèse de certaines protéines autotransporter et pili15,16,17. Cette souche de knock out a ensuite été utilisée pour étudier l’effet de la suppression de tamA sur la biogenèse des deux adhésines autotransporter trimère (AVA), l’adhésine Yersinia YadA et l’e. coli immunoglobuline (Ig)-liaison TAA EibD 18,,19.

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Protocol

1. les souches et les plasmides

  1. Souches bactériennes
    1. Utilisation de l' e. coli souches BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21 (DE3)20et21de la BL21ΔABCF. Voir Table des matières pour plus d’informations.
  2. Bactériophages
    1. Utilisez le phage P1vir pour la transduction générale. Stocker le phage comme un stock liquid avec quelques gouttes de chloroforme (Voir l’étape 2.2). Pour plus d’informations, consultez la Table des matières.
  3. Plasmides
    1. Utilisez les plasmides suivants dans ce protocole : pCP2022, pIBA2-bla bla23et24de la pEibD10. Comme les plasmides de contrôle, utilisez pASK-IBA2 et pET22b (voir la Table des matières).
  4. Conditions de croissance
    1. Propager les bactéries dans un bouillon (LB) de lysogénie, à moyenne25 avec agitation vigoureuse (180 / 200 tr/min) à 37 ° C ou 30 ° C dans le cas de souches contenant pCP20 et BL21ΔABCF.
    2. Effectuer le plasmide un durcissement à 43 ° C.
    3. Pour un milieu solide, Supplément LB avec 1 % d’agar (p/v).
    4. Pour albums agar, Supplément LB avec 0,7 % d’agar et 10 mM CaCl2 et stériliser le milieu. Utilisez SOC moyenne pour la récupération après électroporation26.
    5. Utilisez les concentrations suivantes pour les antibiotiques : 100 µg/mL pour les Amp et 25 µg/mL pour kan.

2. préparer un lysat de phages

  1. Infection de la souche de donateurs
    1. Cultiver la souche donneur JW4197 dans 5 mL de LB additionné avec 10 mM CaCl2 et éventuellement avec Kan (25 µg/mL) à une densité optique à 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Mesurer la valeur de600 OD à l’aide d’un spectrophotomètre.
    2. Faire une série de dilution d’un stock de phage P1 existant dans le milieu LB : recommandés par dilutions sont entre 10-3 à 10-7.
    3. Mix 200 μl de la suspension bactérienne et 100 μL d’une dilution de phage donnée dans un tube à centrifuger de 15 mL ou l’équivalent. Préparer les tubes autant que les dilutions de phages. Incuber les tubes pendant 20 min à 37 ° C sans agitation.
    4. Ajouter ~ 3 mL de gélose haut fondu (~ 50 ° C) avec 10 mM CaCl2 aux tubes, homogénéiser le contenu au vortex les tubes peu de temps et verser les mélanges dans des assiettes LB préchauffées à faire des couches même.
    5. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C.
  2. Préparation de lysate
    1. Le jour suivant, choisissez une plaque avec une croissance semi confluente de plaques phage. Sur une plaque semi confluente, environ la moitié la superficie de la plaque est claire (Figure 3).
    2. Gratter la couche de gélose haut de comme une plaque à l’aide d’une boucle de l’inoculation ou un outil similaire et placer l’agar en haut de la page dans un tube à centrifuger. Ajouter 1 à 2 mL de LB et une goutte de chloroforme et vortex le tube vigoureusement pendant environ 1 min. ajouter le chloroforme sous une hotte.
    3. Centrifuger le tube pendant 15 min à 4 000 x g ou plus rapide pour granuler la gélose et les cellules bactériennes.
    4. Déplacez le surnageant dans un tube de microcentrifuge fraîches, évitant le report de tous les débris de la pastille. Ajouter 2 gouttes de chloroforme et de stocker le lysat 4 – 10 ° c. Ajouter chloroforme sous une hotte. Ne pas congeler le phage lysat car cela se traduira par une réduction significative du nombre de particules infectieuses.
  3. Déterminer le titre lysat
    1. Pousser BW25113 dans LB additionné de 10 mM CaCl2 à 37 ° C jusqu'à ce que la culture atteigne une OD600 ~ 1.0.
    2. Préparer une série de dilution du phage lysat en LB (p. ex., 10-6-10-9).
      Remarque : Veillez à pipette l’échantillon du haut du lysat pour éviter de transférer le chloroforme pour les dilutions.
    3. Mix 200 μl de la suspension bactérienne et 100 μL d’une dilution de phage donnée dans un tube à centrifuger de 15 mL ou l’équivalent. Préparer les tubes autant que les dilutions de phages. Incuber les tubes pendant 20 min à 37 ° C sans agitation.
    4. Ajouter ~ 3 mL de gélose haut fondu (~ 50 ° C) avec 10 mM CaCl2 aux tubes, homogénéiser le contenu au vortex les tubes peu et versez le mélange dans des assiettes LB préchauffées à faire des couches même.
    5. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C.
    6. Le lendemain, compter le nombre de plaques (régions claires dans le tapis bactérien) pour chaque plaque et calculer le titre du lysat en utilisant la formule suivante :
      Equation 1
      Exemple : Sur les plaques avec la dilution 10-7, 10-8et 10-9, il y a 231, 27 et 2 plaques, respectivement. 100 μl de chaque dilution est utilisé pour l’infection, et que le titre est exprimé en formant unités (pfu) / mL, le facteur de placage est 10. Ces chiffres sont entrés dans la formule :
      Equation 2
      Ainsi, le titre est d’environ 2 x 1010 bactériophage infectieux particules/mL.

3. P1 Transduction

  1. Préparer les cellules réceptrices
    1. Cultiver la souche réceptrice BL21ΔABCF dans LB complété à une densité optique à 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la valeur de600 OD.
    2. Calculer le volume du phage lysat nécessaire à la réalisation d’une multiplicité de valeur d’infection (MOI) de 0.5. Pour calculer la MOI, estimer le nombre de bactéries basé sur l' OD600 de la culture. Supposons qu’une valeur de600 OD de 1,0 correspond à ~ 109 UFC/mL. Calculer le volume nécessaire basée sur le titre connu du lysate.
      Exemple (basé sur le titre calculé dans l’exemple après l’étape 2.3.6) :
      Equation 3
    3. Ajouter CaCl2 , à la culture de la souche réceptrice à 10 mM et mélanger. Prendre 1 mL de la culture pour la transduction.
  2. Exécution de transduction
    1. Ajouter le volume approprié de lysat de phages à 1 mL de culture bénéficiaire (y compris CaCl2 à 10 mM) tel que calculé à l’étape 3.1.2 et mélanger doucement.
      Remarque : Veillez à Pipeter l’échantillon du haut du lysat pour éviter de transférer le chloroforme au mélange.
    2. Statiquement Incuber le mélange pendant 20 min à 37 ° C.
    3. Arrêtez l’infection en ajoutant le citrate de sodium, pH 5,5 à 100 mM.
    4. Centrifuger les bactéries (5 000 x g pendant 2 min) et retirez le surnageant, puis les remettre en suspension dans 1 mL de frais LB additionné de 100 mM du citrate de sodium, pH 5,5.
    5. Laver les cellules deux fois plus qu’à l’étape 3.2.4 pour assurer l’élimination des phages libres et en calcium.
    6. Remettre en suspension les bactéries dans 1 mL de frais LB additionné de 100 mM du citrate de sodium, pH 5,5. Incuber les bactéries à 30 ° C pendant 1 h avec agitation (> 100 tr/min).
    7. Récolter les germes par centrifugation (5 000 x g pendant 2 min) et les remettre en suspension dans ~ 100 μL de LB avec 100 mM du citrate de sodium, pH 5,5.
    8. Transmettre la bactérie sur une plaque LB additionné de Kan à 25 µg/mL et 10 mM du citrate de sodium, pH 5.5 et se développer les bactéries à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies apparaissent (~ 24 h).
  3. En sélectionnant les transductants
    1. Une fois que les colonies ont augmenté sur la plaque de sélection, leur restreak sur LB + Kan des colonies individuelles et poussent à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies individuelles apparaissent.

4. excisant la cassette Kan

  1. La transformation avec le plasmide de recombinaison
    1. Faire l’electrocompetent de souche BL21ΔABCF Kan-résistant.
      1. Cultiver la souche utilisée par une seule colonie en frais LB (5 mL) additionné de Kan (25 µg/mL) à 30 ° C jusqu'à ce que l' OD600 est ~0.5 – 0,7.
      2. Partir de là, réalisez les étapes suivantes à 4 ° C ou sur la glace. Centrifuger les bactéries (5 000 x g pendant 10 min) et éliminer le surnageant.
      3. Laver le culot cellulaire avec eau distillée glacée deux fois en répétant l’étape précédente de la centrifugation et, enfin, remettre en suspension le culot dans 100 µL de glacé 10 % de glycérol.
    2. Refroidir les cuves d’électroporation de 1 mm sur la glace.
    3. Ajoute la suspension cellulaire de 1 pg d’ADN (pCP20) plasmidique, mélanger la suspension doucement et transférer dans une cuvette d’électroporation refroidi.
    4. La valeur de l’électroporateur à 1,8 kV et electroporate les cellules.
    5. Sauver les cellules transformées en ajoutant 1 mL de milieu SOC et leur culture pendant 1 h à 30 ° C.
    6. Plaque de 100 µL de cellules sur LB + Amp plaques et cultiver les cellules à 30 ° C durant la nuit.
  2. Induction de la recombinaison
    1. Prélever des colonies unique du LB + Amp sur plaque et ensemencer les frais LB en omettant tous les antibiotiques.
    2. Cultiver les cellules à la température non permissif (43 ° C) pendant la nuit pour induire l’expression de la recombinase FLP.
  3. Sélection des recombinants
    1. Faire des dilutions sériées et plaque 50 µL d’une dilution de6 105-10 sur plaques-bloquant sélectif et développez-le du jour au lendemain à 30 ° C.

5. vérification de la délétion de gène

  1. Vérification de la perte de plasmides et de recombinaison réussie
    1. Strie unique colonies sur les plaques préparées à l’étape 4.3.1 sur LB, LB + Kan, Amp et LB sans antibiotiques, dans cet ordre. Pour vous aider dans les rayures, utiliser une grille de colonie (voir supplémentaire 1 fichier). Pousser les plaques à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies apparaissent (~ 24 h).
    2. Sélectionner les clones de 10 – 20 qui ont cultivé sur la plaque non sélectif, mais n’ont pas poussé sur des milieux sélectifs pour vérification supplémentaire.
  2. Vérification supplémentaire par PCR sur colonie
    1. Effectuer une colonie PCR avec des amorces flanquant le tamA séquence codante (voir Table des matières).
    2. Préparer un mélange maître de PCR. La quantité de mélange nécessaire dépend du nombre de colonies à tester (Voir l’exemple dans le tableau 1). Mélanger les réactifs sur la glace, ajouter en dernier la polymérase.
    3. Bien mélanger le mélange maître de PCR, puis diluer 20 µL dans des tubes d’une bande PCR. Prendre une petite quantité de chaque colonie à être projeté à l’aide d’un embout de la pipette stérile et l’ajouter à un tube. N’oubliez pas d’inclure la souche réceptrice originale à titre de comparaison. Éventuellement aussi inclure la souche de donateurs.
    4. Exécuter une réaction de PCR (voir le tableau 2 pour le programme utilisé).
    5. Préparer un gel d’agarose à 1 %.
      1. Pour un gel de 50 mL, mesurer 0,5 g d’agarose et ajouter 50 mL de tampon TAE (40 mM Tris, d’acide acétique 20 mM et 1 mM EDTA, pH 8,0). Faire chauffer le mélange dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que tous les agarose a dissous.
      2. Une fois que l’agarose est dissout, refroidir la solution à environ 50 ° C et ensuite ajouter 5 μl d’ADN coloration teinture. Bien mélanger la solution et versez-la dans un bac de gel dans une chambre de coulée. Insérez une ou plusieurs rangées de peignes bien afin qu’il y a des puits suffisants pour tous les échantillons, ainsi que des marqueurs de taille moléculaire. Laisser le gel durant 30 min.
    6. Une fois que la série PCR est terminée, ajouter 4 µL de 6 x colorant de chargement de l’ADN à chaque échantillon. Placer le gel dans la chambre d’électrophorèse et ajouter le tampon TAE jusqu'à ce que les puits sont couverts.
    7. Appliquer 10-15 µL de chaque réaction de PCR dans un puits dans le gel. Également ajouter 5 µL de marqueur de poids moléculaire. Exécutez ensuite le gel pendant 30 min à 75 V.
    8. Une fois que la série est terminée, l’image du gel à l’aide d’un imageur de lumière bleue.

6. autres Techniques

  1. Expression de la protéine
    Remarque : L’expression des protéines de test (YadA et EibD) a été décrit en détail ailleurs23,24. Il s’agit d’un bref résumé des principales étapes.
    1. Transformer BL21ΔABCF ΔtamA with les plasmides nécessaires (pIBA2-YadA et pEibD10 et les plasmides de contrôle correspondante), puis sélectionnez pour transformants sur LB + Amp.
    2. Pour l’expression de la protéine, ensemencer 100 mL de milieu LB + Amp avec 1 mL d’une culture d’une nuit ou plus de bactéries transformées et faire croître les à 30 ° C jusqu'à ce que phase logarithmique, date à laquelle, induire la production de protéine avec soit anhydrotétracycline (à 100 ng/mL) ou isopropylique thiogalactoside (à 0,5 mM).
    3. Après 2 h d’induction à 30 ° C, mesurer la turbidité des cultures et de recueillir un certain nombre de cases correspondant aux 50 mL à OD600 = 1.0 en centrifugeant les cultures à 4 000 x gpendant 15 minutes. Laver le culot 1 x 10 mm HEPES, pH 7,4 et ensuite soit conserver à-20 ° C ou processus il encore comme au point 6.2.
  2. Extraction de la membrane externe
    NOTE : Extraction de la membrane externe est effectuée comme décrit en détail par Leo et al. 27. les principales étapes sont résumées ci-dessous.
    1. Remettre le culot dans 1 mL de 10 mM HEPES, pH 7,4, additionné de 10 mM MgCl2 et MnCl2, lysozyme (0,1 mg/mL) et une pincée de DNase I.
    2. Lyse des cellules (par exemple, à l’aide d’un batteur de perle).
    3. Centrifuger les cellules peu de temps (2 min à 15 600 x g) pour supprimer les débris cellulaires et déplacer le surnageant dans un tube frais.
    4. Centrifuger les cellules pendant 30 min à 16 000 x g, après quoi, resuspendre le culot dans 400 ml de 1 % N-lauroyl sarcosine dans 10 mM HEPES, pH 7,4.
    5. Incuber les cellules avec agitation pendant 30 min à température ambiante, après quoi, les Centrifuger pendant 30 min comme indiqué ci-dessus.
    6. Laver le translucide-pellet 1 x avec 200 μl de 10 mM HEPES, pH 7,4, puis il resuspendre dans 30 μL de 10 mM HEPES et ajoute 10 μL de 4 x tampon échantillon SDS-PAGE.
  3. Tests d’activité
    Remarque : Effectuez des essais SDS-PAGE et activité pour YadA et EibD comme décrit28. Les principales étapes sont résumées ci-dessous.
  4. SDS-PAGE
    1. Faire chauffer les échantillons à 50 ° C pendant 5 min avant de les charger sur un gel de polyacrylamide, pour éviter la dénaturation des protéines.
    2. Après la séparation en SDS-PAGE, transférer les protéines dans une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF).
    3. Après le transfert, bloquer la membrane avec la poudre de lait écrémé 2 % dans du PBS.
  5. Tache d’extrême-ouest de YadA-collagène
    1. Après le blocage, ajout d’un type de collagène bovin que j’ai dilué dans un tampon bloquant à une concentration de 10 μg/mL et incuber la membrane pendant 1 h.
    2. Laver la membrane 2 x avec PBS + 0.05 % Tween20 (PBS-T).
    3. Ajoutez l’anticorps primaire (anticorps monoclonal anti-collagène COL-1) à la membrane, 1:2,000 dilué dans un tampon bloquant.
    4. Après incubation de la membrane pendant 1 h, laver 2 x comme indiqué dans l’étape 6.3.2.2, puis ajoutez l’anticorps secondaire [conjugué de peroxydase de raifort (HRP) goat anti-mouse IgG-raifort], dilué 1/10 000 dans un tampon bloquant.
    5. Incuber la membrane pendant 1 h, puis le laver 2 x avec PBS-T. Ajouter un substrat chimioluminescent renforcé à la membrane selon les instructions du fabricant et détecter la bande à l’aide d’une caméra CCD.
  6. EibD-IgG essai de liaison
    1. Après le blocage, ajouter un anticorps secondaire (chèvre anti-lapin HRP), dilué 1:2,000 dans un tampon bloquant.
    2. Incuber la membrane pendant 1 h, puis le laver 2 x avec PBS. Effectuer la détection par chimiluminescence comme indiqué dans l’étape 6.3.2.5.

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Representative Results

Génération d’un tamA Knock out de BL21ΔABCF :

La stratégie décrite ci-dessus a déjà été utilisée pour produire une souche dérivée de BL21 (DE3), une souche de laboratoire standard utilisée pour la production de protéines, qui est optimisée pour la production de protéines de membrane externe et appelée BL21ΔABCF21. Cette souche n’a pas de quatre gènes codant pour des protéines de membrane externe abondante et, par conséquent, est en mesure de produire des protéines de membrane externe plus façon hétérologue exprimée que la souche sauvage. Pour tester si le TAM est impliqué dans la biogenèse TAA, le gène tamA a été supprimé dans ce contexte.

Un lysat de P1 a été préparé à partir de la souche de la collection Keio JW4179, où le gène de tamA (anciennement appelé axmifavab) séquence codante est remplacé par une cassette de résistance Kan. Ensuite, une expérience de transduction a été réalisée avec BL21ΔABCF comme la souche réceptrice. Plusieurs colonies de Kan-résistant ont été obtenues, après quoi, deux ont été choisies pour l’excision de la cassette de Kan. Le plasmide pCP20, codant la recombinase FLP, a été introduit dans ces clones et, guéri par la suite, en cultivant à 43 ° C en l’absence d’un choix d’antibiotique. Un certain nombre de clones ont été examiné pour la sensibilité à la fois Amp (qui est un marqueur de pCP20) et Kan, et plusieurs clones sensibles à tous les deux ont été obtenus. Ces clones ont été vérifiés par PCR sur colonie en utilisant des amorces flanquant le tamA séquence codante et constaté que le gène tamA a correctement été supprimé (Figure 4).

Rôle de TamA dans la biogenèse TAA :

TamA s’est avéré d’être impliqués dans la biogenèse des quelques classiques autotransporters16 et l’inverse autotransporter intimine15. Pour tester si TamA est important pour la biogenèse des AVA, BL21ΔABCF ΔtamA a été transformé avec des plasmides codant pour deux protéines de test, l’adhésine Yersinia YadA et la protéine de liaison Ig e. coli EibD. Ces protéines sont connues pour exprimer bien chez e. coli et ont servi de modèles pour la biogenèse TAA dans précédentes études23,28.

Après l’induction de la production de protéines, les fractions de la membrane externe de la culture d’expression ont été isolées et analysées par SDS-PAGE. Les échantillons ont été pas bouillir pour démontrer la trimérisation des protéines. Les trimères courir à tailles au-dessus de 100 kDa, tandis que les monomères ont prévu de tailles de 45 kDa (bla bla) et 51 kDa (EibD). Pas de grandes différences ont été observées entre les niveaux d’expression dans BL21ΔABCF et BL21ΔABCF ΔtamA, bien que bla bla semble s’être produite à un peu plus faibles chez la souche detamA Δ (Figure 5 a). Toutefois, le contraire semble être le cas pour EibD.

Pour déterminer si l’absence de TamA susceptibles d’influencer le pliage correct ou le transport des protéines, leur capacité de liaison aux ligands a été testée. Pour YadA, cela a été accompli par une tache d’extrême-ouest de collagène (Figure 5 b). YadA, dans les deux souches, lié collagène à un niveau similaire, ce qui démontre que la protéine est correctement pliés et fonctionnelle. De même, des activités de liaison IgG de EibD dans les deux souches corrélé avec le niveau d’expression (Figure 4). Ces résultats démontrent que la suppression de tamA n’a pas un effet significatif sur la biogenèse des TAA, du moins pas pour ces deux modèle AVA.

Figure 1
Figure 1 : génération de débouchures avec cassettes antibiotiques soumis à accises. Pour produire les gène les débouchures, un gène d’intérêt (gène B dans cet exemple) est remplacé par une cassette de résistance Kan flanquée de sites FRT. La cassette de FRT-Kan, à son tour, est flanquée de courte (~ 50 bp) s’étend de séquence homologue dans les régions en amont et en aval de la Gene B. La séquence codante du gène B est échangée contre la cassette FRT-Kan par λ recombinaison rouge. Une fois ceci accompli, la cassette Kan lui-même peut être enlevée en introduisant la recombinase FLP, qui se négocient une recombinaison site-spécifique entre les sites FRT. Cela accises la cassette de Kan, laissant un minimum (~ 100 bp) cicatrice séquence dans le locus B. Pour plus de détails, voir Baba et al. 7. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : suppression de gène par transduction P1. Le donateur de souche (beige) porte une cassette Kan qui a remplacé le gène d’intérêt (jaune) sur le chromosome (bleu). Le donneur est infecté par le bactériophage P1. Le phage se multiplie dans la souche de donateurs, produisant un grand nombre de descendants. Sont plus sauvage (génome rouge), mais une fraction sont transduction phages qui ont intégré une partie de le donneur souche du chromosome au lieu du phage ADN (génome bleu). Une proportion d'entre elles contiendront la cassette Kan (génome jaune). Finalement, la cellule hôte infectée lyse et libère les phages dans le milieu. Elles servent à préparer un lysat. Dans l’expérience de la transduction, la souche réceptrice (bleu clair) est infectée par le lysat préparés à partir de la souche de donateurs. Dans une minorité de cas, le destinataire est infecté par un phage transducteur transportant la cassette de Kan (illustrée ici). Si les régions adjacentes à la cassette Kan subissent une recombinaison homologue, la cassette Kan est intégrée dans le chromosome receveur remplaçant l’allèle endogène, ce qui entraîne des clones Kan-résistants qui peuvent être sélectionnés pour. L’ajout d’une recombinase FLP sur un plasmide DURCISSABLE accises la cassette de Kan, ne laissant qu’une cicatrice courte séquence (montrée ici en jaune), qui rétablit le clone au phénotype sensible Kan. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : exemples de plaques après une infection P1. (A), ce panneau affiche un plaque avec plaques individuelles. (B), ce panneau indique une plaque semi confluente. (C) ce panneau montre une plaque trop infectée, où presque toutes les bactéries ont été lysées par phage. Certaines colonies résistantes ont grandi hors de la couche supérieure d’agar. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Suppression de la tamA séquence codante. L’allèle de suppression de tamA::kan a été introduit dans la souche BL21ΔABCF de transduction P1. Après l’excision de la cassette de Kan, une séquence de cicatrice (~ 100 bp) est le seul vestige du locus de tamA . Cela a été vérifié par PCR, utilisant les amorces bordant le site de suppression. BL21ΔABCF et sa souche parentale, BL21 (DE3), la PCR donne un produit de la longueur de la tamA (la taille attendue est 1,7 kilopaires) de séquence codante. Dans BL21ΔABCF, où la cassette Kan ont été retirée, le produit correspond à la séquence de cicatrice attendus (145 bp). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Expression d’Ava par une souche de suppression tamA . (A), ce panneau affiche la SDS-PAGE des membranes externes préparés à partir de cellules exprimant Ava (YadA ou EibD) et les contrôles de vecteur (pIBA2 et pET22). Les souches sont BL21ΔABCF et sa souche dérivée sans TamA (ΔtamA). (B), ce panneau montre une tache d’extrême-ouest de collagène d’échantillons YadA. Le bla bla échantillons et les contrôles de pIBA2 du groupe A ont été transférés sur une membrane de PVDF et incubées avec du collagène de type I. Ils ont été ensuite sondés avec un anticorps anti-collagène et détectés par ECL. (C), ce panneau présente un essai de liaison d’anticorps pour les échantillons de EibD. Les échantillons de EibD et les pET22 contrôles de panneau A ont été transférés sur une membrane de PVDF et incubées avec l’anticorps secondaire conjugué HRP et puis détectés par ECL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Réactif mix de x 1 7 mix x
Eau de PCR-qualité 17 ΜL ΜL 119
mémoire tampon polymérase 10 x 2 ΜL 14 ΜL
mélange de désoxyribonucléotides 10 mM 0,4 ΜL 2.8 ΜL
Primer avant 100 µM 0.2 ΜL 1,4 ΜL
Apprêt inverse 100 µM 0.2 ΜL 1,4 ΜL
ADN polymérase Taq 0.2 ΜL 1,4 ΜL
Total 20 ΜL 140 ΜL

Tableau 1 : PCR sur colonie master mix. La quantité de mélange dépend du nombre de colonies à être projeté. En outre, préparer une réaction de contrôle (souche réceptrice originale). Par exemple, si cinq clones de dépistage, six réactions sont nécessaires, y compris le contrôle. Il convient de préparer une réaction supplémentaire pour s’assurer qu'il y a assez mélange PCR pour tous les échantillons (répété pipetage amplifie les petites erreurs de pipetage). Dans cet exemple, préparer un mélange de 7 x (5 colonies, 1 contrôle et 1 réaction supplémentaire).

Étape Température Temps Notes
1. 94 ° C 3 min
2. 94 ° C 30 s
3. 50 ° C 30 s
4. 70 ° C 2 min 1 min/kb à amplifier, arrondir
Retour à l’étape 2 24 fois
5. 70 ° C 5 min
6. 12 ° C Pour toujours maintien finale

Tableau 2 : PCR sur colonie programme.

Supplémentaire fichier 1 : un exemple de grille de colonie. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Transduction P1 est une méthode rapide, robuste et fiable pour générer des destructions de gène chez e. coli. Cela est démontré ici de transduction d’un mutant de délétion tamA d’une souche de donneur de Keio à un destinataire BL21 dérivés. Les grandes étapes dans le processus de transduction sont la production de la transduction lysate, la transduction lui-même, l’excision de la cassette de résistance Kan et la vérification de l’entrée défonçable par PCR. Au total, le processus prend environ une semaine et ne nécessite aucune méthode de biologie moléculaire pour être utilisé, mis à part le PCR final pour la vérification. Ainsi, transduction P1 peut rivaliser dans le temps avec λ et l’effort dépensé recombinaison rouge et est beaucoup plus rapide que la mutagénèse d’échange traditionnel de marqueur.

Le protocole présenté est très robuste et permet des modifications de la plupart des étapes. Il y a, cependant, quelques paramètres critiques. Pour les infections de P1, il est nécessaire d’ajouter des ions calcium au milieu. Le calcium est nécessaire pour l’adsorption du phage aux bactéries, et échec d’ajouter calcium suffisant au milieu permettra de réduire considérablement l’efficacité de l’infection. Certaines bactéries souches telles que les BL21ΔABCF ont tendance à agrégation en présence de CaCl221. Dans ce cas, la bactérie peut être cultivée sans CaCl2, qui peut être ajouté à la suspension, peu avant l’infection. Toutefois, pour les souches plus classiques, 10 mM CaCl2 peuvent être inclus dans le milieu de croissance depuis le début.

À l’inverse, il est important d’éliminer le calcium libre dans le milieu après la transduction. Le citrate est un chélateur des ions de calcium, et parce qu’elles sont nécessaires pour l’adsorption de P1 aux cellules hôtes, enlever le calcium libre dans le milieu de prévient les infections plus. Si le calcium n’est pas supprimé, les phages infectera plus cellules tout au long de la culture, au mieux réduire l’efficacité de la transduction et lyse au pire toute la culture, y compris les transductants.

Une autre étape critique est culture de bactéries portant le plasmide pCP20. pCP20 est un plasmide conditionnellement de réplication qui ne réplique pas à des températures de 37 ° C ou plus ; ainsi, pour établir le plasmide dans les cellules, les incubations avec ce plasmide doivent être effectué à 30 ° C (ou moins), une température permissive pour la réplication de pCP20. Pour guérir la pCP20, une température élevée (43 ° C) est utilisée. Certaines souches ne se développent pas bien à cette température ; dans ce cas, 37 ° C devrait suffire, bien que le durcissement du plasmide sera un peu moins efficace à cette température.

Lors de l’ensemencement de bactéries pour tester la sensibilité aux antibiotiques, l’ordre de plaque streaking est important. Le protocole préconise clones être strié premier antibiotique contenant assiettes et enfin sur milieu non sélectif. De cette façon, l’enquêteur peut être sûre que tout manque de croissance sur les milieux sélectifs en raison de la sensibilité aux antibiotiques et plutôt qu’à un éventuel manque de matière transférée sur les plaques. Suivant le protocole, aucune croissance sur la LB + Kan plaque valide l’excision de la cassette de résistance Kan ; pas de croissance sur la LB + Amp plaque valide la perte de la recombinaison plasmide pCP20 ; souches de plus en plus sur la plaque LB (qui ne pousse pas dans la même expérience formant des stries sur les plaques de sélection) contiendra les recombinants positives.

La plupart des autres étapes permettent de manœuvre considérable. Dans le protocole tel que présenté, BL21ΔABCF est cultivé à 30 ° C, car cette souche ne pousse pas bien à 37 ° C. Toutefois, des souches d’e. coli sans défauts de croissance peuvent être cultivées à 37 ° C (sauf lorsque transformé avec pCP20).

Le nombre de bactéries utilisées pour les infections peut varier dans une certaine mesure. La relation entre OD600 et une numération viable est approximativement linéaire entre une valeur de600 OD de 0,1 et 1,0, où l’ancien correspond à environ 108 UFC/mL et le second à9 ~ 10 UFC/mL. Cependant, cette relation peut varier dans une certaine mesure selon la souche en question, le milieu de croissance et d’autres facteurs. Il est recommandé que la relation entre OD600 et le comte viable devrait être établie pour chaque souche, en particulier pour le calcul des valeurs MOI et de laboratoire. Le nombre de bactéries utilisées dans les expériences d’infection n’est pas particulièrement critique, et 109 UFC/mL représente la phase stationnaire au début, ce qui constitue un compromis raisonnable entre la densité cellulaire et la proportion de cellules viables dans la culture. Si un nombre inférieur de bactéries viables est utilisé pour la transduction, le nombre de phages doit simplement être ajusté en conséquence. Le ministère de l’intérieur lui-même peut également varier dans une certaine mesure. Le protocole préconise une valeur MOI de 0.5, bien que quoi que ce soit entre 0,1 et 0,5 devrait se traduire par une bonne efficacité. À un MOI de 0,5, le ratio des phages de bactéries est 1:2 (c'est-à-dire, la moitié des phages par rapport au nombre de bactéries). Dans l’exemple dans le protocole, l' OD600 de la culture est 1.0, et 1 mL de la culture est utilisée pour la transduction ; ainsi, le nombre de phages requis est de 5 x 108. Une valeur MOI de 0,5 donne un haut niveau d’infection mais réduit le nombre de bactéries qui sont doublement infectées, ce qui réduirait l’efficacité de la transduction comme les phages (infectieuses) sauvage loin dépassent en nombre les phages de transduction. Une double infection par un phage transducteur et un bactériophage infectieux conduirait à la cellule lysis, éliminant ainsi ce transduites du pool des survivants. Par conséquent, un MOI de 0,5 ne doit pas être dépassé.

Le protocole permet également quelques raccourcis. Plutôt que de préparer des lysats de plaques, certains auteurs préconisent de préparer les lysates bactériophages en milieu liquide29. Cela peut gagner du temps comme une étape d’incubation durant la nuit n’est pas nécessaire. De même, titrant le phage lysat peut-être pas nécessaire. Tel que noté ci-dessus, le MOI n’est pas très critique, et une efficacité raisonnable peut être réalisée en simplement en supposant un titre de 1010 UFP/mL pour une norme de lysat.

Malgré la simplicité de la technique, transduction P1 n’est pas universellement applicable et plusieurs conditions doivent être remplies pour qu’il puisse être utile. Tout d’abord, une souche de donneur avec un allèle de knock out sélectionnable doit être disponible. Ceci est généralement accompli en utilisant une délétion où une cassette de résistance aux antibiotiques a remplacé le gène d’intérêt. La collection de Keio est particulièrement utile à cet égard, car il offre une bibliothèque de prêt-à-utiliser des antibiotiques gène axée sur la cassette les débouchures couvrant presque tous les gènes non essentiels en e. coli K12. Cette collection est particulièrement utile pour assommer des gènes conservés dans la plupart des souches Escherichia coli (c.-à-d., constituants du génome du noyau d’e. coli ). Pour les gènes moins courants, tels que les facteurs de virulence du pathogène e. coli souches ou des gènes de la voie métabolique rare, la mutation peut doivent être créés de novo. Dans de tels cas, transduction P1 peut bien ne pas être la méthode de choix. En plus des gènes essentiels, gènes requis pour P1 infection, tels galU, mutations qui mènent à P1 résistance30, sont pauvres cibles pour une suppression de transduction P1. Une autre note lorsque vous utilisez la collection de Keio, précisément, est que les quelques souches porteuses une duplication du gène ciblé, où seule une copie a été perturbée par la Kan résistance cassette8. Dans ce cas, le gène d’intérêt peut être essentiels ; les enquêteurs sont recommandés pour vérifier la mise à jour des annotations pour ces gènes8. Toutefois, compte tenu de ces restrictions, transduction P1 permet la suppression de la plupart des gènes chez les souches d’e. coli de laboratoire. Par exemple, les différences entre BW25113 et BL21 (DE3) sont petites et affectent seulement une poignée de gènes codant pour des protéines31.

Deuxièmement, il est important de souligner que la souche réceptrice doit être capable d’une recombinaison homologue pour la transduction de travailler. Une souche sans la recombinase que recA peut, par conséquent, ne pas être modifiées par cette méthode. Cela exclut toutes les souches clonage standards, tels que DH5α, HB101, TOP10 et bleu XL-1. RecA peut médier recombinaisons entre des périodes identiques aussi courtes que 8 bp ; Toutefois, une région plue de similitude élevée augmentera la probabilité de recombinaison significativement32,33. Un autre problème, en particulier avec la clinique e. coli souches, est que depuis longtemps les chaînes antigène O peuvent masquer le récepteur pour P1, qui se trouve dans l’oligosaccharide de noyau du lipopolysaccharide34. Outre ces exigences pour la souche réceptrice, la souche P1 utilisée pour la transduction devrait être un mutant vir ; Cette mutation est requise pour une infection lytique complet35.

Une troisième mise en garde de P1 transduction est que le gène à être assommé doit résider dans une région avec une similitude élevée dans les régions flanquantes entre le donateur et le bénéficiaires souches. S’il y a un manque de synténie entre les souches, le remplacement du gène cible codant la séquence avec la cassette de Kan peut bien échouer, en raison des différences dans le contenu des régions flanquantes. Par conséquent, avant de se lancer sur la suppression de gènes P1, enquêteurs devraient vérifier les séquences des souches donneur et receveur pour s’assurer que les séquences flanquantes sont homologues. Bien sûr, cela n’est possible que si les souches ont été séquencés. Dans le cas de souches avec une séquence inconnue, transduction P1 peut échouer ou causer d’autres problèmes, comme une conversion de gène dans les régions flanquantes. P1 peut transmettre environ 90 kilopaires de l’ADN ; s’il y a des différences dans le contenu de gène dans les régions autour du gène cible (par exemple, petites suppressions ou insertions), il est probable que ces reviendra à la séquence de donateurs. Cela pourrait avoir des conséquences inattendues sur le phénotype de la souche réceptrice. Donc, si possible, les séquences le donneur et le receveur autour du gène d’intérêt devraient toujours être comparés avant P1 transduction.

En conclusion, la transduction P1 est un moyen rapid de transférer un gène spécifique knock-out un certain nombre de souches, une fois que la mutation initiale de knock out a été générée. Bien que la technique a ses limites, la facilité et la rapidité de sa mise en œuvre font une alternative intéressante aux autres méthodes de suppression de gène. P1 infecte seulement les e. coli, qui normalement restreint son utilisation à cette espèce. Toutefois, certaines variantes de P1 ont été développés qui ont une plus large gamme d’hôtes et peut infecter d’autres espèces au sein de la famille des Enterobacteriaceaeet même d’autres espèces de γ-Protéobactéries, quoique réduit l’efficacité36, 37. même la transduction de l’ADN cloné d’e. coli de Myxococcus xanthus, un δ-protéobactérie, a été rapporté38. Dans des expériences futures, ces variantes pourraient être augmentés avec la mutation de vir à élargir l’éventail des bénéficiaires souches utilisées dans la suppression de l’antibiotique gène axée sur la cassette par transduction générale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Keio collection souches ont été obtenues par le projet National de BioResource (NIG, Japon) : e. coli. Nous remercions Dirk Linke (département de Biosciences, Université d’Oslo) pour son appui constant. Ce travail a été financé par le Conseil de recherche de bourse de jeune chercheur de Norvège 249793 (à Jack C. Leo).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

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Produisant des destructions de gène chez <em>Escherichia coli</em> par Transduction P1 avec des Cassettes de la résistance aux antibiotiques soumis à accises
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Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

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