Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

मानव-iPSC-व्युत्पंन Cardiomyocyte Syncytia के संकुचन तापमान में एक Ca-संवेदी फ्लोरोसेंट डाई-नियंत्रित ३८४-well प्लेट्स के साथ मापा

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58290
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pharmacology and Preclinical Development, Idorsia Pharmaceuticals Ltd

Summary

सहज मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पंन cardiomyocytes के syncytia करार मानव हृदय फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के उपयोगी मॉडल हैं । यहाँ हम धड़कन आवृत्ति पर exogenous यौगिकों के प्रभाव यों तो एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रणाली वर्तमान, एक सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और एक तापमान नियंत्रित इमेजिंग बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग कर.

Abstract

सहज मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC-सेमी) से व्युत्पंन cardiomyocytes के syncytia करार मानव कार्डियक फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान का एक उपयोगी मॉडल हैं । विभिंन तरीकों के लिए इस सहज गतिविधि रिकॉर्ड और नशीली दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने का प्रस्ताव किया गया है, लेकिन इन तरीकों के कई सीमित प्रवाह से ग्रस्त है और/ हम एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रणाली विकसित करने के लिए hiPSC पर exogenous यौगिकों के प्रभाव-मुख्यमंत्री की पिटाई आवृत्ति, एक सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और एक तापमान नियंत्रित इमेजिंग बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग कर । हम कैसे सेल प्लेटें और यौगिक प्लेटें तैयार करने के लिए और कैसे उच्च संवेदनशीलता और reproducibility प्राप्त करने के लिए स्वचालित परख चलाने के लिए वर्णन । हम यह भी वर्णन कैसे प्रतिदीप्ति डेटा को बदलने और विश्लेषण करने के लिए सहज लय पर नशीली दवाओं के प्रभाव के विश्वसनीय उपाय प्रदान करते हैं । इस परख दवा खोज कार्यक्रमों में इस्तेमाल किया जा सकता से दूर रासायनिक अनुकूलन गाइड, या की ओर, मानव हृदय समारोह को प्रभावित यौगिकों ।

Introduction

वर्तमान प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से प्रासंगिक लय में hiPSC के syncytia की सहज धड़कन आवृत्ति पर दवा प्रभाव को मापने के लिए एक विधि को दर्शाया गया है. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं कार्यात्मक cardiomyocytes है कि सहज इन विट्रो1,2,3,4में syncytia धड़कन की स्थापना में अंतर कर सकते हैं । इन hiPSC-सेमी बड़ी संख्या में वाणिज्यिक प्रदाताओं के माध्यम से या प्रयोगशाला में उत्पादन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, और वे कोशिकाओं का एक उपयोगी स्रोत मानव कार्डियक फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के मॉडल उत्पन्न कर रहे हैं. विशेष रूप से, वे भविष्यवाणी करने के लिए या हृदय प्रभाव है कि जब एक दवा मनुष्यों5के लिए प्रशासित किया जाता है हो सकता है की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

hiPSC की धड़कन आवृत्ति-सेमी syncytia microelectrode arrays या1संवेदन प्रतिबाधा का उपयोग शारीरिक स्थितियों के तहत मापा जा सकता है: इन गैर इनवेसिव तकनीक दवा प्रभाव पर बहुत विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन वे कर रहे हैं बल्कि कम प्रवाह और वे यथार्थवादी समय और बजट की कमी के भीतर बड़े यौगिक पुस्तकालयों परीक्षण सक्षम नहीं है । एक अधिक प्रभावी प्रणाली एक ३८४-अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्लेट रीडर और एक Ca-संवेदनशील डाई6का उपयोग कर सविस्तार किया जा सकता है, लेकिन शास्त्रीय प्लेट पाठकों को इष्टतम तापमान नियंत्रण और अधिग्रहण आवृत्ति द्वारा रुकावट हैं । इन सीमाओं को दैहिक धड़कन दर से सचित्र (~ 15 bpm, 35 की तुलना में कर रहे है-55 नियंत्रित वातावरण में bpm1) और गरीब Ca संकेत संकल्प (8 हर्ट्ज की एक अधिग्रहण आवृत्ति के लिए कम सीमा पर है रिकॉर्ड दरों कि तक पहुंच सकते है १२० bpm उत्तेजित शर्तों के अंतर्गत, और यह जानकारी जैसे प्रवणता या अवधि नहीं निकाल सकता) । विधि यहां वर्णित शारीरिक लय में पिटाई पैटर्न की रिकॉर्डिंग को जोड़ती है और पर्याप्त संकल्प पर इन चिंताओं को बाधा ।

सकारात्मक पक्ष पर, इस विधि सरल, विश्वसनीय है, और उच्च प्रवाह, जो उचित मूल्य पर यौगिकों की बड़ी संख्या के तेजी से परीक्षण की अनुमति देता है । नकारात्मक पक्ष पर, इस विधि प्रभावी तापमान नियंत्रण है, जो एक महंगा निवेश है के साथ एक तेज प्लेट रीडर की आवश्यकता है, और यह मनाया दवा प्रभाव है, जो और अधिक विस्तृत के साथ आगे परीक्षण जरूरत सकता है पर थोड़ा यंत्रवत जानकारी प्रदान करता है विधियों.

Approximatively 6 x 106 hiPSC-CM १ ३८४-well सेल प्लेट में एक माप के लिए आवश्यक हैं । hiPSC-सेमी आमतौर पर 1 मिलीलीटर में ~ 4 x 106 कोशिकाओं के जमे हुए aliquots के रूप में वाणिज्यिक आपूर्ति कर रहे हैं । इसलिए, यह तीन जमे हुए aliquots के साथ दो सेल प्लेट तैयार करने के लिए सुविधाजनक है । ज्यादातर मामलों में, इस परख की कम परिवर्तनशीलता के कारण, यह परीक्षण यौगिकों के डुप्लिकेट माप प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है और, प्रत्येक कोशिका थाली में, सकारात्मक नियंत्रण के quadruplicate माप (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१), और 20-नकारात्मक नियंत्रण के plicate माप (अकेले DMSO) । इसलिए, ३५२ यौगिक/एकाग्रता जोड़े की एक अधिकतम २ ३८४-well सेल प्लेट के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । निंन प्रोटोकॉल मानता है कि इस तरह के एक प्रयोग ३५२ परीक्षण यौगिकों, दो सेल प्लेटें, और १२,०००,००० तीन जमे हुए aliquots के रूप में आपूर्ति की कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया; यदि अतिरिक्त डेटा बिंदुओं की आवश्यकता हो तो इसे आसानी से स्केल किया जा सकता है ।

Protocol

1. सेल प्लेट्स की तैयारी

नोट: दवा प्रभाव की माप से पहले सेल प्लेटें 3–4 सप्ताह तैयार करें ।

  1. प्रयोग के दिन 0
    नोट: योजना प्रयोजनों के लिए, परीक्षण यौगिक आवेदन 22 दिनों के बीच किसी भी दिन पर किया जा सकता है-प्रयोग के 28 ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान पर बारी और मध्यम चढ़ाना की ४० मिलीलीटर गर्म (के रूप में निर्माता द्वारा आपूर्ति की) ।
      नोट: उनके आपूर्तिकर्ता-प्रदत्त मिलान संस्कृति और रखरखाव मीडिया के साथ कोशिकाओं का उपयोग करें ।
    2. 2 मिनट के लिए पानी में स्नान में जमे हुए कोशिकाओं से युक्त cryotubes रखकर hiPSC-सेमी गल ।
    3. 1 एमएल सेल सस्पेंशन को सावधानी से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब स्थानांतरण ।
    4. बचे हुए कक्षों को पुनः प्राप्त करने के लिए प्रत्येक cryotube को 1 मिलीलीटर गर्म चढ़ाना मध्यम से धोएं और एक ही शंकु ट्यूब से चरण 1.1.3 युक्त कोशिकाओं से धो मीडिया जोड़ें ।
    5. सेल सस्पेंशन में ध्यान से गर्म चढ़ाना मध्यम से एक और 8 मिलीलीटर मिलाएं ।
    6. trypan नीले बहिष्करण विधि और एक hematocytometer8का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं की गणना.
      नोट: १ ३८४ के लिए 6 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता-अच्छी तरह से सेल प्लेट स्थिर कोशिकाओं के बीच 20% मृत कोशिकाओं तक की संभावना पर विचार करता है, जो हमारे अनुभव में एक अधिकतम है ।
    7. गर्म चढ़ाना माध्यम के साथ 5 एक्स 105 जीवित कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल निलंबन को समायोजित करें ।
    8. सेल सस्पेंशन को २ ३८४-वेल सेल प्लेट्स में एक अच्छी तरह से 25 µ l को जोड़कर (प्रति अच्छी तरह से लगभग १२,५०० सेल) में बांटें ।
      नोट: सेल प्लेटों के लिए किसी भी मैट्रिक्स के साथ कोट की जरूरत नहीं है ( चर्चादेखें) ।
    9. 5% CO2युक्त humidified वातावरण में ३७ ° c पर सेल प्लेट्स को बनाए रखें ।
  2. प्रयोग के दिन 1
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान पर बारी और रखरखाव मध्यम 1% v/v पेनिसिलिन-streptomycin समाधान के साथ पूरक के गर्म ५० मिलीलीटर ।
    2. सेल प्लेट के प्रत्येक कुआं में गर्म रखरखाव माध्यम के ५० µ एल के साथ चढ़ाना माध्यम बदलें ।
  3. दिन 2-21 (27 दिन तक) प्रयोग के
    नोट: hiPSC-सीएमएस इस अवधि में किसी भी passaging की जरूरत नहीं है, के रूप में वे गैर कोशिकाओं विभाजित कर रहे हैं ।
    1. रखरखाव के माध्यम से आधा नवीनीकृत हर 2-3 दिन और 7, 14, और 21 दिनों पर यह पूरी तरह से नवीनीकृत ।
      नोट: प्रतिदीप्ति माप 22 और 28 प्रयोग के दिनों के बीच किया जा सकता है । लंबी अवधि की कोशिश की है लेकिन अभी भी ठीक हो सकता है नहीं किया गया है ।

2. साधन, यौगिक प्लेटें, और परख प्लेट की तैयारी

नोट: दवा प्रभाव की माप के दिन पर साधन, यौगिक प्लेटें, और परख प्लेटें, 22 दिनों और प्रयोग के 28 के बीच तैयार. एक फ्लोरोसेंट प्लेट तापमान नियंत्रण और एक उचित प्रतिदीप्ति फ़िल्टर किट और उत्तेजना प्रकाश स्रोत से सुसज्जित पाठक का प्रयोग करें । उदाहरण के लिए, एक Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 प्रतिदीप्ति फ़िल्टर किट (उत्तेजना: ४७२ एनएम; उत्सर्जन: ५२०-५६० एनएम) और १५० W उत्तेजना लाइट स्रोत इकाई का उपयोग करें ।

  1. पहले सेल प्लेट के लिए माप के लिए प्लेट रीडर के अंदर रखा जा करने के लिए, पाठक पर बारी और ३७ डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग सिस्टम सेट करने से पहले कम से 2 ज ।
    नोट: यह भी पहले शाम किया जा सकता है ।
  2. सकारात्मक नियंत्रण, forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१ DMSO में ०.३३ मिमी के शेयर समाधान के रूप में, DMSO में 10 मिमी, और H2O में ३.३३ मिमी, क्रमशः तैयार करते हैं ।
    नोट: स्टॉक समाधान ३३३ पतला हो जाएगा-समय वे कोशिकाओं को जोड़ रहे है द्वारा गुना, और उद्देश्य के लिए 1 µ एम forskolin, 30 µ एम N6-cyclopentyl-adenosine, और 10 µ एम ई-४०३१, जो विश्वसनीय और reproducible प्रभाव का उत्पादन के अंतिम परीक्षण सांद्रता प्राप्त है ।
  3. ३३३ पर DMSO स्टॉक समाधान के रूप में ३५२ परीक्षण यौगिकों तैयार-योजना बनाई परीक्षण सांद्रता गुना (उदा., 30 µ मीटर में एक परीक्षण के लिए 10 मिमी) ।
    नोट: उद्देश्य यौगिक आवेदन के बाद सेल प्लेट में ०.३% (वी/वी) DMSO की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए है; यह उच्चतम DMSO एकाग्रता है जो cardiomyocytes की लयबद्ध गतिविधि को प्रभावित नहीं करती है । शेयर का समाधान भी पहले दिन तैयार किया जा सकता है । स्टॉक समाधान के 5 µ एल की एक ंयूनतम प्रत्येक डुप्लिकेट माप के लिए आवश्यक है ।
  4. यौगिक प्लेटें तैयार करें ।
    1. कमरे के तापमान के लिए 1% v/v पेनिसिलिन-streptomycin समाधान के साथ रखरखाव मध्यम गर्म ४० मिलीलीटर ।
    2. अच्छी तरह से प्रति शेयर समाधान के १.५ µ एल जोड़कर २ ३८४-अच्छी तरह से यौगिक प्लेट्स में वितरित: i) परीक्षण यौगिकों (दो कुओं प्रत्येक), द्वितीय) सकारात्मक नियंत्रण (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१, चार कुओं प्रति यौगिक प्लेट), और iii) नकारात्मक नियंत्रण (DMSO, यौगिक प्लेट प्रति 20 कुओं) ।
    3. 1 मिनट के लिए १०० x g पर यौगिक प्लेटें केंद्रापसारक ।
    4. एक अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर रखरखाव मध्यम के ३७ µ एल जोड़ें (३८.५ µ एल में ३.९% DMSO उस चरण में) ।
    5. 1 मिनट के लिए १०० x g पर यौगिक प्लेटें केंद्रापसारक ।
    6. प्लेट रीडर में यौगिक प्लेटें लोड ।
      नोट: अगले चरणों यौगिक प्लेटों में वाष्पीकरण को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  5. फ्लोरोसेंट डाई तैयार करें ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान पर बारी और रखरखाव मध्यम 1% v/v पेनिसिलिन-streptomycin समाधान के साथ पूरक के गर्म १०० मिलीलीटर ।
    2. सीए संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ गर्म रखरखाव माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ शमन का पुनर्गठन ।
      नोट: यह स्टॉक प्रतिदीप्ति मध्यम Ca-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई, आमतौर पर Fluo-4, और एक शमन होता है, और किसी भी बचे हुए 4 ° c में कम से 5 दिनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

3. डाटा अधिग्रहण

नोट: दवा प्रभाव की माप के दिन पर डेटा अधिग्रहण करते हैं । चरण ३.१-.10 पूरी तरह से पहले सेल प्लेट के लिए प्रदर्शन, तो उंहें दूसरे सेल प्लेट के लिए दोहराएं ।

  1. प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर (यदि आवश्यक हो) शुरू और प्लास्टिक सुझावों लोड ।
  2. एक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए आधारभूत धड़कन दर को परिभाषित करने के लिए एक अधिग्रहण की आवृत्ति के साथ कैल्शियम तरंगों के एक 2 मिनट के खंड को रिकॉर्ड करने के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स को समायोजित करें ।
  3. एक सेल प्लेट के लिए, प्रतिदीप्ति माध्यम बनाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ गर्म रखरखाव माध्यम के 12 मिलीलीटर में शेयर प्रतिदीप्ति मध्यम के 3 मिलीलीटर पतला ।
  4. प्रतिदीप्ति माध्यम के 30 µ l के साथ सेल प्लेट के प्रत्येक कुआं में मीडियम की 20 µ l को बदलें ।
  5. मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे 1x पिपेट ।
  6. hiPSC-सेमी acclimatize को तापमान पर जाने के लिए जितनी जल्दी हो सके प्लेट रीडर में सेल प्लेट लगाएं ।
  7. डेटा प्राप्ति शुरू करने से पहले ६० मिनट के लिए प्रतीक्षा करें ।
  8. प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर में डेटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए एक अधिग्रहण की आवृत्ति के साथ Ca तरंगों के एक 2 मिनट के खंड रिकॉर्ड करने के लिए ंयूनतम 10 हर्ट्ज, एक अच्छी तरह के लिए आधारभूत धड़कन दर को परिभाषित करने के लिए ।
    नोट: प्रत्येक रिकॉर्डिंग अनुक्रम के लिए, सुनिश्चित करें कि डेटा प्राप्ति के बाद कक्ष प्लेट स्वचालित रूप से डिवाइस से बाहर स्थानांतरित नहीं है । यह कक्ष के तापमान पर ठंडा होने से सेल प्लेट को रोकता है । प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर के कुछ संस्करणों के साथ, यह इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से समाप्त होने से पहले प्रत्येक रिकॉर्डिंग को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  9. प्लेट रीडर रोबोट के साथ परीक्षण और संदर्भ यौगिकों जोड़ें pipetting अच्छी तरह से-अच्छी तरह से 5 µ एल यौगिक प्लेट से सेल प्लेट में (इसके बाद, DMSO एकाग्रता ०.३% है [v/
  10. प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर में डेटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए सीए तरंगों के 2 मिनट के बारे में 5, 15, 30, ४५, और ६० मिनट के बाद शुरू यौगिक अतिरिक्त (सुनिश्चित करें कि हर बार है कि सेल प्लेट डिवाइस में रहता है) को रिकॉर्ड करने के लिए ।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण माप के बाद किसी भी समय किया जा सकता है ।

  1. ASCII पाठ फ़ाइलों के रूप में प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर से प्रत्येक रिकॉर्डिंग अवधि के लिए रॉ डेटा निर्यात करें ।
  2. डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में अपुष्ट डेटा आयात करें ।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से और सभी समय अंक के लिए, प्राथमिक पिटाई आवृत्ति निकालने.
    नोट: सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ, धड़कन आवृत्तियों एक कस्टम विश्लेषण दिनचर्या LombPeriodogram समारोह का उपयोग कर के साथ गणना की जा सकती है, Lomb के आधार पर – कम से Scargle विधि वर्णक्रमीय विश्लेषण7 . periodogram ०.०१ और 5 हर्ट्ज के बीच आवृत्तियों की एक सीमा के लिए गणना की जानी चाहिए. प्राथमिक आवृत्ति PeakAutoFind दिनचर्या का उपयोग कर periodogram से निकाला जा सकता है । यह विश्लेषण विधि प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर के साथ एक विकल्प के रूप में आपूर्ति की विधि से पिटाई आवृत्तियों की अधिक सटीक माप प्रदान करता है । हालांकि, बाद अभी भी अगर सॉफ्टवेयर अनुकूलन एक विकल्प नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. प्रत्येक रिकॉर्डिंग अवधि के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से क्लिपबोर्ड प्रतियों के रूप में या ASCII पाठ फ़ाइलों के रूप में प्राथमिक धड़कन आवृत्तियों निर्यात करें ।
  5. चिपकाने या पाठ फ़ाइल आयात क्लिपबोर्ड द्वारा एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में प्राथमिक पिटाई आवृत्तियों आयात करें ।
    नोट: चरण ४.५–४.९ किसी भी आधुनिक स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में किया जा सकता है ।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, बुनियादी लाइन के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर धड़कन आवृत्ति दवा आवेदन के बाद सामान्य (5, 15, 30, ४५, और ६० मिनट) आधारभूत पर प्राथमिक धड़कन आवृत्ति द्वारा उस समय बिंदु पर प्राथमिक पिटाई आवृत्ति विभाजित करके.
  7. दवा आवेदन के बाद हर समय बिंदु पर मतलब DMSO प्रभाव की गणना (5, 15, 30, ४५, और ६० मिनट) 20 कुओं जहां DMSO लागू किया गया था के लिए सामान्यीकृत मूल्यों औसत से.
  8. प्रत्येक अच्छी तरह से और दवा आवेदन के बाद हर समय बिंदु के लिए (5, 15, 30, ४५, और ६० मिनट), एक ही थाली के लिए मतलब DMSO प्रभाव (समय मिलान) घटाना.
  9. डुप्लिकेट माप औसत ।
    नोट: यदि कोई यौगिक परिवर्तन आवृत्ति या सॉफ़्टवेयर प्राथमिक आवृत्ति यौगिक अतिरिक्त के बाद नहीं ढूँढ सकता, तो एक दृश्य परीक्षा की धड़कन प्रतिमान यौगिक उत्पादित अतालता का मूल्यांकन कर सकते हैं कि ।

Representative Results

चित्रा 1 १ ३८४-अच्छी तरह से थाली में आधारभूत पर सीए तरंगों के एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग से पता चलता है । ज्यादातर मामलों में, सभी कुओं थाली भर में थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ एक नियमित रूप से धड़कन दर पता चलता है (मतलब ± एसडी = ४०.१ ± ३.५ बीपीएम; रेंज = 34 – 54 बीपीएम). बहुत समय से (10 प्रयोगों में से कम 1 से), कुछ कुओं (5 से कम) अतालता या लय के अभाव है । ३ ३८४ में अच्छी तरह से प्लेटें, हम भी एक और आपूर्तिकर्ता से cardiomyocytes की कोशिश की है ( सामग्री की तालिकादेखें) और सहज धड़कन के लिए बहुत ही आधारभूत मूल्यों प्राप्त की ।

हृदय आयन चैनलों के ब्लॉकर्स एक reproducible तरीके से5में cardiomyocytes की लय को प्रभावित करते हैं । Amlodipine, धीमी गति से सीए चैनल9के एक अवरोधक, लय में १००% से अधिक एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से तेज 1 µ m (चित्रा 2a) । प्रभाव अच्छी तरह से पहले 5 मिनट के भीतर विकसित की है, लेकिन यह अभी भी बढ़ जाती है approximatively ५०% अगले 30 मिनट के भीतर इससे पहले कि स्थिर । 1 µ मीटर से ऊपर, amlodipine गिरफ्तारी (धराशायी लाइनें), के रूप में तथ्य यह है कि सीए सायक्लिंग सहज संकुचन के लिए महत्वपूर्ण है से उंमीद की जा सकती है । अन्य चुनिंदा dihydropyridine सीए चैनल ब्लॉकर्स बहुत इसी तरह के प्रभाव का उत्पादन ।

ई-४०३१, तेजी से देरी दिष्टकारी कश्मीर10चैनलों के एक अवरोधक, decelerates के बारे में लय ६५-७०% एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से 10 µ एम (चित्रा बी8) के लिए । प्रभाव पहले 5 मिनट के भीतर विकसित करता है और यह अगले ६० मिनट के भीतर भिंन नहीं है । अंय चुनिंदा यकृ ब्लॉकर्स इसी तरह के प्रभाव का उत्पादन, हालांकि दर में अधिक से अधिक कमी (जैसे, ३५-४०% cisapride के लिए, ई के लिए ७०%-४०३१, और ९०%-९५% dofetilide के लिए भिंन हो सकते हैं) । इस असमानता का आधार ज्ञात नहीं है ।

Tetrodotoxin, तेजी से ना चैनलों के एक अवरोधक11, decelerates एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके में 15% के बारे में लय, अप करने के लिए 1–30 µ m (चित्रा 2c). प्रभाव अच्छी तरह से पहले 5 मिनट के भीतर विकसित की है और यह अगले ६० मिनट के भीतर ज्यादा भिंनता नहीं है । हालांकि, 30 µ मीटर से ऊपर, tetrodotoxin पहले 5 मिनट के भीतर पिटाई की गिरफ्तारी, जबकि 30 मिनट के बाद, यह 1 µ मीटर से ऊपर गिरफ्तार । ऐसे lidocaine या mexiletine के रूप में अंय एनए चैनल ब्लॉकर्स, समान सभी या कुछ प्रभाव का उत्पादन ।

Bepridil, कार्डियक एनए, Ca के एक मिश्रित अवरोधक, और कश्मीर चैनल9, यह भी एक सब या कुछ नहीं प्रभाव (चित्रा 2d) पैदा करता है । यह पता चलता है कि इस तैयारी में, एनए चैनलों के एक ब्लॉक bepridil की प्राथमिक कार्रवाई की है । सीए चैनल ब्लॉक के कारण एक त्वरण नहीं देखा जाता है, और यकृ ब्लॉक के कारण अधिक प्रगतिशील धीमा न चैनल प्रभाव से नकाबपोश प्रतीत होता है.

Figure 1
चित्रा 1: एक ३८४-अच्छी तरह से थाली भर प्रतिनिधि आधारभूत Ca तरंगों । (क) थाली भर में सभी कुओं थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ एक नियमित रूप से धड़कन दर का प्रदर्शन । इस छवि को प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर से सीधे कब्जा कर लिया है । प्रत्येक ट्रेस अवधि में 10 एस है । प्रतिदीप्ति तीव्रता मनमाना है (सापेक्ष प्रकाश इकाइयों वीडियो कैमरा greyscale से व्युत्पंन) । (B) १ १० s ट्रेस का यह झटका सिग्नल के कम शोर से पता चलता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कार्डियक आयन चैनल ब्लॉकर्स के प्रतिनिधि प्रभाव. इन पैनलों दिखाने एकाग्रता-प्रतिक्रिया के साथ घटता (क) चुनिंदा सीए चैनल अवरोधक amlodipine, (ख) चयनात्मक यकृ अवरोधक ई-४०३१, (ग) चयनात्मक ना चैनल अवरोधक TTX, और (घ) गैर चयनात्मक चैनल अवरोधक bepridil । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

दो पहलुओं की धड़कन आवृत्तियों की सफल रिकॉर्डिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण हैं. पहले सेल चढ़ाना और संस्कृति के साथ सावधानी बरतें । विशेष रूप से, यह प्रयास करने के लिए और माध्यम का आदान प्रदान जब कुओं के तल पर सेल परत scratching से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यह पिपेट के साथ कुओं के नीचे छूने के लिए स्वीकार्य है, लेकिन एक ही कोण हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जिससे सेल परत में केवल एक छोटे खरोंच उत्पादन और परख प्रदर्शन को प्रभावित नहीं । reproducible सजातीय लय प्राप्त करने का दूसरा महत्वपूर्ण पहलू माप की अवधि के लिए सेल प्लेट भर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर अच्छा तापमान नियंत्रण प्रदान करने के लिए है । हम इस एकरूपता थाली पाठक के अलावा अंय उपकरणों का उपयोग कर प्राप्त नहीं कर सकता यहां इस्तेमाल किया, लेकिन यह तापमान विनियमन के लिए विशेष संशोधनों के साथ संभव हो सकता है: यह प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया जाएगा और अधिक मोटे तौर पर थाली का एक ब्रांड से परे प्रयोग करने योग्य रीडर. यहाँ प्रयुक्त डिवाइस के साथ प्रयोग की अवधि के लिए तापमान स्थिरता प्राप्त करने के लिए, यह एक रिकॉर्डिंग समाप्त होने से पहले बंद करने के लिए आवश्यक था; अंयथा, रोबोट मापा सेल प्लेट बेदखल होगा । इस तकनीकी मुद्दे प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर के अगले रिलीज के साथ गायब हो सकता है, लेकिन यह अब के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है । यदि एक सेल प्लेट गलती से प्लेट रीडर के बाहर स्थानांतरित कर दिया है, यह वापस के रूप में संभव के रूप में तेजी से अंदर लोड किया जाना चाहिए । फिर भी, प्रयोग की गुणवत्ता खराब हो जाएगी, क्योंकि तापमान परिवर्तन धड़कन दर को बेहद तेजी से प्रभावित करते हैं ।

कुछ अंय पहलुओं, जो अच्छी तरह से परीक्षण नहीं किया गया है, कम महत्वपूर्ण हो सकता है । उदाहरण के लिए, hiPSC-मुख्यमंत्री निर्माताओं की कोशिकाओं को बोने से पहले कोटिंग सेल संस्कृति प्लेट की सिफारिश, लेकिन इस विशिष्ट परख में, कोटिंग इस्तेमाल नहीं किया गया था, क्योंकि कोशिकाओं विभिन्न सतहों पर काफी आसानी से पालन, और यह ठीक से बहुत मुश्किल है कोट ३८४-अच्छी तरह से प्लेटें. अभी तक, सेल प्लेट कोटिंग अभी भी स्वीकार्य हो सकता है, या यह भी परख गुणवत्ता में सुधार हो सकता है । हम यह भी परीक्षण किया कि सॉल्वैंट्स DMSO के अलावा अंय स्वीकार्य होगा कभी नहीं, लेकिन यह अंय रिकॉर्डिंग प्रौद्योगिकियों कि ेतोः या MeOH के समान सांद्रता भी संतोषजनक होगा के साथ अनुभव से उंमीद है । हम आम तौर पर एक ही निर्माता से hiPSC सीएमएस का उपयोग करें, और केवल एक अतिरिक्त आपूर्तिकर्ता से कोशिकाओं का परीक्षण किया गया, जो एक समान तरीके से काम दिखाई दिया । इसी तरह, हम hiPSC-सीएमएस के विभिंन बैचों की केवल एक छोटी संख्या का इस्तेमाल किया है कि उंहें जांच करने के लिए सत्यापित करें कि वे प्रारंभिक बैच के समान व्यवहार से चुना गया । एक या दो बैचों को अनुपयुक्त समझा गया क्योंकि उनके syncytia ने यहाँ प्रयुक्त संस्कृति स्थितियों के अंतर्गत खराब स्थिरता या reproducibility की थी. अंयथा, औषध विज्ञान "ठेठ" यौगिकों (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosine, और ई-४०३१, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से endothelin, isoproterenol, amlodipine, और ponesimod) के एक सीमित पैनल परीक्षण जब बैचों भर में बहुत समान दिखाई दिया । हम केवल hiPSC-मुख्यमंत्री स्वस्थ दाताओं से व्युत्पंन का इस्तेमाल किया । यह आकलन करने के लिए सार्थक हो सकता है कि hiPSC-मुख्यमंत्री हृदय रोग के साथ रोगियों से व्युत्पंन अलग परिणाम प्रदान करेगा, हालांकि स्वस्थ दाताओं और रोगियों के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया था जब tyrosine कळेनासे अवरोधकों के cardiotoxicity का मूल्यांकन 12. अंत में, हम आम तौर पर 22 इंतजार-संस्कृति में 28 दिनों के लिए दवा प्रभाव को मापने से पहले: एक ही कोशिकाओं के प्रतिबाधा रिकॉर्डिंग के साथ हमारे अनुभव में, धीमी गति से प्रतिबाधा के लिए एक स्थिर राज्य (कोशिका परत स्थिरता का एक संकेतक) और तेजी से प्रतिबाधा (एक संकेतक की धड़कन आवृत्ति) संस्कृति में 12-15 दिनों के बाद पहुंच जाता है । हालांकि, हम 22 प्रतीक्षा करने का फैसला किया-28 दिन, क्योंकि यह समय है जब कार्डियक चैनल और परिपक्वता मार्करों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल13स्थिर है । यह जांच नहीं की गई कि क्या तुलनीय परिणाम प्राप्त किए जाएंगे यदि कक्षों का पहले या बाद में उपयोग किया गया था ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर संभावित दवा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए hiPSC के सहज पिटाई की दर का एक बहुत ही सरल माप का उपयोग करता है । इसके अंय तरीकों से अधिक मुख्य लाभ कर रहे है कि मैं) यह एक उच्च प्रवाह जांच पर्यावरण के लिए उत्तरदाई है, द्वितीय) यह cardiomyocytes की गतिविधि और शारीरिक तापमान पर दवाओं के प्रभाव, और iii) रिकॉर्ड यह आवश्यकता नहीं है निष्पादन के लिए या परिणामों के आकलन के लिए विशेषज्ञता electrophysiological ।

एक मांयता कई मानव उपयोग के लिए अनुमोदित दवाओं के साथ प्रदर्शन का अध्ययन में, हमने दिखाया है कि परख मानव चिकित्सा में इस्तेमाल के रूप में मौजूदा नैदानिक डेटा5द्वारा भविष्यवाणी की दवाओं के प्रति प्रतिक्रिया करता है । क्योंकि यह विधि हृदय ताल पर सभी संभावित प्रभाव समझता है, यह इन विट्रो Proarrhythmic परख (सिपा) पहल14 कि विशेष रूप से प्रो-arrhythmic क्षमता का आकलन में व्यापक पूरक ।

भविष्य में, इस विधि को सहज पिटाई की दर को प्रभावित दिखाया दवाओं की विधा की कार्रवाई की एक और समझ प्रदान कर सकता है । यह संभावना है कि अतिरिक्त यंत्रवत जानकारी सीए यात्रियों (जैसे, उनके आयाम या आकार में) की प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग में मौजूद है । प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग उच्च अधिग्रहण दर (जैसे, 30 हर्ट्ज) पर प्रदर्शन कर रहे हैं, तो इन मापदंडों की धड़कन दर के अलावा आसानी से निकाले जाते हैं, और यह ज्ञात प्रभाव के साथ इन मापदंडों में परिवर्तन सहसंबंधी करने के लिए दिलचस्प हो सकता है चिकित्सकीय इस्तेमाल किया दवाओं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों की कोई पावती नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FDSS7000 fluorescent plate reader Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 not a catalog item
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 installed initially
in the device
FDSS7000 temperature control Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 A10118-09
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 C11653-11
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 A8687-62
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 U8524-12 optional alternative to the Igor Pro software
Igor Pro data analysis software Wavemetrics
(Portland, Oregon, USA)		 Latest version
iCell-Cardiomyocytes Kit Cellular Dynamics International (Madison, WI) R1106 includes cells, plating and maintenance media
Cor.4U Cardiomyocyte Kit Ncardia Germany
(Cologne, Germany)		 Ax-B-HC02-4M includes cells, plating and maintenance media
alternative to the iCell-Cardiomyocytes
384-well cell culture plates Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) 781091
384-well compound plates Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) 781280
FLIPR Calcium 4 Assay Kit Molecular Devices
(Sunnyvale, California)		 R8142
Forskolin Sigma-Aldrich
(Buchs, Switzerland)		 F6886
N6-cyclopentyl-adenosine Sigma-Aldrich
(Buchs, Switzerland)		 C8031
E-4031 Enzo Life Sciences
(Lausen, Switzerland)		 BML-KC158
Penicillin-Streptomycin solution Gibco/ThermoFisher
(Reinach, Switzerland)		 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco/ThermoFisher
(Reinach, Switzerland)		 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, L. Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).
  2. Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes. Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).
  3. Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).
  4. Ma, J. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
  5. Sube, R., Ertel, E. A. Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs. Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).
  6. Sirenko, O. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells. Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).
  7. VanderPlas, J. T. Understanding the Lomb-Scargle Periodogram. Cornell Univeristy Library. , arXiv:1703.09824 (2017).
  8. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3 B 1-3 (2015).
  9. Ertel, E. A., Godfraind, T. Calcium channel blockers and calcium channels. Calcium Channel Blockers. Godfraind, T. , Springer. Basel, Switzerland. 11-80 (2004).
  10. Sanguinetti, M. C. Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs. Hypertension. 19, 228-236 (1992).
  11. Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels. Marine Drugs. 15 (10), (2017).
  12. Sharma, A. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  13. Puppala, D. Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue. Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).
  14. CIPA. , Available from: http://cipaproject.org (2016).

Tags

चिकित्सा अंक १४० cardiomyocytes ताल आईपीएस सेल phenotypic स्क्रीनिंग औषध विज्ञान सुरक्षा औषध विज्ञान
मानव-iPSC-व्युत्पंन Cardiomyocyte Syncytia के संकुचन तापमान में एक Ca-संवेदी फ्लोरोसेंट डाई-नियंत्रित ३८४-well प्लेट्स के साथ मापा
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Forny, C., Sube, R., Ertel, E. A.… More

Forny, C., Sube, R., Ertel, E. A. Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates. J. Vis. Exp. (140), e58290, doi:10.3791/58290 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter