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Immunology and Infection

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Summary

Aquí, presentamos un protocolo de tuberculosis humana modelo en un pez cebra adulto utilizando su patógeno natural marinum de la micobacteria. Extraen ADN y ARN de los órganos internos del pez cebra infectado pueden utilizarse para revelar que el total de micobacterias cargas en los peces y la respuesta inmune del hospedador con qPCR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis es actualmente el patógeno humano más mortal causando infecciones 10,4 millones y 1,7 millones de muertes cada año. La exposición a esta bacteria causa un espectro amplio de enfermedad en los seres humanos que van desde una infección esterilizada a una mortal enfermedad activa progresiva. La forma más común es la tuberculosis latente, que es asintomática, pero tiene el potencial de reactivar en una enfermedad fulminante. Pez cebra adulto y su patógeno natural marinum de la micobacteria han demostrado recientemente para ser un modelo aplicable para estudiar el espectro amplio de enfermedad de la tuberculosis. Lo importante, se puede estudiar espontánea latencia y reactivación así como respuestas inmune adaptativas en el contexto de infección por micobacterias en este modelo. En este artículo, se describen métodos para la infección experimental del pez cebra adulto, la colección de órganos internos para la extracción de ácidos nucleicos para la medición de cargas de micobacterias y anfitrión inmunorespuestas por PCR cuantitativa. El en desarrollada internamente, M. marinum -ensayo qPCR específica es más sensible que los métodos tradicionales de la galjanoplastia como también detecta DNA de micobacterias no se dividen, latentes o recientemente muertas. Como ADN y ARN extraídos de la misma persona, es posible estudiar las relaciones entre el estado enfermo y la expresión de genes huésped y patógeno. El modelo de pez cebra adulto para la tuberculosis se presenta así como un sistema altamente aplicable, no mamíferos en vivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno.

Introduction

Pez cebra (Danio rerio) es un modelo animal ampliamente utilizado en la investigación biomédica y es un modelo aceptado para la biología de vertebrados comun. El pez cebra se ha adaptado a muchos campos de investigación modelado de enfermedades humanas y trastornos que van desde cáncer1 y2 de la enfermedad cardiaca infección y estudios inmunológicos de varias bacterias 3 y las infecciones virales4 , 5. Además, el desarrollo de ex útero de embriones de pez cebra ha hecho el pez cebra un modelo popular en Biología del desarrollo6 y toxicología7,8.

En muchos campos de investigación, incluida la biología de la infección, se utilizan las larvas de pez cebra ópticamente transparente. Las primeras células inmunes aparecen dentro de fertilización post de 24 h (hpf), cuando los macrófagos primitivos son detectado9. Neutrófilos son las células inmunes próximo a aparecer alrededor 33 hpf10. Larvas de pez cebra son factibles para el estudio de las primeras etapas de la infección y el papel de la inmunidad innata en la ausencia de las células inmunes adaptantes11. Sin embargo, el pez cebra adulto con su sistema inmune adaptante completamente funcional proporciona una capa adicional de complejidad para los experimentos de infección. Las células T pueden detectarse alrededor de 3 días post fecundación12, y B las células son capaces de producir anticuerpos funcionales por 4 semanas post fecundación13. El pez cebra adulto cuenta con las principales contrapartes de los mamíferos inmunitarias innata y adaptativa. Las principales diferencias entre la immune systems de los peces y los seres humanos se encuentran en isotipos de anticuerpos, así como en la anatomía de los tejidos linfoides. El pez cebra tiene sólo tres anticuerpos clases14, mientras que los seres humanos tienen cinco15. En la ausencia de médula ósea y ganglios linfáticos, los órganos linfoides primarios en los peces son el riñón y el16 del timo y el bazo, el riñón y el intestino sirven como órganos linfoides secundarios17. A pesar de estas diferencias, con su arsenal completo inmune de células innatas y adaptativas, el pez cebra adulto es un modelo altamente aplicable, fácil de usar, no mamíferos para estudios de la interacción huésped-patógeno.

El pez cebra se ha establecido últimamente como un posible modelo para estudiar la tuberculosis18,19,20,21,22. La tuberculosis es una enfermedad aerotransportada causada por Mycobacterium tuberculosis. Según la Organización Mundial de la salud, la tuberculosis causó1,7 millones de muertes en 2016 y es la principal causa de muerte por un solo patógeno en todo el mundo23. Ratones de24,25, conejos26 y27 de primates no humanos son que los animales más conocidos modelos de investigación de tuberculosis sino cada cara sus limitaciones. El modelo de primates no humanos de infección por M. tuberculosis se asemeja a la enfermedad humana más cerca, pero con este modelo es limitado debido a serias consideraciones éticas. Otros modelos animales se ven obstaculizados por la especificidad del hospedador de M. tuberculosis que afecta a la patología de la enfermedad. El amplio espectro de infección y enfermedad los resultados en la enfermedad humana es probablemente el mayor problema en modelado de tuberculosis: la tuberculosis es una enfermedad muy heterogénea desde esterilización inmunidad a la infección latente, activa y reactivar28 , que puede ser difícil de reproducir y modelo experimental.

Mycobacterium marinum es un pariente cercano de M. tuberculosis con proteínas orthologous ~ 3.000 con el 85% del aminoácido identidad29. M. marinum naturalmente infecta peces cebra produce granulomas, los sellos de la tuberculosis, en sus órganos internos19,30. A diferencia de otros modelos animales utilizados en la investigación de la tuberculosis, pez cebra produce muchos descendientes, que requiere sólo un espacio limitado y lo importante, es el modelo de tuberculosis vertebrados menos desarrollado disponible neurophysiologically. Además, la infección de M. marinum provoca una infección latente, enfermedad activa o incluso la esterilización de la infección micobacteriológica en pez cebra adulto mímico de cerca el espectro de los resultados de la enfermedad de tuberculosis humana19, 31 , 32. aquí, se describen métodos para el modelo de tuberculosis experimental del pez cebra adulto por M. marinum de inyección en la cavidad abdominal y mediante PCR cuantitativa para medir las cargas de micobacterias y respuesta inmune del pez cebra muestras de tejido.

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Protocol

Pez cebra todos los experimentos han sido aprobados por la Junta de experimento Animal en Finlandia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos se realizan según la ley (497/2013) y el decreto del gobierno (564/2013) sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos o educativos en Finlandia.

1. cultivo de Micobacterium marinum

Nota: Desde marinum de la micobacteria es un patógeno capaz de causar infecciones superficiales en los seres humanos, encontrar las orientaciones locales para la seguridad personal y la eliminación de residuos de riesgo biológico antes de comenzar a trabajar con esta bacteria.

  1. M. marinum en un 7 H 10 de la cultura placa suplementado con 10% OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa) enriquecimiento y 0.5% v/v del glicerol a 29 ° C durante al menos 5 días. Mantener culturas de M. marinum bacterias frescas del congelador cada dos semanas y transferir en un plato nuevo cada dos semanas.
    Nota: M. marinum es un patógeno de peces natural infectando a las especies acuáticas y es importante tomar precauciones para no contaminar las poblaciones de pez cebra con las bacterias. Pez cebra infectado y objetos contaminados con las bacterias tienen que mantenerse separados de las instalaciones de cría.
  2. Utilizar un asa de inoculación de 1 μl estériles asépticamente transferir un asa llena de masa bacteriana M. marinum en un frasco de cultivo celular que contenga 10 mL de 7 H 9 medio enriquecimiento ADC (dextrosa, albúmina, catalasa) de 10%, 0.2% v/v polisorbato 80 y 0.2% v/v de glicerol. Cultura de 3 a 4 días aproximadamente un OD600 (densidad óptica) de 0,7 a 29 ° C en la oscuridad sin agitación. Dejar la tapa suelta, o use una tapa de filtro, para permitir el suficiente intercambio de gases.
    Nota: Polisorbato 80 se agrega al medio para evitar la agregación de las bacterias. Además, la exposición a la luz conduce a cambios fenotípicos en colonias bacterianas (p. ej., el color cambia de blanco a amarillo). Para evitar esto, mantenga los cultivos en la oscuridad.
  3. Medir el valor de OD600con un espectrofotómetro. Diluir el cultivo líquido a un OD600 de 0.07-0.09 y continuar el cultivo durante 2 días a 29 ° C en la oscuridad, sin agitación. Dejar la tapa suelta.
    Nota: Durante estos dos días, la suspensión bacteriana llega a un OD600de aproximadamente 0.5 corresponde a una registro de la fase inicial.

2. preparación de la solución bacteriana para infectar pez cebra adulto

  1. Transferir la suspensión bacteriana en una gran cubeta estéril o en un tubo de 15 mL y colóquelo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos permitir que los grupos más grandes a resolver.
  2. Transferir la superior 5 – 7 mL de la suspensión a un tubo limpio o una cubeta y medir la OD600. Uso esta fase superior de la suspensión para las infecciones.
  3. Recoger 1 mL de cultivo de M. marinum en un fresco tubo y centrifugar durante 3 min a 10.000 x g. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de PBS estéril 1 x.
  4. Diluir hasta alcanzar la deseada concentración bacteriana utilizando estéril 1 x PBS con rojo de fenol 0,3 mg/mL como marcador. La suspensión diluida se dividen en tres alícuotas.
    Nota: Utilice un predeterminado OD600 vs UFC (unidades formadoras de colonias) / curva μL para estimar la dilución necesaria para obtener el número deseado de bacterias en la inyección de 5 μl volumen34. La correlación entre la concentración de la suspensión bacteriana y OD600 debe ser validado antes de iniciar los experimentos de infección real. Reserva dos semanas para recoger estos datos de validación.
  5. Utilizando una jeringa de 1 mL, lentamente tire la suspensión a través de 27 G aguja x 3. Para cada alícuota, realizar este paso antes de usar.
    Nota: No use la misma solución bacteriana por más de 2 h.

3. experimental infección de M. marinum con inyección Intraperitoneal

  1. Pipeta una gota de 5 μl de la solución bacteriana diluida en un pedazo de la película de parafilm y tire de la gota en una aguja de insulina 30 G.
  2. 5 – 8 meses de uso-viejo tipo salvaje y peces mutantes rag1−/−hu1999 para el experimento. Anestesiar el pez cebra adulto en el agua del tanque con éster de etilo ácido 3-aminobenzoico de 0.02% (pH 7.0). Coloque el lado ventral del pez hacia arriba en una ranura en un plástico celular húmedo.
    Nota: Rag-/- peces mutantes no son capaces de pasar por la recombinación somática y producir las células T y B funcionales.
  3. Inyectar la aguja entre las aletas pélvicas en un ángulo aproximado de 45°. Mantener la apertura de la aguja hacia arriba para observar que la apertura es dentro de la cavidad abdominal. Inyecte lentamente la suspensión bacteriana y retire con cuidado la aguja.
    Nota: en caso de que el indicador rojo está escapando de los peces a inyección, excluir los pescados del experimento.
  4. Inmediatamente después de la inyección, transferencia de los peces en un tanque de recuperación con agua dulce del tanque.
  5. Tomar muestras de la suspensión bacteriana en 7H 10 placas cada 15 min del alícuota en uso bacteriano e incubar las bacterias a 29 ° C durante 5 días y verificar la dosis de la infección por recuento de las colonias en las placas.
  6. Compruebe con regularidad el bienestar de los peces y eutanasia cualquier pez con síntomas de la infección con más de 0.02% concentración de éster de etilo ácido 3-aminobenzoico (pH 7.0).
    Nota: Aproximadamente, el 7% del pez cebra adulto infectado con 34 ± 15 UFC y 30% de pez cebra infectados con 2029 ± 709 UFC han tenido síntomas por semanas 819. Los síntomas pueden incluir natación anormal, falta de respuesta al tacto, jadeo, edema o pérdida observable.
  7. Mantener el pez cebra según las normas comunes35.

4. colección de órganos internos

  1. Eutanasia el pez cebra con una sobredosis de éster de etilo ácido 3-aminobenzoico (más 0,02% concentración, pH 7.0) en el agua del tanque.
  2. Inserte un perno posterior a los radios branquiostegos y otro por la cola a los peces en la plataforma de la tachuela.
  3. Abrir la cavidad abdominal entero con un bisturí y recoger los órganos internos mediante el uso de una cuchara pequeña y pinzas puntiagudas. Empiece desde el corazón y a lo largo de la columna vertebral hacia la cola para separar todos los órganos internos en un solo bloque.
    Nota: Asegúrese de recoger todo el tejido renal por raspado a lo largo de la columna vertebral con la cuchara.
  4. Por último, utilice unas pinzas para separar el intestino al lado de la cloaca y transferir los órganos en un tubo de 1,5 mL homogeneización con seis granos de cerámica mm 2,8. Colocar inmediatamente en hielo seco para congelar la muestra. La muestra puede almacenarse a-80 ° C hasta homogeneizada.
  5. Enjuague el instrumental con etanol al 70% entre los individuos.

5. homogeneización y RNA la extracción de un bloque de órgano.

Nota: El método es modificado de la Universidad de Stanford protocolos36.

  1. Añadir solución de tiocianato-fenol de guanidina utilizada para la extracción de ácidos nucleicos (Tabla de materiales) en la parte superior de la muestra hasta un volumen total de 1.500 μl. asegurar que la muestra cubre un máximo de 10% del volumen total.
    PRECAUCIÓN: El volumen esperado de tejido recolectado es 100 μl. guanidina tiocianato-fenol solución contiene tóxico e irritante compuestos requiere ropa protectora, guantes de nitrilo y trabajar en una campana de humos. No combinar con lejía ya que esto causará la formación de gases tóxicos. Lea la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) antes de uso.
  2. Homogeneizar las muestras usando un homogeneizador de talón-golpes 3 veces 40 s a 3.200 rpm. Enfriar en hielo por 30 s entre los ciclos. Someter a ultrasonidos las muestras homogeneizadas en un baño de agua durante 9 minutos.
  3. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y mover 1.000 μl de homogenado despejado en un tubo de microcentrífuga fresco.
  4. Añadir 200 μL de cloroformo, mezclar inmediatamente con un vórtex durante 15 s e incúbelos durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El cloroformo es un tóxico y compuesto irritante si se inhala, ingiere o contacto con la piel o los ojos. Use equipo de seguridad necesario para la protección personal y trabajar en una campana de humos. Lea la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) antes de uso.
  5. Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C para separar las fases acuosas y orgánicas.
  6. Cuidadosamente, transferir 500 μl de la fase superior a un tubo nuevo para evitar contaminar el ARN. Quitar y desechar el resto de la fase acuosa (~ 100 μL) y la interfase y la fase orgánica a 4 ° C para la extracción de ADN.
    Nota: La fase superior contiene el ARN.
  7. Añadir 500 μl de 2-propanol y mezcle inmediatamente con un vórtex durante 15 s. Incubar 10 min a temperatura ambiente precipitar el ARN.
  8. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C para el RNA de la pelotilla. Quite el sobrenadante mediante pipeteo.
  9. Añadir 1 mL de etanol al 75% y de vortex por 10 s.
    Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y las muestras toda la noche guardado a 4 ° C.
  10. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante mediante pipeteo.
  11. Repita los pasos de lavado 5.9, 5.10. Retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo y dejar el sedimento seque al aire en una campana de humos.
  12. Disolver el pellet de RNA en 500 μl de agua libre de nucleasas y mantener las muestras en hielo. Medir las concentraciones con un espectrofotómetro de microvolume o equipos equivalentes. Guardar el ARN a-80 ° C.

6. purificación del pez cebra Co extraído y ADN micobacteriano

  1. Preparar un buffer de extracción de la parte posterior (BEB) disolviendo 118,2 g de tiocianato de guanidina (concentración final 4 M), 3,68 g de citrato de sodio (concentración final 50 mM) y 30,29 g de Tris base libre (concentración final 1 M) en 120 mL de agua libre de nucleasas (este mes de mayo requieren agitación durante la noche). Añadir agua libre de nucleasas hasta un volumen total final de 250 mL y filtro para esterilizar la solución.
    Nota: Esta memoria intermedia puede almacenarse a temperatura ambiente hasta 6 meses. No combine BEB con lejía como reaccionan para producir gases tóxicos como el cloruro de hidrógeno y cianuro de hidrógeno.
  2. Usar la interfase y la fase orgánica de la muestra para extraer ADN micobacteriano. Añadir 500 μL de BEB a cada tubo. Mezcla extensivamente durante 10 minutos por inversión a temperatura ambiente.
  3. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 30 min a temperatura ambiente y cuidadosamente transferir 500 μl de la fase acuosa superior que contiene el ADN a un tubo nuevo.
  4. Añadir 400 μL de 2-propanol. Mezclar por inversión e incubar 10 min a temperatura ambiente.
  5. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Un pellet que contiene el ADN debe ser visible en este momento. Retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo.
  6. Añadir 800 μL de etanol al 70%. Lavar el precipitado por inversión. No no agitar con vortex las muestras en este punto, como ADN genómico se descompone fácilmente.
  7. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante por pipeteo. Repita el lavado etanol (pasos 6.6 y 6.7).
  8. Eliminar el etanol por Pipetear cuidadosamente. Dejar que las muestras secar por 5 – 10 min disolver el pellet en 200 μL de agua libre de nucleasa.
  9. Medir las concentraciones de ADN con un espectrofotómetro de microvolume o equipos equivalentes. ADN puede almacenarse a 4 ° C o a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.

7. cuantitativo PCR para medir cargas de micobacterias

  1. Preparar mezclas de reacción de qPCR con no-ROX (carboxi-X-rodamina) contra el espaciador transcrito interno M. marinum (ITS) entre ITS 16S-23S según las instrucciones del fabricante con las cartillas de MMITS1 (tabla 1). Pipetear la mezcla de reacción y las diluciones de la muestra como duplicados en una placa de 96 pocillos adecuada para qPCR. Incluyen una serie de diluciones estándar de ADN de una cantidad conocida de bacterias en cada serie.
    Nota: La esperada carga de M. marinum por peces puede variar de 0 UFC a 1.000.000 UFC en wpi 4. El análisis de qPCR puede realizarse también con otros kits para qPCR pero la temperatura de recocido de los cebadores ha de ser volver a optimizado.
  2. Selle la placa con una película ópticamente transparente y centrifugar la placa a 2.000 x g durante 2 min a 4 ° C.
  3. Ejecute el programa de qPCR que se muestra en la tabla 2.
  4. Usando la curva estándar, calcular el número de bacterias en la muestra de pescado entero.

8. DNasa tratamiento de las muestras de RNA

  1. Para eliminar cualquier posible resto de ADN genómico del RNA, realizar DNasa I tratamiento. Descongelar las muestras de RNA en el hielo.
    Nota: Asegúrese de utilizar sólo soluciones y equipo libre de RNasa y limpie la superficie de trabajo y pipetas con un reactivo de descontaminación eliminar RNasas (Tabla de materiales) antes de comenzar a trabajar. Usar una bata de laboratorio manga larga y guantes para proteger sus muestras.
  2. Preparar 10 μL DNasa I mezclas de reacción sobre hielo según las instrucciones del fabricante. Mezclar 1 μL de DNasa I, 1 μL de 10 x buffer de DNasa y 8 μL de ARN de la muestra incluyendo un máximo de 1 μg de RNA.
  3. Suavemente mezcle las reacciones (no Vortex) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  4. Antes de la inactivación de calor, añadir 1 μl de EDTA 50 mM a cada 10 μl de muestra. Si no se agrega EDTA, el RNA se someterá a degradación química cuando se calienta.
  5. Incubar 10 min a 65 ° C-Inactive por calor DNasa I. seguir directamente a la síntesis de cDNA o almacenar el ARN tratados con DNasa a-80 ° C.

9. síntesis de cDNA

  1. Mantenga todos los reactivos y las muestras en hielo y preparar las mezclas de reacción según las instrucciones del fabricante. Incluyen una mezcla de reacción de 5 μL, 1 μL de mezcla de maestra de transcripción reversa, 3 μL de agua libre de nucleasas y 1 μL de DNasa trataron RNA.
  2. Mezclar suavemente las reacciones de transcripción inversa y brevemente girar el tubo, si es necesario.
  3. Colocar las muestras en una máquina PCR y usar el programa que se muestra en la tabla 3.
  4. Diluir el cDNA en agua libre de nucleasa para qPCR a una concentración máxima de 2.5 ng/μL, si es necesario. cDNA puede ser almacenado a-20 ° C.

10. expresión del gen de pez cebra por PCR cuantitativo de medición

  1. Preparar una mezcla maestra de qPCR sobre hielo según las instrucciones del fabricante y proteger de la luz. Utilizar los iniciadores introducidos en la tabla 1.
    Nota: Para calcular el doble de la inducción para cada gen, medir la expresión también de una muestra de referencia agrupados extraída de pez cebra saludable 6.
  2. Preparan réplicas de cada muestra y pipetear las mezclas de reacción en un plato de qPCR. Selle la placa con una película ópticamente transparente y centrifugar la placa a 2.000 x g durante 2 min a 4 ° C antes de comenzar la carrera.
  3. Ejecutar la qPCR programa que se muestra en la tabla 4 con la temperatura de recocido según el par de la cartilla utilizada (tabla 1).
  4. Analizar la relación de la expresión de gene en comparación con un gen de mantenimiento de la casa (loopern437) con el método de ΔCt usando la ecuación:
    Equation

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Representative Results

El patógeno natural de pescado marinum de la micobacteria infecta los órganos internos del pez cebra y produce una infección sistémica con granulomas histológicamente visible19. Pez cebra adulto están infectadas con M. marinum por inyección intraperitoneal. Se extracción el ADN y el ARN, y la carga por micobacterias se mide por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) usando la DNA como plantilla. El esquema del método se muestra en la figura 1.

El número inicial de micobacterias utilizado para infectar a los peces es un determinante crítico para el resultado de la infección. Una dosis alta de infección de M. marinum (~ 2.000 UFC) conduce a una enfermedad progresiva en la que las micobacterias cargas continúan aumentando hasta que la carga bacteriana promedio alcanza unos 5 millones de bacterias (figura 2A) en última instancia, matar a los peces. Una dosis baja (~ 20 – 90 UFC) de M. marinum conduce al desarrollo de un espectro de enfermedad similar al que se observa en la tuberculosis humana (figura 2B). La carga bacteriana continúa aumentando hasta alrededor de 4 – 7 semanas (figura 2A y Figura 3A), después de que en la mayoría de los peces la enfermedad alcanza un estado estacionario. Figura 2B se muestra un ejemplo de la distribución de los resultados de la enfermedad con una infección de dosis baja: aproximadamente el 7% del pez cebra infectado fueron incapaces de limitar el crecimiento bacteriano. Estos individuos desarrollaron una enfermedad progresiva primaria y murieron dentro de dos meses después de la infección. Alrededor 10% de los individuos despejó la infección por micobacterias por 4 semanas. El restante 65% de la población de peces desarrolló una infección por micobacterias latente con constante carga bacteriana. Sin embargo, entre 8 y 32 semanas de la infección, en 18%, la infección latente había reactivada espontáneamente hacia la progresión de la enfermedad.

Mediante el uso de rag-/- pez mutante, es posible estudiar la función de adaptación las respuestas inmunológicas en peces adultos. Rag-/- pez mutante suficientemente no puede limitar el crecimiento de las micobacterias a mayores cargas bacterianas (Figura 3A) y aumento de la morbilidad (figura 3B), demostrando claramente la importancia de la inmunidad adaptativa en control de infecciones por micobacterias. También, se puede estudiar la importancia de las respuestas de adaptación en la evocación de ciertas respuestas del cytokine en infección por micobacterias en este modelo. Aquí, mostramos que la respuesta adaptativa se requiere para la inducción eficiente de Interleucina 4 (IL4) (figura 3), pero es prescindible para la inducción de interferón-γ (IFNγ) en 4 wpi (figura 3D). Interferón-γ es una citocina conducir la respuesta contra patógenos intracelulares mientras que interleukin 4 es un mediador común en la respuesta inmune adaptativa contra patógenos extracelulares. Los niveles de expresión significativamente mayores de il4 en el grupo de tipo salvaje comparado rag-/- pez mutante se refiere a la respuesta humoral adaptativa importante en la infección por micobacterias (figura 3).

Figure 1
Figura 1: flujo de trabajo de estudiar el desarrollo de cargas de micobacterias en el pez cebra adulto. Pez cebra adulto están infectados por una inyección intraperitoneal de M. marinum. ADN y ARN se extraen los órganos internos del pez y se analiza la carga de M. marinum y las respuestas inmunitarias del huésped con reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Inyección de M. marinum en pez cebra adulto causa un espectro de Estados de enfermedad. Pez cebra (A) fueron inyectados con una baja (34 15 UFC) o una dosis alta (2029 ±709 UFC) de M. marinum. Promedio de cargas para 5 peces (excepto dosis altas de 32 semanas, n = 2) se muestran con las estadísticas de bajas dosis de SD.: * p < 0.05 en comparación con la semana 1, ** p < 0.05 en comparación con 1 y 2 semanas. Estadísticas de altas dosis: *** p < 0.05 en comparación con 1, wk. 2, 8, 11 y 20 ¤ dosis bajas versus altas dosis p < 0.05. Modificado de Parikka et al. 201219. (B) distribución típica de los resultados de la enfermedad dentro de una población de pez cebra salvaje infectado con una dosis baja de M. marinum. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: inmunidad adaptativa afecta el curso de la infección por micobacterias en el pez cebra adulto. Adulto tipo salvaje (wt) y rag1 (−/−) pez cebra fueron infectados con una dosis baja (n = 30) de M. marinum. (A) la media micobacterias cargas fueron medidas por qPCR en 2, 4 y 7 semanas post infección (IPM) (n = 10) * P < 0.05. (B) los peces fueron sacrificados en el desarrollo de los síntomas de la enfermedad y parcelas de supervivencia fueron creados. (C). se midieron los niveles de expresión de il4 en wpi 4. (D) la expresión niveles de IFNγ fueron medidos en el wpi 4. (A y B) modificaron de Parikka et al 201219. (C y D) Modificado de Hammarén et al 201438. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gene Secuencia de primer Temperatura de recocido
MMITS1 F: CACCACGAGAAACACTCCAA 65
16 – 23SITS Locus AB548718 para la cuantificación de M. marinum R: ACATCCCGAAACCAACAGAG
loopern4 F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT 61
Expresa elementos repetitivos R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG
IL4 GCAGGAATGGCTTTGAAGGG 59.5
ZDB-GENE-100204-1 GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT
ifnγ1-2 F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, 61
ZDB-GENE-040629-1 R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT

Tabla 1: secuencias de la cartilla y recocido temperatura. Las secuencias de los cebadores utilizados y sus temperaturas de recocido optimizados. Los cebadores para la transcripción de M. marinum 16S-23S rRNA han sido optimizados para un kit qPCR de ROX No y los otros iniciadores para una ROX incluyendo kit qPCR.

Paso hora Temperatura
1 3 min 95 ° C
2 5 s 95 ° C
3 10 s 65 ° C
4 5 s 72 ° C (detección de fluorescencia)
5 Vaya al paso 2. 39 veces
6 Análisis de la curva 55-95° C de fusión con intervalos de 0,5 ° C
7 Para siempre 4 ° C

Tabla 2: programa de qPCR para la medición de M. marinum ADN. Un protocolo de qPCR diseñado de acuerdo a las instrucciones del fabricante y optimizada para la medición de M. marinum del ADN de las muestras de pez cebra.

hora Temperatura
5 min 25 ° C
30 min 42 ° C
5 min 85 ° C
para siempre 4 ° C

Tabla 3: programa de síntesis de cDNA. Protocolo para la síntesis de ADNc a partir del RNA extraído de un pez cebra infectado según las instrucciones del fabricante.

Paso hora Temperatura
1 30 s 95 ° C
2 12 s 95 ° C
3 30 s Recocido ° C
4 Vaya al paso 2. para 39 veces
5 Análisis de la curva 65 – 95 ° C de fusión con intervalos de 0,5 ° C
6 Para siempre 4 ° C

Tabla 4: programa de qPCR para medir la expresión de genes del anfitrión. Un protocolo de qPCR diseñado de acuerdo a las instrucciones del fabricante y optimizada para la medición de la expresión de genes diferentes de pez cebra.

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Discussion

Aquí describimos una aplicación basada en qPCR para medir cargas micobacterias de ADN extraído de los tejidos del pez cebra adulto infectados experimentalmente. Esta aplicación se basa en cartillas diseñadas alrededor de la 16S-23S rRNA espaciador transcrito interno secuencia40. La carga total de micobacterias en una muestra de pescado se calcula usando una curva estándar, preparada a partir de ADN extraído de un número conocido de micobacterias cultivadas y suponiendo que una bacteria tiene una copia de su genoma en un momento dado. El límite de detección de la qPCR de M. marinum -es de aproximadamente 100 unidades18formadoras. Una clara ventaja del método comparado con el forro tradicional es que se pueden detectar bacterias latentes activas y no se dividen. Además, un problema común de contaminante crecimiento en placas de cultivo de tejidos de pez cebra es burlado por este enfoque. Sin embargo, como se utiliza DNA como plantilla, es posible que algunos de los ejemplares medidos se pueden derivar el ADN de las bacterias que han muerto muy recientemente. Una importante ventaja del protocolo basado en el ácido nucleico es que como ambos DNA y RNA (así como las proteínas, no se describe aquí) se pueden extraer de la misma persona, la carga micobacteriana del individuo puede combinarse con datos de expresión genética de ambos la huésped y las bacterias.

La dosificación de M. marinum es un determinante crítico de los resultados de la infección. La baja marinum del M. (~ 20 – 90 UFC) dosis de la infección produce un espectro de Estados de enfermedad con latencia como la forma más común. Si la dosis de infección es del orden de miles, una enfermedad más progresiva se desarrolla en la mayoría de los individuos. Como la dosis infecciosa natural es conocida por ser baja en tuberculosis humana41, usando una dosis baja de M. marinum en el modelo de pez cebra es probable producir una infección más natural. Para llegar a la dosis correcta, asegúrese de validar a la relación entre las unidades formadoras de colonias antes de iniciar cualquier experimentos y OD600. La variación normal de las dosis de infección plateado es aproximadamente el 30% y no se considera un problema. Sin embargo, es importante verificar que el volumen entero 5 μl de la suspensión bacteriana permanece dentro de los peces. Filtración de la solución de la inyección hará variación adicional de la dosis de infección. Además de la dosis de infección, la cepa de la bacteria puede afectar a la progresión de la enfermedad. Ha sido demostrado que la virulencia de la diferentes M. marinum pueden alterar las cepas entre las cepas. Las dos cepas más utilizadas son ATCC927 (cepa aislada utilizada en estos experimentos los pescados) y la cepa M. Sin embargo, estas cepas difieren grandemente en su virulencia. La cepa aislada de humanos de M desarrolla una enfermedad más progresiva que la cepa aislada de pescado produce una enfermedad más leve bien adecuado para el estudio de la forma latente de la infección por micobacterias33. La virulencia de las bacterias dentro de una cepa también puede alterar si la bacteria es en serie transferido de una cultura a otra, que puede prevenirse tomando frescas micobacterias de un congelador común lo suficientemente a menudo.

In vitro de cultivo de lentamente dividir M. marinum sin antibióticos es propenso a contaminaciones. Por lo tanto, el manejo de las bacterias requiere estricto enfoque aséptico llevó a cabo en una campana de flujo laminar. Posible contaminación de la cultura puede ser detectada como valor demasiado alto un OD600 , extraño aspecto suspensión bacteriana o colonias. Colonias de M. marinum son normalmente con bordes borrosos, plana y mate blanco en color. Culturas de M. marinum son sensibles a la luz y comienzan a producir un pigmento amarillo cuando se expone a la luz. Este pigmento amarillo se puede utilizar para distinguir las colonias de M. marinum de otras bacterias después de las infecciones. Contaminantes pueden causar el pez morir pronto después de la infección. Generalmente, los primeros síntomas de una infección de baja dosis no aparecen antes de 3 semanas post infección y cualquier mortalidad antes de este momento es probable que debido a la contaminación de la suspensión bacteriana o trauma inducido durante la inyección.

Pez cebra adulto son muy sensible a éster de etilo ácido 3-aminobenzoico y no sobreviven si el tiempo de exposición es demasiado largo o es demasiado alta la concentración del anestésico. Por lo tanto, al infectar, el pez cebra se debe exponer a la anestesia para el mínimo de tiempo para lograr buena anestesia (~ 1-2 min). Después de la infección, el pez cebra adulto se mantienen en grupos con agua a temperatura de entre 26 y 28 ° C. Si la temperatura es superior o inferior de este, puede afectar la tasa de crecimiento de M. marinum y cinética de la infección. Además, la calidad de agua del tanque (calidad microbiológica, concentración de sales, pH, saturación de oxígeno) es una parte importante garantizar un exitoso experimento. Vigilancia de la salud de los peces debe llevarse a cabo diariamente y peces que muestran síntomas de infección deben retirarse del grupo y eutanasia. Si los peces mueren en el tanque, los otros peces pueden ser volver a infectado a través del intestino, que afecta a la progresión de la infección.

El modelo larvas de pez cebra utilizados de tuberculosis es aplicable al estudio de inmunidad innata, que dirige los experimentos a un subconjunto limitado de las interacciones huésped-microbio. El uso del pez cebra adulto hace posible estudiar la respuesta inmune innata y adaptativa en un versátil modelo18,32,39. Pez cebra adulto se presenta como un modelo vertebrado conveniente para estudiar todo el espectro de la tuberculosis. Con una exposición de dosis bajas de M. marinum, 7% de la población de peces desarrollan enfermedad progresiva primaria, 10% son capaces de esterilizar la infección, 65% desarrollan la enfermedad latente y en 18% reactivación espontánea produce (figura 2). El espectro de la enfermedad parece que visto en la tuberculosis humana, en la que la gran mayoría desarrolla una enfermedad latente, aproximadamente de 4 – 14% producen infección primaria activa dentro de los primeros cinco años después de la infección42, 10-20% de muy personas expuestas parecen ser capaces de esterilizar la infección43 y44a activar 5 – 10% de las infecciones latentes. Diferencias en la genética de los anfitriones afecta la susceptibilidad a la tuberculosis y la progresión de la enfermedad45. Esto también se observa en la población de pez cebra que es genéticamente muy heterogénea a diferencia de muchos otros laboratorio animales46,47. La variación genética natural, es un modelo altamente aplicable en la búsqueda de una óptima respuesta inmune en esta enfermedad multifactorial.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido apoyado por el finlandés Cultural Foundation (H.L.), Tampere Tuberculosis Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Fundación de la Asociación contra la Tuberculosis finlandesa (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid frescos Juselius Fundación (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane y Aatos Erkko Fundación (M.P.) y Academia de Finlandia (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo y Jenna Ilomäki son reconocidos por su asistencia técnica. Los autores reconocen el laboratorio de pez cebra de Tampere para su servicio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27 G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 mL syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30 G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 mL homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

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