Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

doi: 10.3791/58267 Published: September 1, 2018

Summary

Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

Abstract

Bakterilerde bilinmeyen bir gen işlevini incelemek için bir ilk yaklaşım bir knock-out bu gen oluşturmaktır. Burada, bakteriyofaj P1 ile jeneralize iletim kullanarak gen silme mutasyonlar bir Escherichia coli zorlanma diğerine aktarmak için sağlam ve hızlı bir iletişim kuralı açıklar. Bu yöntem mutasyon (antibiyotik kaset eklemeleri kullanarak gen kesintileri göre seçilebilirÖrneğin, ) olmasını gerektirir. Bu tür antibiyotik kaset bir donör yük seferber ve hızlı bir şekilde ilgi alıcı bir gerilim girmiştir ve kolayca bir gen silme mutant oluşturmak. Antibiyotik kaset kaset eksizyon izin flippase tanıma siteleri dahil etmek için temiz bir knock-out ile genom bir ~ 100 baz çifti uzun yara sırasına üretmek için siteye özgü bir recombinase tarafından dizayn edilebilir. Protokol autotransporter Biyogenez ilgili bir derleme faktör kodlama tamA gene dışarı knocking göstermek ve bu knock-out Biyogenez üzerinde etkisi ve iki trimeric autotransporter adhesins fonksiyonu test. Gen silme P1 iletim sınırlamaları olsa, kolaylık ve hız onun uygulama gene silme işlemini diğer yöntemleri için cazip bir alternatif olun.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İşlev bir çalışmaya ortak bir ilk yaklaşım knock-out mutagenesis gerçekleştirmek ve elde edilen fenotip dikkat etmektir. Bu da geriye doğru genetik olarak adlandırılır. E. coli bakteri moleküler biyoloji beygir son 70 yıl ya da çok, kendi kültür ve onun amenability genetik manipülasyon1kolaylığı nedeniyle olmuştur. E. coliişaret exchange mutagenesis2,3 ve son zamanlarda, λ kırmızı veya Rac ET sistemleri4,5 kullanarak recombineering da dahil olmak üzere, gen silme üretmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir , 6.

Yaygın olarak kullanılan bir sistemde, bireysel genlerin kodlama dizileri daha sonra kromozom5,7' den eksize bir antibiyotik direnci kaset değiştirilir. Kodlama dizileri, hangi flippase (FLP) tanıma hedef (FRT) siteleri iki tarafında çevrili örneğin bir sefaloridin (Kan) direnç kaset, değiştirilir. FRT siteleri recombinase siteye özgü rekombinasyon Kan kaset silinmesi için önde gelen FRT siteler arasında aracılık eder FLP tarafından tanınır. Bu şekilde, belirli bir genin kodlama dizisi tam bir silme, yalnızca yaklaşık 100 baz çifti (bp) (resim 1) en az yara dizisi bırakarak elde edilebilir.

Sadece bir on yıl kadar önce sözde Keio koleksiyonu geliştirilmiştir. Bu nerede hemen hemen tüm gerekli olmayan genler ayrı ayrı λ kırmızı rekombinasyon7,8tarafından silindi Standart laboratuvar E. coli K12 zorlanma, temel bakteriyel bir kütüphanedir. Klonlar bu koleksiyon içindeki bir excisable Kan direnç kaset ile yerine bir kodlama dizisi var. Keio koleksiyon birçok uygulamaları9için yararlı bir araç olduğu ispatlanmıştır. Böyle bir uygulama diğer E. coli suşları silme mutantlar yapımıdır. Kan kaset üzerinden verilen silme klon genellikle bacteriophages, P110,11,12,13,14gibi transducing tarafından seferber. Böyle bir yük hazırlanan bir fajının hisse senedi daha sonra alıcı faiz, e.coli suşu bulaştırmak için nerede bir düşük ama güvenilir frekansta Kan kaset içeren bölge alıcı Genom tarafından Homolog rekombinasyon dahil edilebilir kullanılabilir (Şekil 2). Transductants Kan içeren ortamda büyümesi için seçilebilir. Antibiyotik direnci kaset kaldırılmasını isterseniz, bunu, FLP recombinase trans transductant zorlanma sağlanabilir. Ampisilin (Amp) direnç işaret taşıyan FLP içeren plazmid kür sonra Kan ve Amp duyarlı klonlar için ekranlı ve vahşi-türü kodlama dizisi ve Kan kaset doğru eksizyon PCR colony tarafından doğrulandı.

Burada, her bir knock-out yukarıda özetlenen strateji dayalı E. coli zorlanma üreten adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Örnek olarak, tamA gen silinmesiyle gösterilmiştir. tamA bir parçası olan taşıma ve montaj modülü (TAM), bazı autotransporter proteinler ve pili15,16,17Biyogenez yer bir dış membran β-varil protein kodlar. Bu knock-out zorlanma sonra iki trimeric autotransporter adhesins (TAAs), Yersinia adhesin YadA ve E. coli immünglobulin (Ig) tamA silinmesi Biyogenez üzerinde etkisini incelemek için kullanılan-TAA EibD bağlama 18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. suşları ve Plazmidlerin

  1. Bakteri suşları
    1. E. coli suşları BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20ve BL21ΔABCF21kullanın. Malzemeler tablo daha fazla bilgi için bkz:.
  2. Bacteriophages
    1. Feyc P1vir genel iletim için kullanın. Kloroform birkaç damla ile sıvı bir hisse senedi olarak faj saklamak (bkz. Adım 2.2). Daha fazla bilgi için bkz: Tablo reçetesi.
  3. Plazmid
    1. Bu protokol için aşağıdaki plazmid kullanın: pCP2022, pIBA2 YadA23ve pEibD1024. Denetim plazmid pASK-IBA2 ve pET22b ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın.
  4. Büyüme koşulları
    1. Dinç (180-200 devir/dakika) 37 ° C veya 30 ° C durumunda BL21ΔABCF ve pCP20 içeren suşları sallayarak bir lysogeny suyu (LB) orta25 bakteri yaymak.
    2. 43 ° C'de kür plazmid gerçekleştirmek
    3. Sağlam bir orta için LB %1 agar (w/v) ile ek.
    4. En iyi agar için LB %0,7 agar ve 10 mM CaCl2 ve otoklav orta ile ek. SOC orta Elektroporasyon26sonra kurtarma için kullanın.
    5. Aşağıdaki konsantrasyonları için antibiyotik kullanmak: 100 μg/mL Amp ve 25 μg/mL kan için

2. bir fajının Lysate hazırlanması

  1. Enfeksiyon büyük donör yük
    1. 10 mM CaCl2 ve isteğe bağlı olarak Kan ile desteklenmiş LB orta 5 ml donör zorlanma JW4197 büyümek (25 µg/mL) için bir optik yoğunluk 600 nm ~ 1.0 (OD600). Bir spektrofotometre kullanarak OD600 değerini ölçmek.
    2. Varolan bir P1 fajının stok seyreltme dizi LB ortamda yapmak: dilutions 10-7için 10-3 arasında önerilir.
    3. Mix 200 μL bakteriyel süspansiyon ve verilen fajının seyreltme 15 mL santrifüj tüpü veya eşdeğeri 100 μL. Çok sayıda tüpler fajının dilutions hazırlayın. Tüpler 37 ° C'de 20 dk için sallayarak olmadan kuluçkaya.
    4. Tüpler için 10 mM CaCl2 ile takıma erimiş üst agar (~ 50 ° C) ~ 3 mL ekleyin, içeriği iyice kısa bir süre tüpler vortexing tarafından mix ve karışımları hatta katmanlar yapmak prewarmed LB plakalar üzerine dökün.
    5. Plakayı gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  2. Lysate hazırlık
    1. Ertesi gün bir tabak yarı konfluent büyüme fajının plaklar ile seçin. Yarı konfluent bir plaka üzerinde yaklaşık yarım yüzey alanı plaka açıktır (Şekil 3).
    2. Bir aşı döngü veya benzer bir aracı kullanarak böyle bir tabak üst agar katmandan scrape ve üst agar bir santrifüj tüpü yerleştirin. 1-2 mL lb ve kloroform ve girdap şiddetle ~ 1 dk. Ekle kloroform için tüp bir damla duman mahallede ekleyin.
    3. Tüp agar ve bakteri hücreleri cips için 4000 g x veya daha hızlı, 15 dk santrifüj kapasitesi.
    4. Süpernatant Pelet üzerinden herhangi bir enkaz üzerinde taşıyan kaçınarak bir taze microcentrifuge tüp taşıyın. Kloroform 2 damla ekleyin ve lysate 4-10 ° C'de depolayın Kloroform duman mahallede ekleyin. Faj-değil var dondurmak lysate gibi bu bulaşıcı parçacık sayısı önemli bir azalma sonuçlanır.
  3. Lysate titresi belirleme
    1. BW25113 37 ° C'de 10 mM CaCl2 ile kültür bir OD600 ~ 1.0 ulaşır kadar takıma LB içinde büyümek.
    2. Feyc LB (Örneğin, 10-6–10-9) lysate bir seyreltme dizi hazırlamak.
      Not: damlalıklı örnek üst lysate dilutions için kloroform aktarılmasını önlemek için dikkatli olun.
    3. Mix 200 μL bakteriyel süspansiyon ve verilen fajının seyreltme 15 mL santrifüj tüpü veya eşdeğeri 100 μL. Çok sayıda tüpler fajının dilutions hazırlayın. Tüpler 37 ° C'de 20 dk için sallayarak olmadan kuluçkaya.
    4. Tüpler için 10 mM CaCl2 ile takıma erimiş üst agar (~ 50 ° C) ~ 3 mL ekleyin, içeriği iyice kısa bir süre tüpler vortexing tarafından mix ve hatta katmanlar yapmak prewarmed LB plakalar üzerine karışımı dökün.
    5. Plakayı gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    6. Ertesi gün plaklar (bakteriyel mat açık bölgelerde) her plaka için sayma ve titresi lysate aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
      Equation 1
      Örnek: dilutions 10-7, 10-8ve 10-9ile levha üzerinde orada 231, 27 ve 2 plaklar, sırasıyla. Her seyreltme 100 μL enfeksiyonu için kullanılan gibi ve titresi plak şekillendirme olarak ifade edilir çünkü birimleri (pfu) / mL, kaplama faktör 10. Bu sayılar formüle girilir:
      Equation 2
      Böylece, titresi yaklaşık 2 x 1010 bulaşıcı fajının parçacıklar/ml'dir.

3. P1 iletim

  1. Alıcı hücreler hazırlanıyor
    1. Alıcı zorlanma BL21ΔABCF 600 optik bir yoğunluk için takıma LB büyümek nm ~ 1.0 (OD600). Bir spektrofotometre OD600 değeri ölçmek için kullanın.
    2. Enfeksiyon (MOI) değeri 0,5 çokluğu sağlanması için gerekli lysate fajının hacmi hesaplamak. MOI hesaplamak için bakterileri OD600 kültür göre sayısını tahmin ediyoruz. Bir OD600 değerinin 1.0 ~ 109 cfu/mL karşılık geldiği varsayılmaktadır. Gerekli birim üzerinde lysate titresi bilinen dayalı hesaplamak.
      Örnek: (-den sonra adım 2.3.6 örnekte hesaplanan titresi bağlı olarak)
      Equation 3
    3. 10 mM için alıcı zorlanma kültürüne CaCl2 ekleyip karıştırın. Kültür iletim için 1 mL al.
  2. İletim gerçekleştirme
    1. Feyc lysate uygun hacmi 1 mL (10 mm CaCl2 dahil) alıcı kültür 3.1.2. adımda hesaplanan ekleyin ve karışımı yavaşça.
      Not: örnek lysate karıştırmak için kloroform aktarılmasını önlemek için üst pipette için dikkatli olun.
    2. Statik olarak 37 ° C'de 20 dk için karışımı kuluçkaya
    3. Enfeksiyon için 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5, ekleyerek durdurmak.
    4. Bakteri (5000 x g için 2 dk) santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın ve sonra onları taze LB ile 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5 takıma 1 ml resuspend.
    5. İki kez daha fazla adım 3.2.4 ücretsiz phages ve kalsiyum kaldırılmasını sağlamak için olduğu gibi hücreleri yıkayın.
    6. 1 mL taze lb 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5 ile desteklenmiş bakterilerde resuspend. Bakteri (> 100 rpm) sallayarak ile 1 h için 30 ° C'de kuluçkaya.
    7. Santrifüjü (5000 x g için 2 dk) tarafından bakteri toplamak ve onları LB ~ 100 μL 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5 ile resuspend.
    8. 25 µg/mL ve 10 mM sodyum sitrat, pH 5.5, Kan ile desteklenmiş bir LB plaka üzerinde bakteri yaymak ve 30 ° C'de bakteri kolonileri (~ 24 h) görününceye büyür.
  3. Transductants seçme
    1. Koloniler seçimi plaka üzerinde büyüdü sonra onları restreak LB + Kan için tek kolonileri ve tek kolonileri görünür kadar 30 ° C'de büyür.

4. Kan kaset bilincin

  1. Rekombinasyon plazmid ile dönüştürme
    1. Kan dayanıklı BL21ΔABCF gerilme electrocompetent olun.
      1. Taze LB (5 mL) Kan ile desteklenmiş bir koloni gelen zorlanma büyümek (25 µg/mL) OD600 ~0.5 – 0,7 olana 30 ° C'de.
      2. Şu andan itibaren 4 ° C'de veya buz üzerinde aşağıdaki adımları uygulayın. Bakteri (5000 x g 10 dk) santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
      3. İki kez önceki Santrifüjü adımı tekrar ederek hücre Pelet buz gibi soğuk distile su ile yıkama ve son olarak, hücre Pelet buz gibi % 10 gliserol 100 µL içinde resuspend.
    2. 1 mm Elektroporasyon cuvettes buz üzerinde sakin.
    3. Plazmid DNA (pCP20) 1 pg hücre süspansiyon eklemek, süspansiyon karışımı yavaşça ve soğutmalı Elektroporasyon küvet aktarın.
    4. Electroporator 1.8 ayarla kV ve electroporate hücreleri.
    5. 1 mL SOC orta ekleyerek ve onları 30 ° C'de 1 h için büyüyen dönüştürülmüş hücreleri kurtarmak
    6. 100 µL LB hücrelerin plaka + Amp tabaklar ve 30 ° C'de hücreler gecede büyümek.
  2. Rekombinasyon indüksiyon
    1. Çekme tek kolonileri LB + Amp plaka ve taze LB tüm antibiyotiklere atlama aşılamak.
    2. Hücreleri, Sigara keyfi sıcaklığında (43 ° C) gece FLP recombinase ifade ikna etmek için büyür.
  3. Rekombinasyonlar seçme
    1. Seri dilutions yapmak ve non-selektif plakaları 105-106 seyreltme 50 µL plaka ve gecede 30 ° C'de büyür

5. gen silme doğrulanması

  1. Plazmid kaybı ve başarılı rekombinasyon doğrulama
    1. Çizgi tek kolonileri adım 4.3.1 LB + Kan, LB + Amp hazırlanan tabak ve LB plakaları olmadan antibiyotik, bu sırada. Çizgiler içinde yardım etmek için bir koloni kılavuzunu kullanın (bkz. ek dosya 1). Koloniler (~ 24 h) görününceye tabak 30 ° C'de büyümek.
    2. Non-selektif plaka üzerinde yetiştirilen, ancak daha fazla doğrulama için seçmeli medya büyümeye başarısız oldu 10-20 klonlar almak.
  2. Koloni PCR tarafından ek doğrulama
    1. Bir koloni PCR sıra kodlama tamA kanat astar ile gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. Bir ana PCR karışımı hazırlayın. Gerekli mix ( Tablo 1' deki örneğe bakın) test edilecek kolonileri sayısını bağlıdır. Buzda reaktifleri mix, polimeraz son ekleyin.
    3. PCR ana karışımı iyice karıştırın, sonra 20 µL PCR şerit tüpler içine dağıtmak. Her koloni steril pipet ucu kullanarak taranması için küçük bir miktar almak ve bir tüp için ekleyin. Orijinal alıcı türe ürününü karşılaştırma listesine eklemeyi unutmayın. İsteğe bağlı, ayrıca donör zorlanma içerebilir.
    4. PCR reaksiyon çalıştırmak (bkz. Tablo 2 program için kullanılır).
    5. % 1'özel jel hazırlayın.
      1. 50 mL jel için özel 0.5 g ölçmek ve TAE arabellek (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 mL ekleyin. Tüm özel eriyene kadar karışımı fırın mikrodalga bir de ısı.
      2. Bir kez özel çözünmüş, çözüm için yaklaşık 50 ° C serin ve boya boyama DNA'ın 5 μL eklemek. Çözüm karıştırın ve bir döküm odası jel tepsisine içine dökün. Böylece tüm örnekleri yanı sıra moleküler boyutu işaretçileri için yeterli wells iyi tarak bir veya daha fazla satırı ekleyin. Jel 30 dk için ayarlamak izin verir.
    6. 6 x DNA yükleme boya 4 µL PCR çalışma tamamlandıktan sonra her örnek için ekleyin. Jel Elektroforez odasında yerleştirin ve kuyular kaplıdır kadar TAE arabellek ekleyin.
    7. 10-15 µL jel bir kuyuda her PCR reaksiyon uygulayın. Ayrıca moleküler boyutu işaretleyicinin 5 µL ekleyin. Daha sonra 30 dk için jel 75 V çalıştırın.
    8. Çalışma tamamlandıktan sonra bir mavi ışık Imager kullanarak jel görüntü.

6. diğer teknikleri

  1. Protein ifade
    Not: Test proteinler (YadA ve EibD) ifadesi oldu23,24başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu ana adımları kısa bir özetidir.
    1. BL21ΔABCF ΔtamA wITH gerekli plazmid (pIBA2-YadA ve pEibD10 ve karşılık gelen denetim plazmid) dönüştürmek ve transformants LB + Amp için seçin.
    2. Protein ifade için bir gecede kültür dönüştürülmüş bakteri 1 mL ile 100 mL LB orta + Amp aşılamak ve bunlar 30 ° C'de orta log fazı, ne zaman kadar büyümek, her iki anhydrotetracycline (100 ng/mL) adlı protein üretim teşvik veya İzopropil thiogalactoside (0.5 mM) de.
    3. İndüksiyon 30 ° C'de 2 h kültürlerin bulanıklık ölçmek ve 50 mL OD600 karşılık gelen hücre sayısı toplamak sonra = 1.0 kültürler 4.000 x gde 15 dakika centrifuging. Pelet yıkayın 1 x 10 mM HEPES ile pH 7,4 ve sonra da-20 ° C veya işlem adım 6.2 olduğu gibi daha fazla bu depolamak.
  2. Dış membran çıkarma
    Not: Leo vd tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi dış membran ayıklama gerçekleştirilir 27. ana adımları aşağıda özetlenmiştir.
    1. Resuspend hücre pelet 1 ml 10 mm HEPES, pH 7.4, takıma 10 mM MgCl2 ve MnCl2, lizozim (0.1 mg/mL) ve bir tutam DNaz ile ben.
    2. (Bir boncuk çırpıcı kullanarakÖrneğin,) hücreleri parçalayıcı.
    3. Kısa bir süre (15,600 x gde 2 dk) hücreleri hücre artıkları kaldırmak ve süpernatant temiz bir tüp taşımak için santrifüj kapasitesi.
    4. Hücreler için 16.000 x g, 30 dk sonra santrifüj kapasitesi, %1 N-lauroyl sarcosine 10 mm HEPES, pH 7.4 400 μL Pelet resuspend.
    5. Hangi sonra oda sıcaklığında 30 dakika ajitasyon hücrelerle kuluçkaya, onları yukarıdaki gibi 30 dk santrifüj kapasitesi.
    6. Yıkama saydam 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 200 μL ile cips ve daha sonra 10 mM HEPES 30 μL içinde resuspend ve 4 SDS-sayfa örnek arabellek x 10 μL ekleyin.
  3. Etkinlik deneyleri
    Not: SDS-sayfa ve etkinlik deneyleri tarif28YadA ve EibD için gerçekleştirin. Ana adımları aşağıda özetlenmiştir.
  4. SDS-SAYFA
    1. Örnekleri 50 ° c 5 min için jel polyacrylamide proteinleri denaturing önlemek için, yüklemeden önce ısı.
    2. SDS-sayfa boşanmadan sonra polivinilidin difluoride (PVDF) membran proteinleri aktarın.
    3. Aktarımdan sonra membran PBS de %2 yağsız süt tozu ile engelleyin.
  5. YadA-kollajen kadar western blot
    1. Belgili tanımlık kütük parçası sonra ben seyreltilmiş sığır kollajen türü engelleme arabellekte bir konsantrasyon 10 μg/mL için eklemek ve membran 1 h için kuluçkaya.
    2. Membran 2 yıkama x PBS + %0,05 Tween20 ile (PBS-T).
    3. Membran için birincil antikor (monoklonal Anti-kollajen COL-1), seyreltilmiş 1:2,000 engelleme arabellekte ekleyin.
    4. 1s için membran kuluçka sonra adım 6.3.2.2 belirtildiği gibi 2 x yıkayın ve ikincil antikor [keçi Anti-fare IgG-horseradish peroksidaz (HRP) eşlenik], seyreltilmiş 1:10,000 engelleme arabellekte ekleyin.
    5. Membran 1 h için kuluçkaya sonra yıka 2 x ile PBS-T. Membran üretici yönergelerine göre gelişmiş bir chemiluminescent substrat ekleyin ve grubun bir CCD kamera ile tespit.
  6. EibD-IgG bağlama tahlil
    1. Engelleme sonra ikincil antikor (keçi Anti-tavşan HRP), seyreltilmiş engelleme arabelleği 1:2,000 ekleyin.
    2. Membran 1 h için kuluçkaya sonra yıka 2 x PBS ile. Chemiluminescent adım 6.3.2.5 belirtildiği gibi saptaması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir tamA Knock-out BL21ΔABCF, nesil:

Yukarıda özetlenen strateji BL21(DE3), dış membran protein üretimi için en iyi duruma getirilmiş ve BL21ΔABCF21denilen protein üretimi için kullanılan bir Standart laboratuvar yük türetilmiş bir tür üretmek için daha önce kullanılmış. Bu zorlanma dört genler bol dış membran proteinlerinin için kodlama yoksun ve sonuç olarak, daha heterologously ifade dış membran proteinlerinin vahşi tipi yük daha üretmek mümkün. TAM TAA Biyogenez dahil olup olmadığını sınamak için tamA gene bu arka planda silindi.

Bir P1 lysate sıra kodlama tamA gen (daha önce çağrılan yftM) tarafından bir kaplan direnç Kaset nerede yerini Keio koleksiyonu zorlanma JW4179, hazırlanmıştır. O zaman, iletim deneme alıcı zorlanma BL21ΔABCF ile gerçekleştirildi. Kan dayanıklı sömürgeler elde, sonra iki Kan kaset eksizyon için seçilmiştir. FLP recombinase kodlama plazmid pCP20 bu klonlar tanıttı ve daha sonra yokluğunda bir antibiyotik seçimi, 43 ° C'de büyüyerek tedavi. Klonlar bir dizi (Bu pCP20 bir işaretleyici) Amp ve Kan duyarlılık için gösterildi ve birkaç klonlar için her ikisi de hassas elde edilmiştir. Bu klonlar PCR colony tarafından doğrulanmadı tamA sıra kodlama ve tamA gen başarıyla silindi bulundu kanat astar (Şekil 4) kullanarak.

TAA Biyogenez TamA'ın rolü:

TamA bazı klasik autotransporters16 ve ters autotransporter intimin15Biyogenez dahil olmak gösterilmiştir. TamA TAAs Dipnotlar için önemli olup olmadığını sınamak için BL21ΔABCF ΔtamA iki test protein, Yersinia adhesin YadA ve E. coli IG-bağlayıcı protein EibD kodlama Plasmid'ler ile dönüştü. Bu proteinler de E. coli hızlı ve model olarak önceki çalışmalar23,28TAA Dipnotlar için kullanılmış olduğu bilinmektedir.

Protein üretim inducing sonra dış membran kesirler ifade kültürlerin izole ve SDS-PAGE tarafından analiz. Örnekleri trimerization proteinlerin göstermek için haşlanmış değil. Monomer-si olmak beklemek 45 kDa (YadA) boyutları ve 51 kDa (EibD) ise 100 kDa, yukarıda boyutunda trimers çalıştırın. Hiçbir büyük farkı BL21ΔABCF ifade seviyelerinde ve BL21ΔABCF arasında gözlenen ΔtamA, YadA ΔtamA zorlanma (Şekil 5A) biraz daha alt düzeylerde üretilen görünüyor olsa da. Ancak, tam tersi EibD için durum gibi görünüyor.

TamA eksikliği doğru katlanır veya taşıma proteinlerin etkisi olup olmadığını incelemek için yeteneklerini için ligandlar bağlamak için test edildi. YadA için bu bir kollajen kadar western blot (Şekil 5B) tarafından gerçekleştirilmiştir. YadA, her iki suşlar kollajen benzer bir düzeyde protein doğru katlanmış ve işlevsel olduğunu gösteren bağlı. Benzer şekilde, iki suşlar EibD IgG-bağlama faaliyetlerine ifade düzey (Şekil 4 c) ile ilişkili. Bu sonuçlar silinmesi tamA da en azından bu iki model TAAs için TAA dipnotlar üzerinde önemli bir etkisi olmadığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: knock-out excisable antibiyotik kasetleri ile nesil. Gen knock-out üretmek için bir gen (Bu örnekte Gene B) ilgi FRT siteleri tarafından çevrili bir Kan direnç kaset değiştirilir. FRT-Kan kaset, buna karşılık, kısa tarafından çevrili olduğunu (~ 50 bp) sırası Gen B. akış yukarı ve aşağı akım bölgelerinde homolog uzanır Gene b kodlama dizisi FRT-Kan kaset için λ tarafından değiştirilir kırmızı rekombinasyon. Bir kez bu gerçekleştirilir, Kan kaset bir siteye özgü rekombinasyon FRT siteler arasında arabuluculuk FLP recombinase tanıtarak kaldırılabilir. Bu en az bırakarak Kan kaset excises (~ 100 bp) iz B locus sırayla. Ayrıntılı bilgi için bkz: Baba vd. 7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: gen silme P1 hedefidirler. Donör faiz (sarı) kromozom (mavi) gen yerini aldı bir Kan kaset (bej) taşıyan süzün. Donör ile P1 bakteriyofaj bulaşmıştır. Feyc ettiklerinizden çok sayıda üreten donör gerginliği, çarpar. En vahşi-tipi (kırmızı genom), ancak bir kısmı olan bir bölümü donör zorlanma kromozom tercihan--dan faj DNA'ın (mavi genom) dahil olması phages transducing. Bunlar bir kısmı Kan kaset (sarı genom) içerir. Sonunda, virüslü konak hücre lyses ve phages Orta serbest bırakır. Bu bir lysate hazırlamak için kullanılır. İletim deneyde, alıcı zorlanma (açık mavi) donör zorlanma hazırlanan lysate bulaşmış. Durumlarda bir azınlık (burada gösterilen) Kan kaset taşıyan bir transducing fajının tarafından alıcının bulaşmıştır. Kan kaset bitişik bölgeler Homolog rekombinasyon tabi eğer Kan kaset için seçilen Kan dayanıklı klonlar sonuçlanan endojen alleli yerine alıcı kromozom eklenmiştir. FLP recombinase tedavi edilebilir bir plazmid üzerinde ek hangi Kan duyarlı fenotip için klon döner (burada gösterilen sarı renkte) sadece bir kısa yara sıra bırakarak Kan kaset excises. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: P1 enfeksiyon sonra plakaları örnekleri. Bir tabak bireysel plaklar ile (A) Bu panel gösterir. (B) Bu panel yarı konfluent bir tabak gösterir. (C) Bu panel nerede hemen hemen tüm bakteri fajının tarafından lysed aşırı virüslü bir plaka gösterir. Bazı dayanıklı kolonileri üst agar katman dışında büyüdü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Silinmesi tamA sıra kodlama. TamA::kan silme alleli zorlanma BL21ΔABCF P1 iletim tarafından kullanılmaya başlandı. Sonra Kan kaset, bir yara izi sıra eksizyon (~ 100 bp) kalan tamA odağı, tüm tek şey. Bu silme site kanat primerler kullanılarak PCR tarafından doğrulandı. BL21ΔABCF ve onun üst zorlanma, BL21(DE3), PCR bir ürün dizisi (beklenen 1.7 kilobaz çifti boyutudur) kodlama tamA uzunluğunu verir. Nerede Kan kaset, eksize, BL21ΔABCF içinde ürünün beklenen yara dizisine karşılık gelen (145 bp). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: İfade bir tamA silme yük tarafından TAAs. (A) Bu panel gösterir SDS-sayfa dış membran TAAs (YadA veya EibD) ve vektör denetimleri (pIBA2 ve pET22) ifade hücrelerden hazır. Suşların BL21ΔABCF ve onun türev zorlanma TamA (ΔtamA) eksik vardır. (B) Bu panel bir kollajen western kadar leke YadA örnekleri gösterir. YadA örnekleri ve pIBA2 kontrol panelinden A PVDF membran için transfer edildi ve kollajen türü ile inkübe. Daha sonra bir anti-kollajen antikor ile probed ve ECL tarafından tespit. (C) Bu panel bir antikor bağlama tahlil EibD örnekleri için gösterir. EibD örnekleri ve pET22 Denetim Masası A PVDF membran için transfer ve HRP Birleşik bir ikincil antikor ile inkübe ve ECL tarafından tespit edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktif 1 x karıştırmak 7 x karıştırmak
PCR-sınıf su 17 ΜL 119 ΜL
10 x polimeraz arabellek 2 ΜL 14 ΜL
10 mM deoksribonüklotit mix 0.4 ΜL 2.8 ΜL
100 µM ileri astar 0.2 ΜL 1.4 ΜL
100 µM ters astar 0.2 ΜL 1.4 ΜL
Taq DNA polimeraz 0.2 ΜL 1.4 ΜL
Toplam 20 ΜL 140 ΜL

Tablo 1: koloni PCR karışımı usta. Mix taranması için kolonileri sayısına bağlıdır. Ayrıca, bir denetimi tepki (orijinal alıcı zorlanma) hazırlayın. Örneğin, beş klonlar eleme, altı reaksiyonlar, denetimi de dahil olmak üzere ihtiyaç vardır. Değer tüm örnekleri için yeterli PCR karışımı olduğundan emin olmak için (pipetting küçük pipetting hataları yükselterek tekrarlanan) ilave bir reaksiyon hazırlanıyor. Bu örnekte, bir 7 x karıştırmak (5 koloniler, 1 kontrol ve 1 ilave reaksiyon) hazırlayın.

Adım Sıcaklık Zaman Notlar
1. 94 ° C 3 dk.
2. 94 ° C 30 s
3. 50 ° C 30 s
4. 70 ° C 2 dk 1 dk./kb kuvvetlendirilmesine için yuvarlama
2 24 kez adım dönmek
5. 70 ° C 5 dk
6. 12 ° C Sonsuza kadar Son tutun

Tablo 2: Koloni PCR programı.

Ek dosya 1: koloni kılavuz örneği. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

P1 iletim gen silme E. coliüretmek için hızlı, sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Bu burada bir BL21 elde edilen alıcıya Keio donör zorlanma tamA silme mutant transducing tarafından gösterilmiştir. İletim işlemi büyük aşamasında bulunmaktadır lysate transducing üretim, iletim, Kan direnç kaset eksizyon ve knock-out PCR tarafından doğrulanması. Toplamda, süreci yaklaşık 1 hafta alır ve doğrulama için son PCR dışında kullanılmak üzere hiçbir moleküler biyoloji yöntemleri gerektirir. Böylece, P1 iletim kırmızı rekombinasyon harcanan çaba ve zaman λ ile rekabet edebilecek ve geleneksel işaret exchange mutagenesis hızlıdır.

Sunulan iletişim kuralı çok sağlam ve adımlardan değişiklikler için sağlar. Ancak, birkaç kritik parametreleri vardır. P1 enfeksiyonlar için orta olarak kalsiyum iyonları eklemek gereklidir. Kalsiyum için bakteri faj adsorpsiyon için gerekli ve yeterli kalsiyum orta olarak eklemek için başarısızlık enfeksiyon verimliliğini önemli ölçüde azaltacaktır. BL21ΔABCF eğilimi gibi bazı bakteri suşları CaCl221huzurunda toplamak. Bu gibi durumlarda, bakteri CaCl2kısa bir süre önce enfeksiyon süspansiyon eklenebilir, olmadan yetiştirilen olabilir. Ancak, daha geleneksel suşları için 10 mM CaCl2 başına büyüme ortamından dahil.

Diğer taraftan, Bedava kalsiyumu ortamından sonra iletim kaldırmak önemlidir. Sitrat bir şelatör kalsiyum iyonlarının olduğunu ve bunlar P1 adsorpsiyon konak hücreleri için gereklidir çünkü bedava kalsiyumu ortamından kaldırılması daha da enfeksiyonları önler. Phages kalsiyum kaldırılmaz ise, hücre kültürü, en iyi ihtimalle iletim verimliliğini azaltmak ve en kötü ihtimalle transductants de dahil olmak üzere bütün kültür lysing boyunca daha fazla enfekte edecek.

Başka bir önemli adım plazmid pCP20 taşıyan bakteri kültürü. pCP20 37 ° C veya daha yüksek sıcaklıklarda çoğaltmıyor koşullu olarak kopyalayan bir plazmid olduğunu; Böylece, hücrelerdeki plazmid kurmak için incubations bu plazmid ile gerçekleştirilen 30 ° c (veya daha düşük), olması gerekir pCP20 çoğaltma için izin veren bir sıcaklık. PCP20 tedavi için yüksek sıcaklık (43 ° C) kullanılır. Bazı suşları de bu sıcaklıkta büyümek değil; Plazmid kür bu sıcaklıkta biraz daha az verimli olacak, ancak bu gibi durumlarda, 37 ° C, yeterli olacaktır.

Bakteri için antibiyotik duyarlılık test etmek için kaplama, çizgiler plaka sırası önemlidir. Önce antibiyotik içeren çizgili klonlar için protokol çağırır plakaları ve nihayet seçici olmayan ortamda. Bu şekilde araştırmacı seçmeli medya büyüme herhangi bir eksikliği nedeniyle antibiyotik duyarlılık olacak emin olabilirsiniz ve yerine malzeme olası bir eksikliği tabaklarda transfer. Aşağıdaki iletişim kuralı, hiçbir büyüme LB + Kan plaka doğrular eksizyon Kan direnç kaset; hiçbir büyüme LB + Amp plaka rekombinasyon plazmid pCP20; kaybı doğrular (Bu aynı streaking deneyde seçimi tabaklarda büyümek değil) LB plaka üzerinde büyüyen suşları olumlu rekombinasyonlar içerir.

Çoğu diğer adımları önemli payı için izin. Bu yük de 37 ° C'de büyümek değil gibi protokol olarak sunulan, BL21ΔABCF 30 ° C'de kültürlü Ancak, E. coli suşları büyüme kusurları olmadan 37 ° C'de (pCP20 ile dönüştürülmüş zaman dışında) kültürlü.

Bakteri enfeksiyonları için kullanılan sayısı bir ölçüde farklı olabilir. OD600 ve uygun sayısı arasındaki ilişki bir OD600 değerini 0.1 ve 1.0, arasında kabaca doğrusal nerede eski yaklaşık 108 cfu/mL ve ikinci ~ 109 cfu/ml karşılık gelir. Ancak, bu ilişki bir dereceye kadar söz konusu zorlanma, büyüme orta ve diğer faktörlere bağlı olarak değişebilir. OD600 ve uygun sayısı arasındaki ilişki her laboratuvar ve özellikle MOI değerleri hesaplamak için zorlanma, kurulmalıdır önerilir. Enfeksiyon deneylerde kullanılan bakteri sayısı özellikle kritik değildir ve 109 cfu/mL hücre yoğunluğu ve hücrelerin kültür oranı arasında makul bir uzlaşma olduğunu erken durağan faz temsil eder. İletim için uygun bakterilerin daha düşük bir sayı kullanılıyorsa, phages sayısı sadece buna göre ayarlanması gerekir. MOI kendisi de bir ölçüde farklı olabilir. Her ne kadar 0,1 ve 0,5 arasında bir şey iyi bir verimlilik sonuçlanmalıdır protokol 0.5, MOI değeri için çağırır. Bir MOI 0,5, 1:2 (yani, bakteri sayısıyla karşılaştırıldığında phages yarım sayısı) bakteri phages oranıdır. Örnekte protokol, 1.0, kültür OD600 ' dür ve kültür 1 mL iletim için; Böylece, gerekli phages 5 x 108sayısıdır. Bir MOI değeri 0,5 enfeksiyon yüksek düzeyde verir ama vahşi-tipi (enfeksiyon) phages çok transducing phages sayıca üstün olan iletim verimliliğini azaltmak iki kat bulaşmış, bakteri sayısını azaltır. Çift kişilik bir enfeksiyon transducing fajının ve bulaşıcı bir Feyc ile lizis böylece kurtulanlar havuzundan bu transductant ortadan kaldırarak, hücre için yol açacak. Bu nedenle, bir MOI 0,5 aşılmış değil.

İletişim kuralı da bazı kısayollar için izin verir. Lysates plakalar üzerinden hazırlamak yerine, bazı yazarlar fajının lysates sıvı orta29hazırlanıyor savunucusu. Bir gecede kuluçka adım gerekli değildir gibi bu zaman kazanabilirsiniz. Benzer şekilde, lysate fajının titrating gerekli olmayabilir. Yukarıda da belirtildiği gibi MOI çok kritik değildir ve makul verimliliği sadece 1010 pfu/mL standartı titresi lysate varsayarak tarafından elde edilebilir.

Rağmen teknik kolaylığı, P1 iletim evrensel olarak geçerli değildir ve bunun için yararlı olması çeşitli koşullar sağlanmalıdır. İlk olarak, bir donör gerilme seçilebilir bir knock-out alleli ile kullanılabilir olması gerekir. Bu genellikle nerede bir antibiyotik direnci kaset gene ilgi yerini aldı bir silme işlemini kullanarak gerçekleştirilir. Antibiyotik kaset tabanlı gen knock-çıkışları E. coli K12 hemen hemen tüm gerekli olmayan genlerinde kapsayan bir kullanıma hazır kütüphane sunan Keio koleksiyonu bu bağlamda, özellikle yararlıdır. Bu koleksiyon korunmuş genlerin çoğu E. coli suşları (Örneğin, E. coli çekirdek genom bileşenlerinin) içinde bulunan dışarı vurma için özellikle yararlıdır. Virülans faktörleri patojenik E. coli gibi daha az yaygın genler için suşları veya nadir metabolik yolu genler, mutasyon de novooluşturulması için gerekebilir. Bu gibi durumlarda, P1 iletim yönteminin seçimi olmayabilir de. Gerekli genler yanı sıra gibi galU, P1 enfeksiyon için gerekli olan genler olan mutasyonlar P1 direnci30' a kurşun, P1 iletim tarafından silinmek zavallı hedefleridir. Keio koleksiyonu, özellikle, kullanırken başka bir not birkaç suş nerede tek bir kopya Kan direnç kaset8tarafından kesilmiş olabilir hedeflenen gen tekrarını taşımak olduğunu. Bu gibi durumlarda, gen ilgi-ebilmek var olmak gerekli; Müfettişler böyle genler8için Güncellenme Zamanı ek açıklamaları kontrol etmek için tavsiye edilir. Ancak, bu bağlar göz önüne alındığında, P1 iletim silme çoğu genlerin laboratuvar E. coli suşları sağlar. Örneğin, BW25113 ve BL21(DE3) arasındaki farklar küçük ve protein kodlayıcı genlerin31sadece bir avuç etkiler.

İkinci olarak, alıcı zorlanma çalışmak iletim için Homolog rekombinasyon kabil olması gerektiğini vurgulamak önemlidir. RecA olabilir, recombinase eksik bir yük, bu nedenle, bu yöntem tarafından değiştirilmesi değil. Bu DH5α, HB101, TOP10 ve XL-1 mavi gibi tüm standart klonlama suşları içermez. RecA recombinations aynı uzanıyor 8 olarak kısa arasında arabuluculuk kan basıncı; Ancak, yüksek benzerliği daha uzun bir bölgenin rekombinasyon olasılığı önemli ölçüde artacak32,33. Başka bir sorun, özellikle klinik E. coli suşları, uzun O-antijen zincirleri lipopolysaccharide34çekirdek oligosakkarit yatıyor P1 için reseptör maskeleyebilir olduğunu. Alıcı zorlanma için bu gereksinimlere ek olarak, iletim için kullanılan P1 zorlanma bir vir mutant olmalıdır; Bu mutasyon tam litik enfeksiyon35için gereklidir.

Nakavt gen donör ve alıcı suşları arasında kanat bölgelerde yüksek benzerliği ile bir bölgede bulunması gereken iletim olduğunu P1 üçüncü bir ikaz. Synteny suşları arasında eksikliği varsa, sıra Kan kaset ile kodlama hedef gen yerine de, kanat bölgeleri içeriğini farklılıkları nedeniyle başarısız olabilir. Bu nedenle, P1-aracılı gen silme başlamadan önce müfettişler kanat dizileri homolog olduğundan emin olmak için donör ve alıcı suşları dizisi kontrol etmelisiniz. Tabii ki, bu sadece suşları sıralı mümkündür. Bilinmeyen bir sıra ile suşları durumunda P1 iletim ya başarısız olabilir veya bir gen dönüştürme kanat bölgelerde gibi diğer sorunlara neden. P1 yaklaşık 90 kilobaz çifti DNA'ın transduce; hedef gen (Örneğin, küçük silme veya ekleme) çevresinde bölgelerde gen içeriğindeki farklılıklar varsa, bunlar donör dizisine döner olasıdır. Bu alıcı zorlanma fenotip üzerinde istenmeyen sonuçları. Bu nedenle, mümkün olan yerlerde, donör ve alıcı çevresinde ilgi gen dizileri hep P1 iletim önce karşılaştırılmalıdır.

Sonuç olarak, P1 iletim oluşturulan ilk knock-out mutasyon sonra suşları sayısı için belirli bir gen knock-out aktarma, hızlı bir yoludur. Teknik sınırlamaları rağmen kolaylık ve hız onun uygulama gene silme işlemini diğer yöntemleri için cazip bir alternatif olun. P1 sadece normalde bu türün kullanımı kısıtlayan E. coli, bozar. Ancak, bazı türevlerini P1 ana bilgisayar geniş ve diğer türler içinde aile Enterobacteriaceaeve hatta bazı γ-proteobacterial diğer türler, enfekte olabilir verimliliği36, , azaltılmış olsa geliştirilmiştir 37. bile iletim klonlanmış E. coli Myxococcus xanthus, δ-proteobacterium için DNA bildirilen38olmuştur. Olarak gelecekteki deneyler, bu çeşitleri alıcı suşlarının antibiyotik kaset tabanlı gen silme genel iletim tarafından kullanılan aralığı genişletmek için vir mutasyon artar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Keio koleksiyonu suşları Ulusal BioResource (Zen, Japonya) projeden elde: E. coli. Dirk Linke (Biosciences bölümü, Oslo Üniversitesi) onun sürekli destek için teşekkür ederiz. Bu eser Norveç genç araştırmacı hibe 249793 (Jack C. Leo) araştırma kurumu tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171, (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179, (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26, (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191, (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9, (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76, (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199, (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14, (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8, (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1, (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46, (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305, (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189, (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189, (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19, (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62, (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. Clifton, NJ. 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194, (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38, (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394, (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291, (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75, (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14, (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38, (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118, (3), 810-814 (1974).
  38. O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155, (1), 317-329 (1983).
<em>Escherichia coli</em> Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter